Name: light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins
Uploaded: 2019-10-11T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

这项工作得到了BBSRC、EPSRC、MRC和井康信托的支持。C.B. 实验室是曼彻斯特大学韦康细胞基质研究信托中心的一部分，该中心由韦康信托基金提供核心资助（赠款号088785/Z/09/Z）。作者希望感谢生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）向C.M.、K.J.（BB/M02020630/1）和P.A.（BB/P000681/1）以及工程和物理科学研究理事会（EPSRC）和医学部提供的资金。研究理事会（MRC）再生医学博士培训中心（EP/L014904/1）。作者感谢阿尔韦勒的信件和他们的售后支持团队。作者感谢来自曼彻斯特大学生物成像设施的彼得·马奇和罗杰·梅多斯在显微镜方面的帮助。这项研究中使用的生物成像设施显微镜是利用BBSRC、威尔康信托和曼彻斯特大学战略基金的赠款购买的。

作者没有什么可透露的。

LIMAP （PRIMO） 微图案优势与微接触打印的比较 虽然微接触打印可能是生物领域最常用的微图案技术39，但使用LIMAP技术的研究人员似乎越来越多，40，41，42 ，43，44.在这里，我们提出了使用PRIMO的协议，一个商用LIMAP系统。下面我们将简要讨论微接触打印和 LIMAP 照片图案的潜在优势和局限性。
微接触印刷需要通过旋转在玻璃或硅晶圆上涂上光掩膜（通常 SU-8）产生的石版画母版，然后用激光蚀刻所需的微特征。这些母版用作模板，以创建 PDMS 图章45。邮票用一种选定的蛋白质孵育，这种蛋白质吸附到它身上，然后被转移到细胞培养皿上（加盖）。蛋白质吸附到PDMS印记的过程取决于蛋白质的浓度、缓冲和孵育时间。这些参数需要事先测试，以获得最佳结果46。
如果保存得当，大师可用于大量的实验，持续数月甚至数年。然而，该技术的一个限制因素是，必须重新设计新的石版画母版，以便进行每一个所需的修改。实验设计的变化可能导致耗时地生产新主机（最多数周），从而推迟实验。相比之下，LIMAP 照片图案不需要物理母版;它使用软件生成的模式模板，可用于灵活地调整所需的微模式几何形状以适应不断变化的研究问题。LIMAP也可用于在同一微模式内生成蛋白质梯度（图8），使用微接触打印47，很难以可重复的方式获得。
此外，在我们的例子中，使用LIMAP实现的微模式分辨率为2μm（图6B）。
接近此分辨率增加了模式内和模式间的可变性。生成大约 10 μm 宽度或以上图案的可重复性很强（图 6G，H）。相反，使用微接触打印很难始终获得低于 10 μm 的分辨率，并且在冲压小特征时查找人工制品（未显示数据）是很常见的。
我们已经表明，LIMAP可用于在同一微井内微模式多蛋白（图9），从而在实验中增加进一步的复杂性。虽然这可以通过微接触打印来实现，但在技术上，以高精度对齐不同的蛋白质可能相当苛刻。虽然使用LIMAP对多种蛋白质的图案似乎很直接，但必须指出，通过顺序涂层程序对蛋白质的交叉结合可以通过阻断试剂来减少，但不能完全消除（图9）。
关于一种或另一种技术的成本，此处描述的 LIMAP 需要购买微型图案设备 （PRIMO），这些设备可以安装在不同的荧光显微镜上，并且需要电动化级。尽管这项投资最初是成本密集型的，但从长期来看，除了消耗品（模具、PEG 和 PLPP）之外，没有其他购买。或者，PDMS模具也可以由自己的实验者按照公布的协议18，32在实验室中产生。微接触印刷的最大成本可能与新母版的生产有关，如果实验需要新的模式，这种成本可能会很大。
LIMAP 的一个缺点是此技术的吞吐量相对较低。与 LIMAP 所需的顺序激光微图案相比，微接触打印可以同时冲压步骤快速高效地生成大量微模式。例如，使用 PDMS 邮票（不包括邮票准备）进行微接触式打印，在大约 2 小时内可生产 6 个冲压玻璃盖玻片;使用 LIMAP 对类似区域（6 口盘）进行模式大约需要 4 小时，不包括表面钝化过程（考虑步骤 5.12 中描述的模式模板配置，参见图 5B）。
LIMAP 技术的另一个速率限制因子是大面积阵列所需的长时间照明（使用 7.5 mW/mm2激光，每个设计单元 30 s）。在这些情况下，微接触打印可能是首选选项。新推出的光电启动器（PLPP凝胶，材料表）应大大减少图案的拍摄时间，只需几分钟即可在大面积（高达 8 mm2）生成数百个微模式。
细胞培养的微模式表面时需要考虑的另一个重要因素是，与微接触打印获得的可变性相比，不同实验重复的微模式的可重复性。例如，图 7B，D所示的图形是三个独立实验重复的代表性数据，结果非常相似（未显示数据）。根据我们的经验和以前的出版物，这种可重复性水平是很难达到与微接触印刷48，49，50，51，52。
与其他需要专用化学来设计感光材料或使用感光剂（通常不太具有生物相容性3）的照相模式技术不同，LIMAP 的感光成分（PLPP）） 是生物相容性和耐受性良好的细胞21;在我们的手中，我们并没有经历任何细胞毒性跨越各种细胞，包括CAD，DRG神经元（图10），成纤维细胞，上皮细胞和黑色素瘤细胞（数据未显示）。与其他照片图案技术相比，使用 PRIMO 的 LIMAP 的另一个优点是不需要照片蒙版。与微接触式打印类似，需要为每个所需图案设计和生成新的光掩膜。
上述微接触打印的所有限制，请参阅该技术的手动方法。然而，可以使用带有邮票负载和压力控制的自动化设备53来提高微接触打印的吞吐量和可重复性。
使用 PRIMO 为 LIMAP 解决协议的关键步骤和问题解决 在该协议期间发现的最常见问题之一是微模式内具有高水平的背景荧光。这可能是由于微井干燥，这通常由于体积小。发生这种情况时，PBS 晶体经常出现在 ECM 模式周围（图 11A）。
蛋白质孵育后洗涤步骤不足或效率低下也会导致高水平的背景荧光。特别是在使用10μg/mL（图11B）或更高的蛋白质浓度时，可以观察到这一点。通过添加 PBS 附加洗涤步骤，可以减少背景中蛋白质的过量。
需要在每个实验中测量和描述蛋白质背景的存在，计算背景荧光强度（图6E），并从微模式强度中减去它（图6F-H）和图 7B，D。高蛋白背景可能对CAD细胞的附着和发芽产生影响，影响对结果的解释。
当用户的经验有限时（图11B），由于模式之间重叠不足而出现，设计单元之间存在间隙是一个常见的问题。莱昂纳多软件中的两个参数可以进行调整来克服这一点：1） 可能需要列之间的负间距，具体取决于模式的设计（步骤 5.7，参见图 5B，C）。或者，2） 使用专家菜单中的渐变选项缝合列。使用 UV 粘合剂 （材料表） 进行快速测试以确定最佳间距参数。一小滴这种胶粘剂被涂在玻璃滑梯上，然后用玻璃盖玻片覆盖，制作薄膜。嵌入式 UV 胶粘剂采用低激光剂量（30 mJ/mm2）与感兴趣的图案模板进行光型图案。嵌入胶粘剂的紫外线照射区域将被固化，在明场显微镜下变得可见。测试结果被可视化，以评估模式内获得的间距。在我们的神经元实验中，条纹之间的间隙可能会对细胞行为产生不利影响，产生生长动力学的变化（速度降低或放弃路径）。
在莱昂纳多软件的最新更新（在出版时，Leonardo 4.11），可以上传以前设计的更大图案模板，覆盖更大的面积（使用20X目标高达8毫米2）的微井表面与目前每个设计单元0.1 mm2相比，无需将较小的设计单元拼接在一起。在阵列生成过程中缺乏激光对焦调整可能导致未定义的边（图11C）。因此，在阵列之前校准激光并执行参考模式步骤（参见步骤 4）至关重要。定义不当的条带会导致条带宽度的变化，使得斧子生长动力学和条带宽度之间的相关性变得困难。Axons 也倾向于放弃具有扩散边缘的条纹。此外，在打印宽度为 10-20 μm 或更高的条纹时，也可以看到边缘的可变性，从而导致边缘的蛋白质含量高于图案的中心区域（图 6B，D）。这种边缘效应是由光图案化过程中光源器的非均匀扩散产生的。光化反应是氧依赖的，在边缘扩散更多。在光图案化过程中，这种边缘效应可以在微井中用移液器将光发生器与质均最小化。此外，新型商业化光启动器（PLPP凝胶）还可以降低边缘效应（PRIMO系统支持团队，个人沟通）。
对多个蛋白质进行微印会导致交叉结合（图9A-D）。这可以通过提高用于在两种不同蛋白质的孵育步骤之间占据非特异性结合位点的阻塞效率来最小化。蛋白质的交叉结合会干扰实验结果的可重复性，并可能导致数据误读，因为很难确定每种蛋白质对斧头生长动力学和其他细胞行为的贡献。
结论 我们希望使用LIMAP提供的协议通过使用PRIMO系统促进蛋白质微模式的生成。虽然我们的协议侧重于如何在二维玻璃表面可靠地生产微图案，但其他人已经表明，可以使用LIMAP对软基板54进行微图案，为3D培养物使用微结构表面42。这些微模式可以是一个多功能的工具，研究细胞对微环境变化的反应。

近年来，生物科学越来越多地利用材料科学提供的进步。一个突出的例子是基质的微模式，可用于研究细胞反应，如细胞增殖1,2分化3,4,5,6，细胞迁移7,8,9和路径查找10,11.有许多技术可用于基板的微模式化，例如多光子激发光化学12，AFM 浸笔纳米光刻13，针脚和喷墨直接打印14，电子束光刻15或微流体16.然而，在生物领域广泛使用的两种技术是微接触印刷17,18,19或激光辅助图案3(图 1).与微接触打印相比，激光辅助模式在蛋白质和PEG稳定性以及细胞约束方面提供了更可靠的结果20.这里描述的一种更新颖的微模式处理方法是使用光诱导分子吸附蛋白21（利马普，图 1D） 使用市售系统（PRIMO，材料表).每种方法都有优点和限制，下面将对此进行简要介绍。微接触打印使用 PDMS 模具（图章），具有从石版画母版生成的所需微特征。邮票用选定的蛋白质孵育，然后转移到细胞培养基板上（加盖）18(图 1A).激光辅助图案使用紫外光来薄膜22,23,24,25，暴露随后可以涂上感兴趣的蛋白质的区域（图 1B).虽然使用照片图案方法实现的分辨率在微米范围内25,26，大多数这些技术都需要一个光掩膜，要么与样品接触，要么位于显微镜物体平面上23,27,28.在微接触打印和照片图案方面对蒙版的要求可能是一个限制;每个几何图案和尺寸都需要特定的蒙版，这可能既昂贵又耗时。与这些技术相比，LIMAP 不需要掩码 （图 1D).使用 PRIMO 系统进行 LIMAP 在开始时可能会耗费大量成本，因为它需要购买设备。然而，开源软件用于设计任何所需几何图形的模式，给予更多的自由度，并允许更复杂的实验，包括使用蛋白质浓度梯度。PRIMO 激光由数字控制的微镜设备 （DMD） 控制和引导，以创建任意数量的用户定义的几何形状。LIMAP 要求培养表面涂有防止细胞附着的分子。聚乙烯乙二醇（PEG）最常用作这种"防污"试剂;在玻璃或塑料表面形成致密的防粘膜29.随后，添加了一个照片创建器，允许通过照片拍摄机制高精度去除 PEG 胶片30在DMD的控制下局部暴露于紫外线下。这些无PEG区域可以涂上蛋白质，吸附到激光蚀刻表面，产生一个微模式。通过改变激光功率，可以从表面去除不同数量的PEG，使用户可以产生蛋白质梯度。PEG去除和涂布程序可以重复创建模式与两个或两个以上不同的蛋白质在同一微井21.生成的微模式为细胞提供粘合表面，允许研究细胞行为。在我们的研究中，我们使用微模式来研究神经元细胞系（CAD（Cathechominergic-一个分化）细胞的神经质或斧子路径发现31） 或原发性大鼠背原结条 （DRG） 神经元。在这里，我们概述了LIMAP的分步协议（图 2） 使用市售的 PRIMO 系统和随附的莱昂纳多软件。我们演示了如何使用它生成具有定义几何形状和多种蛋白质的图案，我们用它来研究斧道路径查找。我们讨论可能出现的常见问题以及如何避免这些问题。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 488 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20173</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>8100805</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conjugated fibrinogen-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti inverted</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-Image J</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov" target="_blank">www.imagej.nih.gov</a></td>
			<td>Version 2.0.0-rc-54/1.51f</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent highlighter</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>Stabilo Boss Original</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Working concentration: 1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkscape software</td>
			<td>Inkscape</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-red fluorescent rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>LMN01</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>version 4.11</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager software</td>
			<td>Open imaging</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized x/y stage</td>
			<td>PRIOR Scientific</td>
			<td>Proscan II</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Working concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Stencils</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>visit <a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>Laysan bio, Inc.</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Working concentration: 50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176752</td>
			<td>Working concentration: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>Classic PLPP</td>
			<td>Working concentration: 14.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP gel)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>Working concentration: 4.76% diluted in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS (also distributed by Alv&#233;ole)</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/ProductLookup.html?ProdNo=P4707&amp;Brand=SIGMA">P4707</a></td>
			<td>Working concentration: 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo equipment</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122">15140122</a></td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-alpha antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>DM1A</td>
			<td>Working concentration: 1:1000 
			CAD cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-beta 3 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td>Working concentration: 1:500 
			DRG neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>no phase ring (check updated catalogue)</td>
			<td>Working concentration: N.A. 
			**Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alv&#233;ole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins

细胞感知各种细胞外线索，包括细胞外基质的组成和几何，由细胞本身合成和重塑。在这里，我们介绍使用PRIMO系统作为模式技术使用单一或蛋白质组合生产微模式的细胞外基质（ECM）基质的蛋白质分子吸附方法。该方法可实现以微米分辨率打印 ECM 图案，具有优异的可重复性。我们提供分步协议，并演示如何应用它来研究神经元路径查找的过程。LIMAP 与现有的微打印方法相比，在便于图案化多个组件以及能够生成具有任何几何体或渐变的图案方面具有显著优势。该协议可以很容易地适应研究几乎任何化学成分对细胞命运和细胞行为的贡献。最后，我们讨论可能出现的常见问题以及如何避免这些问题。

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Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

我们的总体目标是了解细胞如何感知细胞外线索，导致定向的斧头生长。在这里，我们描述了光诱导分子吸附蛋白质的方法，用于生成细胞外基质成分的定义的微模式，以研究控制斧头生长和路径发现的特定事件。

使用 PRIMO 微模式系统对蛋白质的光诱导分子吸附，研究细胞对细胞外基质蛋白的反应

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

微模式是一个非常强大的工具，因为它允许研究细胞反应，以定义细胞在生物体中遇到的生化和生物物理信号。与其他方法相比，所述方法对于模式生成更为灵活。例如，它允许生产具有高可重复性多蛋白质的梯度和微模式。我们的小组不仅使用LIMAP研究神经元路径查找，还研究其他细胞对影响细胞增殖、分化和迁移的信号的反应。微模式用于回答细胞生物学中的基本问题。获得的知识可用于修改再生医学中的现有设备，例如，周围神经损伤后的神经修复。首先设计数字绘图软件的图案模板。选择长度为 1，824 像素和宽度为 1，140 像素的图像大小。设计模板，将模板另存为 8 位 TIFF 文件。在进行阵列之前，使用等离子清洁剂清洁和激活表面，使用 1，000 至 1，300 毫托雷和 29.6 瓦的功率，使用 1 到 5 分钟的功率。使用 20 毫米内井尺寸和 0.16 至 0.19 毫米的玻璃底盘。选择六井或单井菜，具体取决于测试的条件数。在无菌条件下切割 PDMS 模具，以确保它们适合内部玻璃底井。用无菌钳子拆下内部微井填充物，将模具粘在玻璃井上。在 PBS 中准备 0.1 毫克每毫升 PLL-PEG 溶液，并在每个微孔中添加 20 微升。然后，在室温下孵育一小时。孵育后，从每口井中去除15微升的PLL-PEG，用20微升PBS洗5次，不让它干燥。准备一个微井，通过从单个井中去除 18 微升 PBS 并添加 5 微升光启动器来创建参考模式，将 PBS 留在剩余的微井中。然后，使用荧光荧光笔标记空的内玻璃井。将目标放在目标上方，并调整目标焦点，直到 PRIMO 徽标和标语照顾您的细胞"处于焦点位置。然后，记录焦平面的 Z 位置。要创建参考模式，请使用通过摄像机传输的光使用光启动器可视化微井的边缘，然后从右侧菜单中选择 ROI 符号。选择 PRIMO 上传所需的模式模板，该模板将投影到 ROI 作为设计单元。导航到微井的外围区域，选择"锁定"，然后将焦点调整到校准的 Z 位置。然后，选择"播放"以开始对参考图案进行照片模式。用 20 微升 PBS 清洗参考图案微井三次，以去除光启动器。然后，加入20微升荧光标记的细胞外基质，或ECM蛋白溶液。在室温下孵育该盘10至20分钟，确保保护参考井免受光线影响。孵育后，去除18微升蛋白质溶液，用20微升PBS洗井三次。使用荧光显微镜可视化参考模式。通过摄像机路径调整阵列边缘的焦点，并根据最佳焦点记录 Z 位置。此位置将是用于后续阵列的最佳激光焦点。在无菌条件下，从所有微井中去除 18 微升 PBS。在每个井中添加五个光启动器的微升，通过上下移液实现均匀化。如果在同一微井中阵列多个蛋白质，请同时上传所有所需的模式模板集。然后，选择行数、列数和剂量数。将模板配置保存为软件中的文件。导航到生成参考图案的区域，并调整焦点以最佳 Z 位置。然后，选择"播放"以启动照片模式。随着照片模式完成，设计单元从红色变成蓝色。用 20 微升 PBS 洗三次，将光启动器从微井中去除。上次洗涤后，从每个微井中去除 18 微升 PBS，并加入 20 微升 ECM 蛋白溶液。在室温下孵育盘子20至30分钟，确保防止其光线。接下来，去除 ECM 蛋白溶液的 15 微升，并使用 20 微升 PBS 洗涤三次。为了防止交叉结合，在微孔中加入20微升的PLL-PEG（BSA），并在室温下在黑暗中孵育一小时。然后，取出15微升的阻尼剂，用20微升PBS洗涤所有微升三次。去除 18 微升 PBS，并将 5 微升光启动器添加到每个微井中，确保光启动器在微井的整个表面上是均匀的。导航到第一个微井，并加载以前保存的模板配置。然后，为第二轮照片模式选择要图案的操作，确保取消选择第一作。照相模式后，使用 PBS 清洗取出 PLPP。然后，用第二个ECM蛋白溶液孵育20分钟，用20微升PBS洗涤微井三次。使用荧光显微镜可视化和成像打印的图案。当准备板制细胞时，在内部玻璃井中加入一毫升的介质，确保覆盖所有微井。将培养皿放在37摄氏度和5%的二氧化碳孵化器中。为了确保生成的模式是模板的精确表示形式，沿条带和每个条带上方的相应背景区域获取荧光强度测量。可重复定义的微图案宽度为 20 至 2 微米，但打印特征为 20 微米或更宽时，可以观察到边缘效果。定义的蛋白质浓度是通过以不同浓度的蛋白质孵育获得的，或者通过改变用于切割抗紧膜的激光剂量获得。激光强度与模板的灰度水平成正比，产生紫外线照明的梯度。沿梯度条纹的荧光强度剖面测量在图案模板中和生成的梯度图案中是线性的。该协议可用于在同一微井中创建具有多种蛋白质的微图案，例如具有纤维素水平条纹的交叉图案和层压素的垂直条纹。但是，防止蛋白质交叉结合是必要的阻塞步骤。生成的交叉模式随后可用于神经元细胞系或CAD细胞或原发神经元、大鼠 DRG 的细胞测定。执行此协议时，需要记住的最重要的方面是进行正确的系统校准，不要让微井在多个洗涤步骤中干燥，并使用正确的参数进行蛋白质孵化和阻断。细胞行为分析通常涉及显微镜，如荧光、延时、AFM。进一步表征可以包括其他生化方法，如基因表达分析。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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使用方法比较物种调查父亲的反应神经生物学

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科研

神经科学

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