Name: light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins
Uploaded: 2019-10-11T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

עבודה זו נתמכת על ידי BBSRC, EPSRC, MRC וברוכים האמינים. המעבדה הרדיו אזרחי מהווה חלק ממרכז יחסי האמון של מחקר התאים, אוניברסיטת מנצ, הנתמכת על-ידי מימון הליבה מיחסי האמון (גרנט מספר 088785/Z/09/Z). המחברים מבקשים להכיר במימון המסופק על ידי המועצה למחקר ביוטכנולוגיה ומדעי ביולוגי (BBSRC) ל-C.M., K.J. (BB/M020630/1) ו-הוראות (BB/P000681/1) ועל ידי המועצה למחקר פיסי ומדעי הנדסי (EPSRC) ורפואי מועצת המחקר (MRC) מרכז להכשרה לדוקטורט ברפואת משובי לA.K. (EP/L014904/1). המחברים מודים לAlvéole על התכתובת שלהם ועל צוות התמיכה שלהם אחרי המכירה. המחברים מודים לפיטר מרץ ורוג כרי דשא ממתקן Bioimaging, אוניברסיטת מנצ על עזרתם עם המיקרוסקופיה. מיקרוסקופ מתקן Bioimaging המשמשים במחקר זה נרכשו עם מענקים של BBSRC, ברוכים האמינים ואוניברסיטת מנצ הקרן האסטרטגית.

. למחברים אין מה לגלות

LIMAP (פרימו) מיקרו-מחשב יתרונות והשוואה עם הדפסת מיקרומגע בעוד הדפסה microcontact היא אולי השיטה הנפוצה ביותר בשימוש במיקרו-מיקרונינג בשדה הביולוגי39, נראה שיש מספר גדל והולך של חוקרים באמצעות limap טכנולוגיה40,41,42 ,43,44. כאן, הצגנו פרוטוקול באמצעות פרימו, מערכת זמינה מסחרית עבור LIMAP. בהמשך אנו דנים בקצרה על יתרונות פוטנציאליים ומגבלות של הדפסת מיקרואיש קשר ו-LIMAP צילום-מניפולציה.
הדפסה microcontact מחייב מאסטרים ליטוגרף המיוצר על ידי ציפוי ספין מסכת צילום (בדרך כלל SU-8) על זכוכית או סיליקון וופל, אשר לאחר מכן לייזר חרוט עם מיקרו תכונות הרצוי. מאסטרים אלה משמשים כתבניות כדי ליצורמ45בחותמת pdms. החותמת היא מודלת עם חלבון שנבחר כי adsorbs זה, והוא מועבר לאחר מכן (חותמת) על הצלחת תרבות התא. תהליך הספיחה של החלבון לחותמת PDMS תלוי בריכוז חלבונים, מאגר וזמן דגירה. פרמטרים אלה צריכים להיבדק מראש לקבלת תוצאות מיטביות46.
מאסטרים יכולים לשמש במספר משמעותי של ניסויים, שנמשך חודשים או אפילו שנים, אם נשמר כראוי. עם זאת, גורם מגביל של טכנולוגיה זו הוא הצורך לעצב מחדש מאסטרים חדשים של ליטוגרף עבור כל שינוי רצוי. שינויים בעיצובים ניסיוניים עשויים לגרום לייצור זמן רב של מאסטרים חדשים (עד מספר שבועות) ובכך לעכב ניסויים. לעומת זאת, לימפה פוטואטנינג אינו דורש מאסטר פיזי; היא משתמשת בתבניות דפוס שנוצר על ידי תוכנות שניתן להשתמש בהן כדי להתאים בגמישות הרצוי של מיקרו דפוסים כדי לשנות שאלות מחקר. LIMAP ניתן להשתמש גם כדי ליצור מעברי חלבון בתוך אותו מיקרו דפוס (איור 8), אשר קשה יותר להשיג באופן הניתן לשימוש באמצעות microcontact הדפסה47.
יתר על כן, הרזולוציה מיקרו דפוס השיגה עם limap, במקרה שלנו, הוא 2 יקרומטר (איור 6ב).
התקרבות לרזולוציה זו הגדילה את השונות הפנימית והבין-לדפוס. הפקת דפוסים סביב או מעל 10 יקרומטר רוחב היה מאוד מיותר (איור 6G, H). להיפך, עם הדפסה microcontact קשה לקבל בעקביות החלטות מתחת 10 יקרומטר והוא נפוץ למצוא חפצי אמנות בעת הטבעת תכונות קטנות (נתונים לא מוצגים).
הראינו כי LIMAP ניתן להשתמש מיקרו דפוס חלבונים מרובים (איור 9) בתוך אותו מיקרו-באר, המאפשר רמות נוספות של מורכבות להתווסף ניסויים. למרות שזה יכול להיות מושגת עם הדפסה microcontact, יישור חלבונים שונים עם רמה גבוהה של דיוק יכול להיות מבחינה טכנית תובענית למדי. בעוד מפרט חלבונים מרובים באמצעות LIMAP נראה ישר קדימה, חשוב לציין כי הכלאה של חלבונים באמצעות הליכי ציפוי רציפים ניתן לצמצם באמצעות חוסם ריאגנטים אך לא לחלוטין סולק (איור 9).
לגבי העלות של הטכניקה אחת או אחרת, LIMAP כפי שמתואר כאן דורש רכישה של ציוד מיקרו הרנינג (פרימו) כי ניתן להתקין על מיקרוסקופים פלואורסצנטית שונים ודורש שלב ממונע. למרות שהשקעה זו עולה בתחילה באופן אינטנסיבי, אין רכישות נוספות מלבד פריטים מתכלים (סטנסילים, פג ו-PLPP) בטווח הארוך המשויך LIMAP. לחילופין, הסטנסילים של pdms יכולים להיות מיוצרים גם במעבדה על ידי הניסויים האחרים שפורסמו בעקבות הפרוטוקולים המתפרסמים18,32. העלויות הגדולות ביותר עבור הדפסה של microcontact עשויות להיות משויכות לייצור מאסטרים חדשים, שיכולים להיות משמעותיים אם הניסויים דורשים דפוסים חדשים.
חיסרון אחד של LIMAP היא גישת תפוקה נמוכה יחסית של טכניקה זו. הדפסת מיקרו-מגע יכולה להפיק מספר רב של מיקרו-תבניות במהירות וביעילות בשלב הטבעה סימולטני, בהשוואה למיקרו-מיקרו הלייזר הנדרש עם LIMAP. לדוגמה, ניתן לייצר 6 כיסוי זכוכית מוטבע בתוך כ 2 h עם הדפסה microcontact באמצעות בולים PDMS (למעט הכנה בחותמת); מפענח אזור דומה (6-היטב צלחת) עם LIMAP ייקח כ 4 שעות, למעט ההליך של פסיבציה פני השטח (בהתחשב בתצורה של תבנית דפוס המתואר בשלב 5.12 ולראות איור 5ב).
מקדם הגבלת קצב נוסף של טכנולוגיית LIMAP היא זמן התאורה הארוך הנדרש עבור המעצבים אזורים גדולים (30 s לכל יחידת עיצוב עם 7.5 mW/mm2 לייזר). במקרים אלה, הדפסה של מיקרואנשי קשר עשויה להיות אפשרות מועדפת. חדש זמין ליוזם תמונה (ג'ל PLPP, טבלה של חומרים) צריך במידה ניכרת להפחית את הזמן שנלקח הדפוס, המאפשר את הדור של מאות מיקרו-דפוסים באזורים גדולים (עד 8 מ"מ2) בתוך דקות ספורות.
גורם חשוב נוסף לקחת בחשבון כאשר משטחי מיקרו לתרבות התאים הוא הופך את הצורה החוזרת של דפוסי מיקרו בקרב ניסויים שונים חוזר, בהשוואה לשונות שהתקבלו עם הדפסה microcontact. לדוגמה, הגרפים המוצגים באיור 7ב, D מייצגים נתונים של שלושה מזהים חוזרים ניסיוניים בעלי תוצאות דומות מאוד (נתונים לא מוצגים). בהתבסס על הניסיון שלנו הפרסומים הקודמים, רמה זו של התוכסות קשה להשיג עם microcontact הדפסה48,49,50,51,52.
בניגוד לטכניקות צילום אחרות הדורשות כימיה ייעודית למהנדס חומרים רגישים לאור או שימוש בתמונות רגישות, שבדרך כלל אינן תואמות באופן ביולוגי3, המרכיב הרגיש לאור של limap (plpp ) הוא ביולוגי תואם ונסבל היטב על ידי תאים21; בידינו לא חווינו כל הרעילות ציטובית על פני מגוון של תאים, כולל CAD, הנוירונים DRG (איור 10), פיברותקיעות, תאים אפיתל, ותאי מלנומה (נתונים לא מוצגים). יתרון נוסף של LIMAP באמצעות פרימו בהשוואה לטכניקות צילום אחרות של התמונה היא כי לא מפובקש נדרש. בדומה הדפסה microcontact, פושאול חדש צריך להיות מעוצב ומיוצר עבור כל דפוס רצוי.
כל המגבלות שהוזכרו לעיל עבור הדפסה מיקרו-מגע, עיין בגישה הידנית של הטכניקה. עם זאת, ניתן לשפר את התפוקה ואת השגות של הדפסה מיקרומגע באמצעות מכשיר אוטומטי עם עומס בולים ובקרת לחץ53.
שלבים מרכזיים של הפרוטוקול ופתרון הבעיות עבור LIMAP באמצעות פרימו אחת הבעיות הנפוצות ביותר שנמצאו במהלך פרוטוקול זה היא שיש רמות גבוהות של הרקע בתוך מיקרו דפוסים. זה יכול להיות בגלל ייבוש מתוך מיקרו בארות אשר לעיתים קרובות מתרחשת בשל הנפח הקטן שלהם. כאשר הדבר מתרחש, קריסטלים של PBS מופיעים לעיתים קרובות סביב דפוסי ECM (איור 11א).
שלבי הכביסה לא מספיקים או לא יעילים לאחר דגירה של חלבון יכול גם לגרום לרמות גבוהות של זריחה ברקע. זה יכול להיות נצפתה במיוחד על ידי שימוש בריכוזי חלבון של 10 μg/mL (איור 11ב) או גבוה יותר. עודף חלבון ברקע יכול להיות מופחת על ידי כולל שטיפת כביסה נוספת עם PBS.
הנוכחות של רקע חלבון צריך להיות נמדד ומאופיין בכל ניסוי, חישוב עוצמת הזריחה ברקע (איור 6E) והפחתת זה מן העוצמה מיקרו דפוסי (איור 6F-H ואיור 7ב, ד). רקע חלבון גבוה עלול להשפיע על הקובץ המצורף ולבלוב של תאי CAD, להתפשר על הפרשנות של תוצאות.
הפערים בין יחידות העיצוב היא בעיה נפוצה כאשר למשתמשים יש ניסיון מוגבל (איור 11ב'), המתרחשת כתוצאה מחפיפה לא מספקת בין תבניות. ניתן לכוונן שני פרמטרים בתוכנת לאונרדו כדי להתגבר על זה: 1) מרווח שלילי בין העמודות עשוי להידרש, בהתאם לעיצוב התבנית (שלב 5.7 וראה איור 5ב, ג). לחלופין, 2) השתמש באפשרות מעבר הצבע בתפריט מומחה כדי לתפור את העמודות. בדיקה מהירה כדי לקבוע את פרמטרי הריווח האופטימלי ניתן לבצע באמצעות דבק UV (טבלת חומרים). טיפה קטנה של דבק זה מוחל על שקופית זכוכית, אשר מכוסה לאחר מכן עם שמיכות זכוכית, עשיית סרט. דבק UV מוטבע הוא photopatterned עם תבנית דפוס של עניין באמצעות מינון לייזר נמוך (30 mJ/mm2). את האזורים החשופים של הדבק המוטבע ניתן לרפא ולהפוך לגלויים במיקרוסקופ שדה בהיר. תוצאות הבדיקה מדמיינו להעריך את המרווח המתקבל בתבנית. בניסויים העצביים שלנו, פער בין פסים עלול להשפיע לרעה על התנהגות התא, ולייצר וריאציות בדינמיקה של גדילה (מהירות מופחתת או נטישה של הנתיב).
בעדכון האחרון של התוכנה לאונרדו (בזמן הפרסום, לאונרדו 4.11), ניתן לטעון בעבר מתוכנן תבניות תבנית גדולה יותר המכסה שטח גדול הרבה יותר (עד 8 מ"מ2 באמצעות המטרה 20x) של משטח מיקרו-באר לעומת 0.1 mm הנוכחי2 לכל יחידת עיצוב, ביטול הצורך לתפור יחד את יחידות עיצוב קטן יותר. קצוות לא מוגדרים עלולים לנבוע מחוסר התאמה של מיקוד לייזר במהלך יצירת תבניות (איור 11ג). לכן חיוני לכייל את הלייזר ולבצע שלבי דפוס התייחסות (ראה שלב 4) לפני הדפוס. פסים מוגדרים לקוי התוצאה של וריאציות ברוחב פס, מה שהופך את הקורלציה בין דינמיקת הצמיחה אקסון ורוחב פסים קשה. Axons גם נוטים לנטוש פסים כי יש קצוות מתפזרת. בנוסף, השונות בקצוות ניתן למצוא גם בעת הדפסת פסים של 10-20 יקרומטר רוחב או גבוה יותר, וכתוצאה מכך תוכן חלבון גבוה יותר בקצוות בהשוואה לאזורים המרכזיים של התבנית (איור 6B, D). אפקט קצה זה מופק על-ידי דיפוזיה שאינה אחידה של יוזם התמונה במהלך תהליך פוטואטטרנינג. תגובת התמונות היא תלוית חמצן, אשר מפזרת יותר בקצוות. אפקט קצה זה יכול להיות ממוזער הומוגניזציה צילום-יוזם עם פיפטה ב מיקרו-גם במהלך התהליך photopatterning. יתר על כן, תמונה חדשה ממוסחר מחדש (ג'ל PLPP), יכול גם להפחית את אפקט הקצה (צוות התמיכה של מערכת פרימו, תקשורת אישית).
מיקרו-הדפסה של יותר מחלבון אחד יכול לגרום החוצה מחייב (איור 9א-ד). ניתן למזער זאת על-ידי הגברת היעילות החוסמת המשמשת לתפוס אתרי קשירה לא ספציפיים בין הצעדים הדגירה של שני החלבונים השונים. מחייב החוצה של חלבונים יכול לperturb בלתי מנוצח של תוצאות ניסיוני עלול להוביל וטעה של נתונים, מאז קשה לקבוע את התרומה של כל חלבון כדי הדינמיקה הצמיחה אקסון והתנהגויות תאים אחרים.
מסקנה אנו מקווים כי הפרוטוקול שסופקו באמצעות LIMAP מקלה על הדור של מיקרו תבניות חלבון באמצעות מערכת פרימו. בעוד הפרוטוקול שלנו מתמקד כיצד לייצר באופן אמין מיקרו דפוסים ב-2D משטחי זכוכית, אחרים הראו כי ניתן להשתמש LIMAP עבור מיקרו דפוס של מצעים רכים54, ומשטחים מובנים מיקרו עבור תרבויות תלת-ממד42. אלה מיקרו דפוסי יכול להיות כלי רב-תכליתי כדי ללמוד תגובות הסלולר שינויים במיקרו-סביבה שלהם.

בשנים האחרונות, המדע הביולוגי עשה יותר ויותר שימוש בהתקדמות שמספקת מדעי החומרים. דוגמה אחת בולטת היא המיקרו-מכשיר של מצעים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד תגובות סלולריות כגון הפצת תאים1,2, בידול3,4,מיכל 5,6, הגירת תאים7,8,9והפקודה הפתובה10,11. יש מספר טכניקות זמין המאפשרים את המיקרו-דפוס של מצעים, כגון פוטופוטון ההתרגשות רב-פוטכימיה12, AFM לטבול-עט ננוגרפיה13, סיכה והדפסה ישירה של הזרקת דיו14, הדפס קרן אלקטרונים15או מיקרופלואידיקה16. עם זאת, שתי טכניקות שבהן נעשה שימוש נרחב בשדה הביולוגי הן הדפסת מיקרומגע17,18,19או בעזרת מברק בעזרת לייזר3(איור 1). הדפוס בסיוע לייזר נחשב לספק תוצאות אמינות יותר במונחים של חלבון ו-יתד יציבות וכליאה התא על דפוסי, לעומת הדפסה microcontact20. גישה חדשנית יותר עבור מיקרו-הפנינג תיאר כאן הוא השימוש בספיחה מולקולרית המושרה של חלבונים21(LIMAP,איור 1 D) באמצעות מערכת זמינה מסחרית (פרימו,רשימת חומרים). לכל אחת מהשיטות יש יתרונות ומגבלות המתוארים להלן בקצרה. הדפסת מיקרומגע משתמשת בתבניות PDMS (בולים) עם מיקרו-תכונות הרצוי הנוצרות ממאסטרים ליטוגרף. בולים מודתמים עם חלבון נבחר אשר מועבר אז (חותמת) על מצע התרבות התא18(איור 1 קצת). מניקור באמצעות לייזר משתמש באור אולטרא סגול לקליב סרט אנטי-כסות22,23,24,25, חשיפת אזורים העשויים לאחר מכן להיות מצופים בחלבון הריבית (איור 1 B). בעוד שהרזולוציה הושגה עם גישות צילום, היא בטווח מיקרון25,26, רוב השיטות הללו דורשות מסכת צילום, במגע עם המדגם, או ממוקם במישור האובייקט של מטרת המיקרוסקופ23,27,28. הדרישות של מסיכות בהדפסה הן במיקרו-מגע והן בדפוס הצילום יכולות להיות מגבלה; מסיכות ספציפיות נדרשות עבור כל תבנית וגודל גיאומטריים, אשר עשוי להיות יקר וארוך זמן להפקת. בניגוד לטכניקות אלה, LIMAP אינו דורש מסכה (איור 1 D). שימוש במערכת פרימו עבור LIMAP יכול להיות אינטנסיבי בהתחלה, כי זה דורש רכישת ציוד. עם זאת, תוכנת קוד פתוח משמש לעיצוב דפוסים של כל הגיאומטריה הרצויה, מתן הרבה יותר חופש והתרת ניסויים מורכבים יותר כולל שימוש במעברי הצבע של ריכוז חלבונים. לייזר פרימו הוא נשלט ומכוון על ידי מכשיר micromirror הנשלט באופן דיגיטלי (DMD) כדי ליצור דפוסים בכל מספר של גיאומטריות מוגדרות על-ידי המשתמש. LIMAP דורש משטח התרבות להיות מצופה במולקולות המונעות מצורף לתא. פוליאתילן גליקול (יתד) הוא הנפוץ ביותר כגון "התרופה" מגיב; זה יוצר סרט צפוף נגד דבקים על משטח הזכוכית או הפלסטיק29. לאחר מכן, מאתחל תמונה מתווסף המאפשר את הסרט יתד להיות מוסר עם דיוק גבוה באמצעות מנגנון המספריים לצילום30על ידי חשיפה מקומית לאור UV תחת השליטה של DMD. אלה אזורים ללא יתד יכול להיות מצופה חלבונים כי ספוח לפני השטח חרוט לייזר, יצירת דפוס מיקרו. על ידי שינוי כוח הלייזר, כמויות שונות של יתד ניתן להסיר מן המשטח המאפשר למשתמש ליצור מעברי צבע חלבון. הסרת פג ואת ההליך ציפוי יכול לחזור ליצור דפוסים עם שניים או יותר חלבונים ברורים באותו מיקרו-באר21. מיקרו דפוסי שנוצר לספק משטחי דבק עבור תאים, המאפשר לימוד של התנהגות התא. במחקרים שלנו, אנו משתמשים מיקרו-העמקה כדי ללמוד neurite או אקסון החיפוש של קו התאים העצבי (CAD (כתיב) תאים הבדיל31) או החולדה הראשית השורש גנגליון (DRG) נוירונים, בהתאמה. כאן, אנו מתווה פרוטוקול צעד-אחר-צעד עבור LIMAP (איור 2) באמצעות מערכת פרימו הזמינה באופן מסחרי וליווי תוכנת לאונרדו. אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בו ליצירת דפוסים בעלי גיאומטריות מוגדרות ומספר חלבונים, שבהם אנו משתמשים כדי ללמוד את מציאת הדגם. אנו דנים בסוגיות נפוצות שיכולות להיווצר וכיצד ניתן להימנע מכך.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 488 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20173</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>8100805</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conjugated fibrinogen-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti inverted</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-Image J</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov" target="_blank">www.imagej.nih.gov</a></td>
			<td>Version 2.0.0-rc-54/1.51f</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent highlighter</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>Stabilo Boss Original</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Working concentration: 1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkscape software</td>
			<td>Inkscape</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-red fluorescent rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>LMN01</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>version 4.11</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager software</td>
			<td>Open imaging</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized x/y stage</td>
			<td>PRIOR Scientific</td>
			<td>Proscan II</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Working concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Stencils</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>visit <a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>Laysan bio, Inc.</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Working concentration: 50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176752</td>
			<td>Working concentration: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>Classic PLPP</td>
			<td>Working concentration: 14.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP gel)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>Working concentration: 4.76% diluted in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS (also distributed by Alv&#233;ole)</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/ProductLookup.html?ProdNo=P4707&amp;Brand=SIGMA">P4707</a></td>
			<td>Working concentration: 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo equipment</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122">15140122</a></td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-alpha antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>DM1A</td>
			<td>Working concentration: 1:1000 
			CAD cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-beta 3 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td>Working concentration: 1:500 
			DRG neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>no phase ring (check updated catalogue)</td>
			<td>Working concentration: N.A. 
			**Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alv&#233;ole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins

תאים חשים מגוון של רמזים לחילוץ, כולל הקומפוזיציה והגיאומטריה של מטריצה החילוץ, אשר מסונתז ושופצה על ידי התאים עצמם. כאן, אנו מציגים את השיטה של Adsorption מולקולרית אור המושרה של חלבונים (LIMAP) באמצעות מערכת פרימו כטכניקת הפנינג כדי לייצר מטריצה מיקרו בדוגמת מטריקס (ECM) מצעים באמצעות יחיד או שילוב של חלבונים. השיטה מאפשרת הדפסת תבניות ECM ברזולוציה של מיקרון עם מצוינות מעולה. אנו מספקים פרוטוקול צעד-אחר-צעד ומדגימים כיצד ניתן ליישם זאת כדי ללמוד את תהליכי האיתור העצבי. LIMAP יש יתרונות משמעותיים על פני שיטות הדפסה מיקרו הקיים במונחים של קלות הדפוס יותר מרכיב אחד ואת היכולת ליצור דפוס עם כל גאומטריה או הדרגתי. הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם ללמוד את התרומה של כמעט כל רכיב כימי כלפי הגורל התא התנהגות התא. לבסוף, אנו דנים בסוגיות נפוצות שיכולות להיווצר וכיצד ניתן להימנע מכך.

Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

המטרה הכללית שלנו היא להבין כיצד תאים התחושה מסחטות רמזים כי להוביל צמיחה סיבי מכוון. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה של adsorption מולקולרית המושרה אור של חלבונים, משמש כדי לייצר מיקרו דפוסים מוגדרים של מטריקס רכיבים מטריצות על מנת ללמוד אירועים ספציפיים השולטים אקסון הצמיחה ואת מציאת.

המושרה באור Adsorption מולקולרית של חלבונים באמצעות מערכת פרימו עבור מיקרו הפנינג כדי ללמוד התגובות לתא מטריצות חלבונים מטריקס

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

מיקרו-דפוס הוא כלי רב עוצמה משום שהוא מאפשר ללמוד תגובות תאיות כדי להגדיר אותות ביוכימיים וביופיזיים שתאים נתקלים באורגניזמים חיים. בניגוד לשיטות אחרות, המתואר הוא גמיש יותר עבור יצירת דפוס. לדוגמה, הוא מאפשר ייצור של מעברי צבע ומיקרו-דפוסים של חלבונים מרובים עם רבייה גבוהה.הקבוצה שלנו משתמשת ב- LIMAP לא רק כדי לחקור את התוואי העצבי, אלא גם כיצד תאים אחרים מגיבים לאותות המשפיעים על התפשטות התאים, ההתמדה והנדידה. מיקרו-תבנית משמשת למענה על שאלות בסיסיות בביולוגיה של התא. הידע שנצבר יכול לשמש לשינוי מכשירים קיימים ברפואה רגנרטיבית, למשל, תיקון עצבים לאחר פגיעה עצבית היקפית.התחל בעיצוב תבניות עבור תבניות בתוכנות ציור דיגיטליות. בחר גודל תמונה של 1, 824 פיקסלים אורך ו 1, 140 פיקסלים ברוחב. עצב את התבנית ושמור את התבנית כקובץ TIFF של 8 סיביות.לפני דפוס, לנקות ולהפעיל את פני השטח עם מנקה פלזמה באמצעות לחץ תהליך של 1, 000 כדי 1, 300 millitorr ו כוח של 29.6 וואט במשך 1 עד 5 דקות. השתמש בצלחת תחתית זכוכית עם גודל באר פנימי 20 מ"מ ועובי זכוכית של 0.16 עד 0.19 מילימטרים. בחר גם שש באר או מנה אחת טובה, בהתאם למספר התנאים שנבדקו.חותכים את סטנסילי PDMS בתנאים סטריליים כדי להבטיח שהם מתאימים היטב לתחתית הזכוכית הפנימית. הסר את סתימות microwell הפנימי עם מדפים סטריליים, ולתקוע את stencils על הזכוכית היטב. הכינו פתרון PLL-PEG של 0.1 מיליגרם למיליליטר ב-PBS, והוסיפו 20 מיקרוליטרים לכל מיקרווול.לאחר מכן, הדגירה את המנה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, הסר 15 מיקרוליטרים של ה- PLL-PEG מכל באר, ושטוף אותו חמש פעמים עם 20 מיקרוליטרים של PBS מבלי לתת לו להתייבש. הכן מיקרווול אחד כדי ליצור דפוס התייחסות על ידי הסרת 18 microliters של PBS מ באר אחת והוספת חמישה microliters של photoinitiator, עוזב PBS במיקרווולים הנותרים.לאחר מכן, השתמשו בסמן פלואורסצנטי כדי לסמן היטב פנימית ריקה. מקם את הרבה מעל המטרה, ולהתאים את המיקוד האובייקטיבי עד הלוגו PRIMO ואת התגית לטפל בתאים שלך". לאחר מכן, רשום את מיקום Z של מישור המוקד.ליצירת תבנית ייחוס, דמיינו את קצה המיקרווול בעזרת הפוטיניטיאטור באמצעות האור המשודר דרך המצלמה, ובחרו את סמל ה-ROI מהתפריט הימני. בחר PRIMO כדי להעלות את תבנית התבנית הרצויה, אשר תוקרן על ROI כיחידה עיצובית. נווט לאזור היקפי במיקרווול, בחר נעל והתאם את המוקד למיקום הכיול Z.לאחר מכן, בחר הפעל כדי להתחיל לצלם את תבנית ההפניה. לשטוף את דפוס הייחוס microwell שלוש פעמים עם 20 microliters של PBS כדי להסיר את photoinitiator. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של מטריצה חוץ-תאית עם תווית פלואורסצנטית, או ECM, תווי חלבון.הדגירה את המנה בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 20 דקות, הקפד להגן על הייחוס היטב מפני אור. לאחר הדגירה, להסיר 18 microliters של פתרון חלבון, ולשטוף את הטוב שלוש פעמים עם 20 microliters של PBS. השתמש במיקרוסקופ epifluorescence כדי לדמיין את תבנית הייחוס.התאימו את המיקוד על קצות דוגמת המילוי דרך נתיב המצלמה והקליטו את מיקום Z בהתאם למוקד הטוב ביותר. מיקום זה יהיה מוקד הלייזר האופטימלי המשמש לדפוסים הבאים. בתנאים סטריליים, הסר 18 מיקרוליטרים של PBS מכל המיקרווולים.הוסף חמישה microliters של photoinitiator לכל באר, הומוגניזציה על ידי צינורות למעלה ולמטה. אם אתם יוצרים תבניות של מספר חלבונים באותו מיקרווול, העלו את כל ערכות תבניות הדפוס הרצויות בו-זמנית. לאחר מכן, בחר את מספר השורות, העמודות והמינון.שמור את תצורת התבנית כקובץ בתוכנה. נווט לאזור שבו נוצרה תבנית ההפניה והתאם את המוקד למיקום Z האופטימלי. לאחר מכן, בחר הפעל כדי ליזום צילום.יחידות העיצוב הופכות מעתום לכחול עם השלמת הצילום. הסר את photoinitiator מן microwells על ידי שטיפת אותם שלוש פעמים עם 20 microliters של PBS. לאחר הכביסה האחרונה, להסיר 18 microliters של PBS מכל microwell, ולהוסיף 20 microliters של פתרון חלבון ECM.הדגירה את המנה בטמפרטורת החדר במשך 20 עד 30 דקות, הקפד להגן עליו מפני אור. לאחר מכן, הסר 15 מיקרוליטרים של פתרון החלבון ECM, ושטף את המיקרווולים שלוש פעמים באמצעות 20 מיקרוליטרים של PBS. כדי למנוע כריכה צולבת, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של PLL-PEG, או BSA, למיקרווולים, והדקירה את המנה בטמפרטורת החדר למשך שעה, בחושך.לאחר מכן, להסיר 15 microliters של סוכן החסימה, ולשטוף את כל microwells שלוש פעמים עם 20 microliters של PBS. הסר 18 microliters של PBS, ולהוסיף 5 microliters של photoinitiator לכל microwell, להבטיח כי photoinitiator הוא הומוגני על כל פני השטח של microwells. נווט אל המיקרווול הראשון וטען את תצורת התבנית שנשמרה קודם לכן.לאחר מכן, בחר את הפעולות שיש לדפוס עבור הסיבוב השני של פוטופטרנינג, הקפד לבטל את הבחירה בפעולות מהסיבוב הראשון. לאחר photopatterning, להסיר PLPP על ידי שטיפה עם PBS. לאחר מכן, דגירה במשך 20 דקות עם פתרון חלבון ECM השני, ולשטוף את microwells שלוש פעמים עם 20 microliters של PBS.השתמש במיקרוסקופ epifluorescence כדי לדמיין ולדמיין את התבניות המודפסות. כאשר מוכן צלחת התאים, להוסיף מיליליטר אחד של מדיום עם תאים לזכוכית הפנימית היטב, הקפד לכסות את כל microwells. ולמקום את צלחת התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור.על מנת להבטיח כי הדפוסים שנוצרו הם ייצוג מדויק של התבנית, מדידות עוצמת פלואורסצנטי מתקבלות לאורך הפסים, ומ מאזור רקע מתאים מעל כל פס. תבניות מיקרו מוגדרות לשחזור מושגות ברוחב שבין 20 ל-2 מיקרומטרים, אך ניתן לראות אפקט קצה בעת הדפסת תכונות של 20 מיקרומטר או רחב יותר. ריכוזי חלבון מוגדרים מתקבלים על ידי דגירה עם ריכוזים משתנים של חלבון, או שינוי מינון הלייזר המשמש כדי לחשוף את הסרט antiadhesive.עוצמת הלייזר פרופורציונלית לרמת גווני האפור של התבנית, ויוצרת מעברי צבע של תאורת UV. המדידה של פרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך פס מעבר הצבע, היא ליניארית בתבנית התבנית, ובדוגמת מעבר הצבע שנוצרה. פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת מיקרו-דפוסים עם חלבונים מרובים באותו מיקרווול, כגון דפוסי צלב עם פסים אופקיים של פיברונקין, ופסים אנכיים של למינין.אבל צעד חסימה יש צורך למנוע הצלבה של חלבונים. דפוסי הצלב שנוצר יכול לשמש לאחר מכן עבור assays הסלולר עם קווי תאים עצביים, או תאי CAD, או נוירונים ראשוניים, עכברוש DRGs. בעת ביצוע פרוטוקול זה, ההיבטים החשובים ביותר שיש לזכור הם ביצוע כיול מערכת תקין, לא לתת microwells להתייבש במהלך שלבי הכביסה מרובים, ושימוש בפרמטרים הנכונים עבור דגירה וחסימה של חלבון.ניתוח של התנהגות התא בדרך כלל כרוך מיקרוסקופיה, כגון פלואורסצנטיות, זמן לשגות, AFM. אפיון נוסף יכול לכלול שיטות ביוכימיות אחרות, כגון פרופיל ביטוי גנים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

באמצעות גישה המינים השוואתי לחקירת לנוירוביולוגיה התגובות של אבי האב

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

בידוד של CA1 גרעיני שברים מועשרים מSlices בהיפוקמפוס לחקר פעילות תלויה גרעיני יבוא של חלבונים Messenger synapto-גרעיניים

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

שימוש בערוצי Agarose לינארית ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; התנהגות זחל זחילה

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

אין ויוו Microdialysis שיטת איסוף גדול חלבונים חוץ-תאית נוזל בין-תאי המוח עם משקל מולקולרי גבוה ניתוק רגשים

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...