Name: light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins
Uploaded: 2019-10-11T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

Diese Arbeit wird von BBSRC, EPSRC, MRC und Wellcome Trust unterstützt. Das C.B.-Labor ist Teil des Wellcome Trust Centre for Cell-Matrix Research, University of Manchester, das durch eine Kernfinanzierung des Wellcome Trust (Grant-Nummer 088785/Z/09/Z) unterstützt wird. Die Autoren möchten die Finanzierung durch den Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) an C.M., K.J. (BB/M020630/1) und P.A. (BB/P000681/1) sowie durch den Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council ( Forschungsrat (MRC) Zentrum für Doktorandenausbildung in Regenerativer Medizin an A.K. (EP/L014904/1). Die Autoren danken Alvéole für ihre Korrespondenz und ihr After-Sales-Support-Team. Die Autoren danken Peter March und Roger Meadows von der Bioimaging Facility, University of Manchester, für ihre Hilfe bei der Mikroskopie. Die in dieser Studie verwendeten Mikroskope der Bioimaging Facility wurden mit Zuschüssen von BBSRC, Wellcome Trust und dem University of Manchester Strategic Fund erworben.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

VORTEILE der LIMAP (PRIMO) Mikromusterung und Der Vergleich mit dem Mikrokontaktdruck Während Der Mikrokontaktdruck möglicherweise die am häufigsten verwendete Mikromustertechnik im biologischen Bereichist 39, scheint es eine wachsende Zahl von Forschern zu geben, die die LIMAP-Technologie40,41,42 verwenden. ,43,44. Hier haben wir ein Protokoll mit PRIMO vorgestellt, einem kommerziell erhältlichen System für LIMAP. Im Folgenden werden die potenziellen Vorteile und Einschränkungen des Mikrokontaktdrucks und der LIMAP-Fotomusterung kurz erläutert.
Microcontact-Druck erfordert lithographierte Master, die durch Spin-Coating einer Fotomaske (in der Regel SU-8) auf ein Glas oder Silizium-Wafer hergestellt werden, die dann mit den gewünschten Mikro-Features lasergeätzt wird. Diese Master werden als Vorlagen verwendet, um einen PDMS-Stempel45zu erstellen. Der Stempel wird mit einem ausgewählten Protein inkubiert, das darauf adsorbiert, und dann auf die Zellkulturschale übertragen (gestempelt). Der Prozess der Adsorption des Proteins auf den PDMS-Stempel ist abhängig von Proteinkonzentration, Puffer und Inkubationszeit. Diese Parameter müssen vorher auf optimale Ergebnisse46getestet werden.
Meister können in einer beträchtlichen Anzahl von Experimenten verwendet werden, die Monate oder sogar Jahre dauern, wenn sie richtig konserviert werden. Ein begrenzender Faktor dieser Technologie ist jedoch die Notwendigkeit, neue lithographierte Master für jede gewünschte Modifikation neu zu gestalten. Änderungen in experimentellen Konstruktionen können zu einer zeitaufwändigen Produktion neuer Master (bis zu mehreren Wochen) führen und somit Experimente verzögern. Im Vergleich dazu erfordert LIMAP Photopatterning keinen physischen Master; Es verwendet softwaregenerierte Mustervorlagen, mit denen gewünschte Geometrien von Mikromustern flexibel an sich verändernde Forschungsfragen angepasst werden können. LIMAP kann auch verwendet werden, um Proteingradienten innerhalb desselben Mikromusters zu erzeugen (Abbildung 8), was schwieriger ist, in einer reproduzierbaren Weise mit Mikrokontaktdruck zu erhalten47.
Darüber hinaus beträgt die mit LIMAP erreichte Mikromusterauflösung in unserem Fall 2 m (Abbildung 6B).
Die Annäherung an diese Auflösung erhöhte die Intra- und Inter-Mustervariabilität. Das Erzeugen von Mustern um oder über einer Breite von 10 m war sehr reproduzierbar (Abbildung 6G,H). Im Gegenteil, beim Mikrokontaktdruck ist es schwierig, konstant Auflösungen unter 10 m zu erhalten, und es ist üblich, Artefakte beim Stempeln kleiner Features zu finden (Daten nicht dargestellt).
Wir haben gezeigt, dass LIMAP verwendet werden kann, um mehrere Proteine(Abbildung 9) innerhalb desselben Mikrobrunnens mikromustern zu lassen, so dass Den Experimenten weitere Komplexitätsstufen hinzugefügt werden können. Obwohl dies mit Deminitätsdruck erreicht werden könnte, kann die Ausrichtung verschiedener Proteine mit hoher Präzision technisch recht anspruchsvoll sein. Während das Mustern mehrerer Proteine mit LIMAP geradeaus erscheint, ist es wichtig zu erwähnen, dass die Kreuzbindung von Proteinen durch sequenzielle Beschichtungsverfahren durch blockende Reagenzien reduziert, aber nicht vollständig beseitigt werden kann (Abbildung 9).
In Bezug auf die Kosten für die eine oder andere Technik erfordert LIMAP, wie hier beschrieben, den Kauf von Mikro-Mustergeräten (PRIMO), die auf verschiedenen Fluoreszenzmikroskopen installiert werden können und eine motorisierte Stufe erfordern. Obwohl diese Investition zunächst kostenintensiv ist, gibt es langfristig keine zusätzlichen Käufe außer Verbrauchsgütern (Schablonen, PEG und PLPP), die mit LIMAP verbunden sind. Alternativ können die PDMS-Schablonen auch im Labor von dem eigenen Experimentator nach den veröffentlichten Protokollen18,32hergestellt werden. Die größten Kosten für den Mikrokontaktdruck können mit der Herstellung neuer Master verbunden sein, die erheblich werden können, wenn Experimente neue Muster erfordern.
Ein Nachteil von LIMAP ist der relativ niedrige Durchsatzansatz dieser Technik. Microcontact-Druck kann eine große Anzahl von Mikromustern schnell und effizient in einem simultanen Stanzschritt erzeugen, verglichen mit der erforderlichen sequenziellen Laser-Mikro-Musterung mit LIMAP. Zum Beispiel ist es möglich, 6 gestanzte Glasabdeckungen in ca. 2 h mit Mikrokontaktdruck mit PDMS-Stempeln (ohne Stempelvorbereitung) herzustellen; Die Musterung eines ähnlichen Bereichs (6-Well-Schale) mit LIMAP würde etwa 4 h dauern, mit Ausnahme des Verfahrens der Oberflächenpassivierung (unter Berücksichtigung der Mustervorlagenkonfiguration, die in Schritt 5.12 beschrieben wird und siehe Abbildung 5B).
Ein weiterer Ratenbegrenzungsfaktor der LIMAP-Technologie ist die lange Beleuchtungszeit, die für die Musterung großer Flächen erforderlich ist (30 s pro Konstruktionseinheit mit einem 7,5 mW/mm2 Laser). In diesen Fällen kann das Drucken von Mikrokontakten eine bevorzugte Option sein. Ein neu verfügbarer Fotoinitiator (PLPP-Gel, Materialtabelle) sollte die Zeit für die Musterung erheblich reduzieren und die Erzeugung von Hunderten von Mikromustern in großen Bereichen (bis zu 8 mm2) in nur wenigen Minuten ermöglichen.
Ein weiterer wichtiger Faktor, der bei der Mikromusterung von Oberflächen für die Zellkultur zu berücksichtigen ist, ist die Reproduzierbarkeit der Mikromuster zwischen verschiedenen experimentellen Wiederholungen im Vergleich zur Variabilität beim Mikrokontaktdruck. Beispielsweise sind die in Abbildung 7B,D dargestellten Diagramme repräsentative Daten von drei unabhängigen experimentellen Wiederholungen mit sehr ähnlichen Ergebnissen (Daten nicht dargestellt). Basierend auf unserer Erfahrung und früheren Veröffentlichungen ist dieser Grad an Reproduzierbarkeit mit Mikrokontaktdruck48,49,50,51,52schwer zu erreichen.
Im Gegensatz zu anderen Fotomustertechniken, die entweder eine spezielle Chemie erfordern, um lichtempfindliche Materialien zu entwickeln, oder die Verwendung von Photosensibilisatoren, die im Allgemeinen nicht sehr biokompatibel sind3, ist die lichtempfindliche Komponente von LIMAP (PLPP) ) ist biokompatibel und durch zellen21gut verträglich; in unseren Händen haben wir keine Zytotoxizität über eine Vielzahl von Zellen erfahren, einschließlich CAD, DRG-Neuronen (Abbildung 10), Fibroblasten, Epithelzellen und Melanomzellen (Daten nicht gezeigt). Ein weiterer Vorteil von LIMAP mit PRIMO im Vergleich zu anderen Fotomustertechniken ist, dass keine Fotomaske erforderlich ist. Ähnlich wie beim Mikrokontaktdruck müssten für jedes gewünschte Muster neue Fotomasken entworfen und erzeugt werden.
Alle oben genannten Einschränkungen für den Mikrokontaktdruck finden Sie im manuellen Ansatz der Technik. Es ist jedoch möglich, den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit des Mikrokontaktdrucks mit einem automatisierten Gerät mit Stempellast und Druckregelung53zu verbessern.
Wichtige Schritte des Protokolls und Problemlösung für LIMAP mit PRIMO Eines der häufigsten Probleme, die während dieses Protokolls gefunden werden, ist ein hohes Maß an Hintergrundfluoreszenz innerhalb der Mikromuster. Dies kann auf das Austrocknen von Mikrobrunnen zurückzuführen sein, das häufig aufgrund ihres geringen Volumens auftritt. In diesem Fall erscheinen häufig PBS-Kristalle, die die ECM-Muster umgeben (Abbildung 11A).
Unzureichende oder ineffiziente Waschschritte nach der Proteininkubation können auch zu einer hohen Hintergrundfluoreszenz führen. Dies kann insbesondere bei der Verwendung von Proteinkonzentrationen von 10 g/ml (Abbildung 11B) oder höher beobachtet werden. Der Proteinüberschuss im Hintergrund kann durch zusätzliche Waschschritte mit PBS reduziert werden.
Das Vorhandensein von Proteinhintergrund muss in jedem Experiment gemessen und charakterisiert werden, wobei die Hintergrundfluoreszenzintensität (Abbildung 6E) berechnet und von der Mikromusterintensität subtrahiert wird (Abbildung 6F-H und Abbildung 7B,D). Ein hoher Proteinhintergrund kann sich auf die Anhaftung und das Keimen von CAD-Zellen auswirken und die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen.
Lücken zwischen Konstruktionseinheiten sind ein häufiges Problem, wenn Benutzer nur über begrenzte Erfahrung verfügen (Abbildung 11B), was auf eine unzureichende Überlappung zwischen Mustern zurückzuführen ist. Zwei Parameter in der Leonardo-Software können angepasst werden, um dies zu überwinden: 1) je nach Design des Musters kann ein negativer Abstand zwischen den Spalten erforderlich sein (Schritt 5.7 und siehe Abbildung 5B,C). Alternativ können Sie die Farbverlaufsoption im Menü "Experte" verwenden, um die Spalten zu nähen. Ein Schnelltest zur Bestimmung der optimalen Abstandsparameter kann mit UV-Klebstoff (Materialtabelle )durchgeführt werden. Ein kleiner Tropfen dieses Klebstoffs wird auf eine Glasrutsche aufgetragen, die dann mit einem Glasdeckel bedeckt wird, wodurch eine Folie entsteht. Der eingebettete UV-Klebstoff wird mit der Musterschablone von Interesse mit einer niedrigen Laserdosis (30 mJ/mm2)fotomustert. Die UV-exponierten Bereiche des eingebetteten Klebstoffs werden ausgehärtet und werden unter der Hellfeldmikroskopie sichtbar. Die Testergebnisse werden visualisiert, um den erhaltenen Abstand innerhalb des Musters auszuwerten. In unseren neuronalen Experimenten kann eine Lücke zwischen den Streifen das Zellverhalten negativ beeinflussen und zu Schwankungen in der Wachstumsdynamik führen (entweder reduzierte Geschwindigkeit oder Aufgabe des Pfades).
In der neuesten Aktualisierung der Leonardo-Software (zum Zeitpunkt der Veröffentlichung, Leonardo 4.11), ist es möglich, zuvor entworfene größere Mustervorlagen hochzuladen, die eine viel größere Fläche (bis zu 8 mm2 mit dem 20X-Objektiv) der Mikrobrunnenoberfläche abdecken im Vergleich zu den aktuellen 0,1 mm2 pro Konstruktionseinheit, so dass die kleineren Konstruktionseinheiten nicht zusammengefügt werden müssen. Undefinierte Kanten können auf einen Mangel an Laserfokusanpassung während der Mustergenerierung zurückzuführen sein (Abbildung 11C). Daher ist es wichtig, den Laser zu kalibrieren und Referenzmusterschritte (siehe Schritt 4) vor der Musterung durchzuführen. Schlecht definierte Streifen führen zu Abweichungen in der Streifenbreite, was die Korrelation zwischen Axonwachstumsdynamik und Streifenbreite erschwert. Axone neigen auch dazu, Streifen aufzugeben, die diffuse Kanten haben. Darüber hinaus kann die Variabilität der Kanten auch beim Drucken von Streifen mit einer Breite von 10-20 m oder höher gefunden werden, was zu einem höheren Proteingehalt an den Rändern im Vergleich zu den zentralen Bereichen des Musters führt (Abbildung 6B,D). Dieser Kanteneffekt wird durch eine nicht homogene Diffusion des Fotoinitiators während des Photomusterprozesses erzeugt. Die Photoscissionsreaktion ist sauerstoffabhängig, die mehr an den Rändern diffundiert. Dieser Kanteneffekt kann minimiert werden, um den Photoinitiator während des Photomusterprozesses mit einer Pipette im Mikrobrunnen zu homogenisieren. Darüber hinaus kann ein neuer kommerzialisierter Fotoinitiator (PLPP-Gel) auch den Edge-Effekt reduzieren (PRIMO System Support Team, persönliche Kommunikation).
Der Mikrodruck von mehr als einem Protein kann zu einer Kreuzbindung führen (Abbildung 9A-D). Dies kann minimiert werden, indem die Blockiereffizienz erhöht wird, die verwendet wird, um unspezifische Bindungsstellen zwischen den Inkubationsschritten für die beiden verschiedenen Proteine zu besetzen. Die Kreuzbindung von Proteinen kann die Reproduzierbarkeit von experimentellen Ergebnissen stören und zu einer Fehlinterpretation von Daten führen, da es schwierig ist, den Beitrag jedes Proteins zur Axonwachstumsdynamik und zu anderen Zellverhalten zu bestimmen.
Schlussfolgerung Wir hoffen, dass das mit LIMAP bereitgestellte Protokoll die Erzeugung von Protein-Mikromustern durch den Einsatz des PRIMO-Systems erleichtert. Während sich unser Protokoll darauf konzentriert, wie Mikromuster in 2D-Glasoberflächen zuverlässig hergestellt werden können, haben andere gezeigt, dass es möglich ist, LIMAP für die Mikro-Musterung weicher Substrate54und mikrostrukturierte Oberflächen für 3D-Kulturen42zu verwenden. Diese Mikromuster können ein vielseitiges Werkzeug sein, um zelluläre Reaktionen auf Veränderungen in ihrer Mikroumgebung zu untersuchen.

In den letzten Jahren haben die biologischen Wissenschaften zunehmend von den Fortschritten der Materialwissenschaften Gebrauch gemacht. Ein prominentes Beispiel ist die Mikro-Musterung von Substraten, die verwendet werden können, um zelluläre Reaktionen wie Zellproliferation zu untersuchen.1,2Differenzierung3,4,5,6, Zellmigration7,8,9und Pathfinding10,11. Es gibt eine Reihe von Techniken, die die Mikro-Musterung von Substraten ermöglichen, wie z. B. Multiphotonen-aufgeregte Photochemie12, AFM Dip-Pen-Nanolithographie13, Pin- und Inkjet-Direktdruck14, Elektronenstrahllithographie15oder Mikrofluidik16. Zwei Techniken, die im biologischen Bereich weit verbreitet sind, sind jedoch der Mikrokontaktdruck17,18,19oder laserunterstützte Musterung3(Abbildung 1). Laserunterstützte Musterung gilt als zuverlässigere Ergebnisse in Bezug auf Protein- und PEG-Stabilität und Zelleinschließung auf den Mustern im Vergleich zum Mikrokontaktdruck20. Ein neuerer Ansatz für die Mikromusterung, der hier beschrieben wird, ist die Verwendung der lichtinduzierten molekularen Adsorption von Proteinen.21(LIMAP,Abbildung 1 D) mit einem handelsüblichen System (PRIMO,Materialtabelle). Jede der Methoden hat Vorteile und Einschränkungen, die im Folgenden kurz beschrieben werden. Microcontact-Druck verwendet PDMS-Formen (Stempel) mit gewünschten Mikro-Features, die von lithographierten Mastern generiert werden. Die Stempel werden mit einem ausgewählten Protein inkubiert, das dann auf das Zellkultursubstrat übertragen (gestempelt) wird.18(Abbildung 1 pro). Laserunterstützte Musterung verwendet UV-Licht, um einen Anti-Fouling-Film zu spalten22,23,24,25, die Regionen freilegen, die anschließend mit dem Protein von Interesse beschichtet werden können (Abbildung 1 B). Während die mit Fotomusteransätzen erreichte Auflösung im Mikronbereich liegt,25,26, erfordern die meisten dieser Techniken eine Fotomaske, entweder in Kontakt mit der Probe oder in der Objektebene des Mikroskopobjektivs23,27,28. Die Anforderungen an Masken sowohl beim Mikrokontaktdruck als auch beim Fotomustern können eine Einschränkung sein; Für jedes geometrische Muster und jede Größe sind spezifische Masken erforderlich, die teuer und zeitaufwändig sein können. Im Gegensatz zu diesen Techniken benötigt LIMAP keine Maske (Abbildung 1 D). Die Verwendung des PRIMO-Systems für LIMAP kann von Anfang an kostenintensiv sein, da es den Kauf von Geräten erfordert. Open-Source-Software wird jedoch verwendet, um Muster jeder gewünschten Geometrie zu entwerfen, was viel mehr Freiheit bietet und komplexere Experimente ermöglicht, einschließlich der Verwendung von Proteinkonzentrationsgradienten. Der PRIMO-Laser wird von einem digital gesteuerten Mikrospiegelgerät (DMD) gesteuert und geleitet, um Muster in beschaffenen Geometrien zu erstellen. LIMAP erfordert, dass die Kulturoberfläche mit Molekülen beschichtet wird, die eine Zellanhaftung verhindern. Polyethylenglykol (PEG) wird am häufigsten als solches "Antifouling"-Reagenz verwendet; es bildet eine dichte Anti-Klebefolie auf der Glas- oder Kunststoffoberfläche29. Anschließend wird ein Fotoinitiator hinzugefügt, der es ermöglicht, den PEG-Film mit hoher Präzision durch einen Photocissionsmechanismus zu entfernen.30durch lokale Exposition gegenüber UV-Licht unter der Kontrolle des DMD. Diese PEG-freien Regionen können mit Proteinen beschichtet werden, die auf die lasergeätzte Oberfläche adsorbieren und ein Mikromuster erzeugen. Durch Variation der Laserleistung können verschiedene Mengen von PEG von der Oberfläche entfernt werden, so dass der Benutzer Proteingradienten erzeugen kann. PEG-Entfernung und das Beschichtungsverfahren können wiederholt werden, um Muster mit zwei oder mehr unterschiedlichen Proteinen im selben Mikrobrunnen zu erstellen21. Die erzeugten Mikromuster bieten Klebeflächen für Zellen, die die Untersuchung des Zellverhaltens ermöglichen. In unseren Studien verwenden wir Mikromuster, um die Neuriten- oder Axon-Pfadfindung einer neuronalen Zelllinie (CAD (Cad (Cathecholaminergic-a differentiated)31) bzw. primäre Mundrat-Dorsal-Wurzel-Ganglion (DRG)-Neuronen. Hier legen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für LIMAP (Abbildung 2) mit dem handelsüblichen PRIMO-System und der dazugehörigen Leonardo-Software. Wir zeigen, wie es für die Erzeugung von Mustern mit definierten Geometrien und mehreren Proteinen verwendet werden kann, die wir verwenden, um axonale Pathfindungen zu untersuchen. Wir diskutieren gemeinsame Fragen, die auftreten können und wie diese vermieden werden können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 488 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20173</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>8100805</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conjugated fibrinogen-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti inverted</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-Image J</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov" target="_blank">www.imagej.nih.gov</a></td>
			<td>Version 2.0.0-rc-54/1.51f</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent highlighter</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>Stabilo Boss Original</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Working concentration: 1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkscape software</td>
			<td>Inkscape</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-red fluorescent rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>LMN01</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>version 4.11</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager software</td>
			<td>Open imaging</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized x/y stage</td>
			<td>PRIOR Scientific</td>
			<td>Proscan II</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Working concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Stencils</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>visit <a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>Laysan bio, Inc.</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Working concentration: 50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176752</td>
			<td>Working concentration: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>Classic PLPP</td>
			<td>Working concentration: 14.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP gel)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>Working concentration: 4.76% diluted in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS (also distributed by Alv&#233;ole)</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/ProductLookup.html?ProdNo=P4707&amp;Brand=SIGMA">P4707</a></td>
			<td>Working concentration: 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo equipment</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122">15140122</a></td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-alpha antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>DM1A</td>
			<td>Working concentration: 1:1000 
			CAD cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-beta 3 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td>Working concentration: 1:500 
			DRG neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>no phase ring (check updated catalogue)</td>
			<td>Working concentration: N.A. 
			**Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alv&#233;ole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins

Die Zellen spüren eine Vielzahl von extrazellulären Cues, einschließlich der Zusammensetzung und Geometrie der extrazellulären Matrix, die von den Zellen selbst synthetisiert und umgestaltet wird. Hier stellen wir die Methode der lichtinduzierten molekularen Adsorption von Proteinen (LIMAP) unter Verwendung des PRIMO-Systems als Mustertechnik zur Herstellung mikrogemusterter extrazellulärer Matrixsubstrate (ECM) unter Verwendung einer einzigen oder Kombination von Proteinen vor. Das Verfahren ermöglicht das Drucken von ECM-Mustern in Mikron-Auflösung mit hervorragender Reproduzierbarkeit. Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Verfügung und zeigen, wie dies angewendet werden kann, um die Prozesse der neuronalen Pfadfindung zu untersuchen. LIMAP hat erhebliche Vorteile gegenüber bestehenden Mikrodruckverfahren in Bezug auf die einfache Musterung von mehr als einer Komponente und die Möglichkeit, ein Muster mit einer beliebigen Geometrie oder einem Farbverlauf zu erzeugen. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um den Beitrag fast jeder chemischen Komponente zum Zellschicksal und Zellverhalten zu untersuchen. Schließlich diskutieren wir gemeinsame Fragen, die auftreten können und wie diese vermieden werden können.

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Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Unser übergeordnetes Ziel ist es zu verstehen, wie Zellen extrazelluläre Hinweise spüren, die zu einem gerichteten axonalen Wachstum führen. Hier beschreiben wir die Methodik der lichtinduzierten molekularen Adsorption von Proteinen, die verwendet wird, um definierte Mikromuster von extrazellulären Matrixkomponenten zu produzieren, um spezifische Ereignisse zu untersuchen, die das Axonwachstum und die Pfadfindung steuern.

Lichtinduzierte molekulare Adsorption von Proteinen mit dem PRIMO-System für Mikro-Patterning zur Untersuchung von Zellreaktionen auf extrazelluläre Matrixproteine

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Mikro-Musterung ist ein sehr leistungsfähiges Werkzeug, weil es die Untersuchung zellulärer Reaktionen ermöglicht, um biochemische und biophysikalische Signale zu definieren, denen Zellen in lebenden Organismen begegnen. Im Gegensatz zu anderen Methoden ist die beschriebene für die Mustergenerierung flexibler. Zum Beispiel ermöglicht es die Produktion von Gradienten und Mikromustern mehrerer Proteine mit hoher Reproduzierbarkeit.Unsere Gruppe nutzt LIMAP nicht nur, um neuronale Pfadfindungen zu untersuchen, sondern auch, wie andere Zellen auf Signale reagieren, die Einfluss auf Zellproliferation, Differenzierung und Migration haben. Mikromusterung wird verwendet, um grundlegende Fragen in der Zellbiologie zu beantworten. Das gewonnene Wissen kann genutzt werden, um bestehende Geräte in der regenerativen Medizin zu modifizieren, zum Beispiel Nervenreparatur nach peripheren Nervenverletzungen.Beginnen Sie mit dem Entwerfen von Vorlagen für das Mustern auf digitaler Zeichensoftware. Wählen Sie eine Bildgröße von 1, 824 Pixel n. Chr. und 1, 140 Pixel in der Breite aus. Entwerfen Sie die Vorlage, und speichern Sie die Vorlage als 8-Bit-TIFF-Datei.Reinigen und aktivieren Sie vor dem Mustern die Oberfläche mit einem Plasmareiniger mit einem Prozessdruck von 1.000 bis 1, 300 Millitorr und einer Leistung von 29,6 Watt für ein bis fünf Minuten. Verwenden Sie eine Glasbodenschale mit einer 20-Millimeter-Innenbrunnengröße und einer Glasdicke von 0,16 bis 0,19 Millimetern. Wählen Sie entweder ein Sechs-Gut oder ein Einzel-Gut-Gericht, abhängig von der Anzahl der Bedingungen, die getestet werden.SCHNEIDEN Sie PDMS Schablonen unter sterilen Bedingungen, um sicherzustellen, dass sie gut in den inneren Glasboden passen. Entfernen Sie die inneren Mikrobrunnenfüllungen mit steriler Zange, und kleben Sie die Schablonen gut auf das Glas. Bereiten Sie eine 0,1 Milligramm pro Milliliter PLL-PEG-Lösung in PBS vor und fügen Sie jedem Mikrobrunnen 20 Mikroliter hinzu.Dann inkubieren Sie das Gericht bei Raumtemperatur für eine Stunde. Nach der Inkubation 15 Mikroliter des PLL-PEG aus jedem Brunnen entfernen und fünfmal mit 20 Mikroliter PBS waschen, ohne es trocknen zu lassen. Bereiten Sie einen Mikrobrunnen vor, um ein Referenzmuster zu erstellen, indem Sie 18 Mikroliter PBS aus einem einzigen Brunnen entfernen und fünf Mikroliter Photoinitiator hinzufügen, sodass PBS in den verbleibenden Mikrobrunnen verbleibt.Verwenden Sie dann einen fluoreszierenden Highlighter, um einen leeren Inneren Glasbrunnen zu markieren. Positionieren Sie die weit über dem Ziel, und passen Sie den objektiven Fokus, bis das PRIMO-Logo und der Slogan kümmern sich um Ihre Zellen"sind im Fokus. Zeichnen Sie dann die Z-Position der Brennebene auf.Um ein Referenzmuster zu erstellen, visualisieren Sie den Rand des Mikrobrunnens mit dem Photoinitiator mithilfe des übertragenen Lichts durch die Kamera, und wählen Sie das ROI-Symbol aus dem rechten Menü aus. Wählen Sie PRIMO aus, um die gewünschte Mustervorlage hochzuladen, die als Konstruktionseinheit auf den ROI projiziert wird. Navigieren Sie zu einem peripheren Bereich des Mikrobrunnens, wählen Sie Sperren aus, und passen Sie den Fokus an die Z-Position der Kalibrierung an.Wählen Sie dann Wiedergabe aus, um mit dem Fotomuster des Referenzmusters zu beginnen. Waschen Sie das Referenzmuster Microwell dreimal mit 20 Mikroliter PBS, um den Photoinitiator zu entfernen. Fügen Sie dann 20 Mikroliter fluoreszierend extrazellulärer Matrix oder ECM-Proteinlösung hinzu.Inkubieren Sie die Schale bei Raumtemperatur für 10 bis 20 Minuten, um sicherzustellen, dass die Referenz gut vor Licht zu schützen. Nach der Inkubation 18 Mikroliter Proteinlösung entfernen und den Brunnen dreimal mit 20 Mikroliter PBS waschen. Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop, um das Referenzmuster zu visualisieren.Passen Sie den Fokus auf die Musterkanten durch den Kamerapfad an, und zeichnen Sie die Z-Position entsprechend dem besten Fokus auf. Diese Position wird der optimale Laserfokus für die nachfolgende Musterung verwendet. Entfernen Sie unter sterilen Bedingungen 18 Mikroliter PBS aus allen Mikrobrunnen.Fügen Sie fünf Mikroliter des Photoinitiators zu jedem Brunnen hinzu und homogenisieren Sie, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Wenn Sie mehrere Proteine im selben Mikrobrunnen mustern, laden Sie alle Sätze der gewünschten Mustervorlagen gleichzeitig hoch. Wählen Sie dann die Anzahl der Zeilen, Spalten und Dosis aus.Speichern Sie die Vorlagenkonfiguration als Datei in der Software. Navigieren Sie zu dem Bereich, in dem das Referenzmuster erstellt wurde, und passen Sie den Fokus an die optimale Z-Position an. Wählen Sie dann Wiedergabe aus, um die Fotomusterung zu initiieren.Die Designeinheiten drehen sich von rot zu blau, wenn die Fotomusterung abgeschlossen ist. Entfernen Sie den Photoinitiator aus den Mikrobrunnen, indem Sie ihn dreimal mit 20 MikroliterPBS waschen. Nach der letzten Wäsche 18 Mikroliter PBS aus jedem Mikrobrunnen entfernen und 20 Mikroliter ECM-Proteinlösung hinzufügen.Inkubieren Sie das Gericht bei Raumtemperatur für 20 bis 30 Minuten, um es vor Licht zu schützen. Als nächstes entfernen Sie 15 Mikroliter der ECM-Proteinlösung und waschen Sie die Mikrobrunnen dreimal mit 20 Mikroliter PBS. Um eine Kreuzbindung zu vermeiden, fügen Sie 20 Mikroliter PLL-PEG oder BSA in die Mikrobrunnen ein und inkubieren Sie die Schale bei Raumtemperatur für eine Stunde im Dunkeln.Entfernen Sie dann 15 Mikroliter des Blockiermittels und waschen Sie alle Mikrobrunnen dreimal mit 20 Mikroliter PBS. Entfernen Sie 18 Mikroliter PBS, und fügen Sie 5 Mikroliter des Photoinitiators zu jedem Mikrobrunnen hinzu, um sicherzustellen, dass der Photoinitiator auf der gesamten Oberfläche der Mikrobrunnen homogen ist. Navigieren Sie zum ersten Microwell, und laden Sie die zuvor gespeicherte Vorlagenkonfiguration.Wählen Sie dann die Aktionen aus, die für die zweite Fotomusterrunde gemustert werden sollen, und stellen Sie sicher, dass die Auswahl der Aktionen aus der ersten Runde aufheben wird. Entfernen Sie PLPP nach dem Photomustern, indem Sie es mit PBS waschen. Dann 20 Minuten mit der zweiten ECM-Proteinlösung inkubieren und die Mikrobrunnen dreimal mit 20 Mikroliter PBS waschen.Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop, um die gedruckten Muster zu visualisieren und abzubilden. Wenn Sie bereit sind, die Zellen zu befestigen, fügen Sie dem inneren Glasgut einen Milliliter Medium mit Zellen hinzu, um sicherzustellen, dass alle Mikrobrunnen abgedeckt sind. Und legen Sie das Kulturgericht in einem 37 Grad Celsius, und 5% Kohlendioxid-Inkubator.Um sicherzustellen, dass die erzeugten Muster eine präzise Darstellung der Schablonen sind, werden fluoreszenzintensive Messungen entlang der Streifen und aus einem entsprechenden Hintergrundbereich über jedem Streifen durchgeführt. Reproduzierbare definierte Mikromuster werden im Bereich von 20 bis 2 Mikrometern Breite erreicht, aber ein Kanteneffekt kann beobachtet werden, wenn Druckfunktionen von 20 Mikrometern oder breiter sind. Definierte Proteinkonzentrationen werden entweder durch Inkubation mit unterschiedlichen Proteinkonzentrationen oder durch Variation der Laserdosis, die zum Spalten des Antiklebstofffilms verwendet wird, erreicht.Die Laserintensität ist proportional zum Graustufenniveau der Vorlage und erzeugt Gradienten der UV-Beleuchtung. Die Messung des Fluoreszenzintensitätsprofils entlang des Farbverlaufsstreifens ist linear in der Mustervorlage und im generierten Gradientenmuster. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Mikromuster mit mehreren Proteinen im gleichen Mikrobrunnen zu erstellen, wie z. B. Kreuzmuster mit horizontalen Streifen von Fibronectin und vertikale Lamininstreifen.Aber ein Blockierungsschritt ist notwendig, um kreuzbindenvon Proteinen zu verhindern. Die erzeugten Kreuzmuster können anschließend für zelluläre Assays mit neuronalen Zelllinien oder CAD-Zellen oder primären Neuronen, Ratten-DRGs, verwendet werden. Bei der Durchführung dieses Protokolls sind die wichtigsten Aspekte, die Sie sich merken sollten, eine ordnungsgemäße Systemkalibrierung durchzuführen, die Mikrobrunnen während der mehrfachen Waschschritte nicht austrocknen zu lassen und die richtigen Parameter für die Inkubation und Blockierung von Proteinen zu verwenden.Die Analyse des Zellverhaltens umfasst in der Regel Mikroskopie, wie Fluoreszenz, Zeitraffer, AFM. Weitere Charakterisierungen können andere biochemische Methoden umfassen, wie z. B. das Profiling der Genexpression.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

Mit einem vergleichenden Arten Ansatz zur Neurobiologie der väterlichen Responses Untersuchen

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

Forschung

Neurowissenschaften

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

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A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine ​​Studieren

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

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Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

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Linear Agarose Kanäle zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Krabbeln Verhalten

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

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In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In Vivo Mikrodialyse-Methode, um große extrazellulären Proteine Sammeln von Gehirn interstitielle Flüssigkeit mit hochmolekularen Gewicht Cut-Off-Sonden

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...