Micro-patroon is een zeer krachtig instrument, omdat het mogelijk maakt het bestuderen van cellulaire reacties om biochemische en biofysische signalen die cellen tegenkomen in levende organismen te definiëren. In tegenstelling tot andere methoden is de beschreven flexibeler voor patroongeneratie. Het maakt bijvoorbeeld de productie van gradiënten en micropatronen van meerdere eiwitten met een hoge reproduceerbaarheid mogelijk.
Onze groep gebruikt LIMAP niet alleen om neuronale pathfinding te bestuderen, maar ook hoe andere cellen reageren op signalen die invloed hebben op celproliferatie, differentiatie en migratie. Micro-patroon wordt gebruikt om fundamentele vragen in de celbiologie te beantwoorden. De opgedane kennis kan worden gebruikt om bestaande apparaten in de regeneratieve geneeskunde te wijzigen, bijvoorbeeld zenuwherstel na perifere zenuwletsel.
Begin met het ontwerpen van sjablonen voor patronen op digitale tekensoftware. Selecteer een afbeeldingsgrootte van 1, 824 pixels in lengte en 1, 140 pixels in de breedte. Ontwerp de sjabloon en sla de sjabloon op als een 8-bits TIFF-bestand.
Maak het oppervlak voor het ontstaan schoon en activeer het met een plasmareiniger met een procesdruk van 1.000 tot 1,300 millitor en een vermogen van 29,6 watt gedurende één tot vijf minuten. Gebruik een glazen bodem schotel met een 20-millimeter binnenste put grootte en glasdikte van 0,16 tot 0,19 millimeter. Selecteer een zes-put of een single-well schotel, afhankelijk van het aantal omstandigheden dat wordt getest.
Snijd PDMS stencils onder steriele omstandigheden om ervoor te zorgen dat ze passen in de binnenste glasbodem goed. Verwijder de binnenste microwell vullingen met steriele tangen, en plak de stencils op het glas goed. Bereid een 0,1-milligram per milliliter PLL-PEG-oplossing in PBS, en voeg 20 microliter aan elke microwell.
Vervolgens, incubeer de schotel op kamertemperatuur voor een uur. Verwijder na incubatie 15 microliter van de PLL-PEG uit elke put en was deze vijf keer met 20 microliters PBS zonder het te laten drogen. Bereid een microwell voor om een referentiepatroon te creëren door 18 microliter PBS uit één put te verwijderen en vijf microliters fotoinitiator toe te voegen, waardoor PBS in de resterende microwells achterblijft.
Gebruik vervolgens een fluorescerende highlighter om een lege binnenste glasput te markeren. Plaats de put boven de doelstelling en pas de objectieve focus aan totdat het PRIMO-logo en de slogan voor je cellen zorgen". Neem vervolgens de Z-positie van het brandpuntsvlak op.
Als u een referentiepatroon wilt maken, visualiseert u de rand van de microwell met de fotoinitiator met behulp van het uitgezonden licht door de camera en kiest u het ROI-symbool in het rechtermenu. Selecteer PRIMO om de gewenste patroonsjabloon te uploaden, die wordt geprojecteerd op de ROI als een ontwerpeenheid. Navigeer naar een randgebied van de microwell, selecteer Vergrendelen en pas de focus aan op de Z-positie van kalibratie.
Selecteer vervolgens Afspelen om het referentiepatroon te fotoveranderen. Was het referentiepatroon drie keer met 20 microliter PBS om de fotoinitiator te verwijderen. Voeg vervolgens 20 microliter fluorescerend gelabelde extracellulaire matrix, of ECM, eiwitoplossing toe.
Broed de schotel 10 tot 20 minuten op kamertemperatuur uit, zodat de referentie goed beschermd wordt tegen licht. Na incubatie, verwijder 18 microliter eiwitoplossing en was de put drie keer met 20 microliter PBS. Gebruik een epifluorescentiemicroscoop om het referentiepatroon te visualiseren.
Pas de focus op de patroonranden door het camerapad aan en neem de Z-positie op basis van de beste focus. Deze positie zal de optimale laserfocus zijn die wordt gebruikt voor latere patronen. Verwijder onder steriele omstandigheden 18 microliter PBS uit alle microwells.
Voeg vijf microliter van de foto-initiator aan elke put, en homogeniseren door pipetting op en neer. Als u meerdere eiwitten in dezelfde microwell patroonpatroon geeft, uploadt u alle sets gewenste patroonsjablonen tegelijkertijd. Selecteer vervolgens het aantal rijen, kolommen en dosis.
Sla de sjabloonconfiguratie op als bestand in de software. Navigeer naar het gebied waar het referentiepatroon is geproduceerd en pas de focus aan op de optimale Z-positie. Selecteer vervolgens Afspelen om fotopatroon te starten.
De ontwerpunits worden van rood naar blauw als het fotopatroon is voltooid. Verwijder de fotoinitiator uit de microwells door ze drie keer te wassen met 20 microliter PBS. Verwijder na de laatste wasbeurt 18 microliter PBS uit elke microput en voeg 20 microliter ECM-eiwitoplossing toe.
Broed de schotel 20 tot 30 minuten op kamertemperatuur uit, zodat u deze beschermt tegen licht. Verwijder vervolgens 15 microliter van de ECM-eiwitoplossing en was de microwells drie keer met behulp van 20 microliter PBS. Om kruisbinding te voorkomen, voegt u 20 microliter PLL-PEG of BSA toe aan de microwells en ontcunelijk de schotel een uur lang bij kamertemperatuur in het donker.
Verwijder vervolgens 15 microliter van het blokkeermiddel en was alle microwells drie keer met 20 microliter PBS. Verwijder 18 microliter pbs en voeg 5 microliter van de fotoinitiator toe aan elke microwell, zodat de fotoinitiator homogeen is op het hele oppervlak van de microwells. Navigeer naar de eerste microwell en laad de eerder opgeslagen sjabloonconfiguratie.
Selecteer vervolgens de acties die moeten worden gesymand voor de tweede ronde van fotopatronen en zorg ervoor dat acties uit de eerste ronde worden uitgeschakeld. Na fotopatning, verwijder PLPP door te wassen met PBS. Vervolgens 20 minuten uitbroeden met de tweede ECM-eiwitoplossing en de microwells drie keer wassen met 20 microliter PBS.
Gebruik een epifluorescentiemicroscoop om de gedrukte patronen te visualiseren en in beeld te brengen. Wanneer klaar om de cellen plaat, voeg een milliliter medium met cellen aan het binnenste glas goed, zorg ervoor dat alle microwells te dekken. En plaats de kweekschotel in een 37 graden Celsius, en 5% koolstofdioxide incubator.
Om ervoor te zorgen dat de gegenereerde patronen een nauwkeurige weergave van het sjabloon zijn, worden fluorescentieintensiteitsmetingen verkregen langs de strepen en vanuit een overeenkomstig achtergrondgebied boven elke streep. Reproduceerbare gedefinieerde micropatronen worden bereikt, variërend van 20 tot 2 micrometer breed, maar een randeffect kan worden waargenomen wanneer afdrukken 20 micrometer of breder is. Gedefinieerde eiwitconcentraties worden verkregen door ofwel uitbroeden met verschillende concentraties van eiwitten, of het variëren van de laser dosis die wordt gebruikt om de antiadhesive film cleave.
Laserintensiteit is evenredig aan het grijswaardenniveau van de sjabloon, waardoor gradiënten van UV-verlichting worden genereert. De meting van het fluorescentieintensiteitsprofiel langs de verloopstreep, is lineair in de patroonsjabloon en in het gegenereerde verlooppatroon. Dit protocol kan worden gebruikt om micropatronen te maken met meerdere eiwitten in dezelfde microwell, zoals kruispatronen met horizontale strepen fibronectin en verticale strepen laminine.
Maar een blokkerende stap is noodzakelijk om kruisbinding van eiwitten te voorkomen. De gegenereerde kruispatronen kunnen vervolgens worden gebruikt voor cellulaire tests met neuronale cellijnen, of CAD-cellen, of primaire neuronen, rat DRGs. Bij het uitvoeren van dit protocol, de belangrijkste aspecten om te onthouden zijn het doen van een goede systeemkalibratie, niet laten de microwells uitdrogen tijdens de meerdere wasstappen, en het gebruik van de juiste parameters voor eiwit incubatie en blokkeren.
Analyse van celgedrag meestal microscopie, zoals fluorescentie, time-lapse, AFM. Verdere karakterisering kan bestaan uit andere biochemische methoden, zoals genexpressie profilering.
