Name: light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins
Uploaded: 2019-10-11T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

Questo lavoro è supportato da BBSRC, EPSRC, MRC e Wellcome Trust. Il laboratorio C.B. fa parte del Wellcome Trust Centre for Cell-Matrix research, University of Manchester, che è supportato da finanziamenti di base del Wellcome Trust (numero di sovvenzione 088785 / s /09 / s). Gli autori desiderano riconoscere i finanziamenti forniti dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) a C.M., K.J. (BB/M020630/1) e P.A. (BB/P000681/1) e dal Consiglio di ricerca sull'ingegneria e le scienze fisiche (EPSRC) e dal Medical Sciences Research Council (EPSRC) e Medical Consiglio di ricerca (MRC) Centro di formazione di dottorato in medicina rigenerativa ad A.K. (EP/L014904/1). Gli autori ringraziano Alvéole per la loro corrispondenza e il loro team di supporto post-vendita. Gli autori ringraziano Peter March e Roger Meadows dell'Università di Manchester per il loro aiuto con la microscopia. I microscopi per la Bioimaging Facility utilizzati in questo studio sono stati acquistati con sovvenzioni da BBSRC, Wellcome Trust e dal Fondo strategico dell'Università di Manchester.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Vantaggi del micromodellamento LIMAP (PRIMO) e confronto con la stampa a microcontatto Mentre la stampa a microcontatto è forse la tecnica di micro-patterning più comunemente utilizzata nel campo biologico39, sembra che ci sia un numero crescente di ricercatori che utilizzano la tecnologia LIMAP40,41,42 ,43,44. Qui abbiamo presentato un protocollo utilizzando PRIMO, un sistema disponibile in commercio per LIMAP. Di seguito discutiamo brevemente i potenziali vantaggi e limitazioni della stampa di microcontatti e del fotopattern LIMAP.
La stampa a microcontatto richiede maestri litografici prodotti dal rivestimento a forma di spin di una fotomaschera (generalmente SU-8) su un wafer di vetro o silicio, che viene poi inciso al laser con le micro-caratteristiche desiderate. Questi master vengono utilizzati come modelli per creare un timbro PDMS45. Il francobollo viene incubato con una proteina prescelta che adsorbe ad esso, e viene poi trasferito (stampato) sul piatto di coltura cellulare. Il processo di adsorbimento della proteina al timbro PDMS dipende dalla concentrazione di proteine, dal tampone e dal tempo di incubazione. Questi parametri devono essere testati in anticipo per ottenere risultati ottimali46.
I maestri possono essere utilizzati in un numero considerevole di esperimenti, della durata di mesi o addirittura anni, se conservati correttamente. Tuttavia, un fattore limitante di questa tecnologia è la necessità di riprogettare nuovi maestri litografati per ogni modifica desiderata. I cambiamenti nei progetti sperimentali possono comportare una produzione di tempo di nuovi maestri (fino a diverse settimane) ritardando così gli esperimenti. In confronto, il fotomodellamento LIMAP non richiede un master fisico; utilizza modelli di pattern generati da software che possono essere utilizzati per adattare in modo flessibile le geometrie desiderate dei micromodelli alle mutevoli domande di ricerca. LIMAP può essere utilizzato anche per generare gradienti proteici all'interno dello stesso micro-modello (Figura 8), che è più difficile da ottenere in modo riproducibile utilizzando la stampa microcontatto47.
Inoltre, la risoluzione del micromodello ottenuta con LIMAP, nel nostro caso, è di 2 m (Figura 6B).
L'avvicinamento a questa risoluzione ha aumentato la variabilità intra e inter-modello. La generazione di modelli intorno o superiore a 10 m di larghezza era altamente riproducibile (Figura 6G,H). Al contrario, con la stampa a microcontatto è difficile ottenere costantemente risoluzioni inferiori a 10 m ed è comune trovare artefatti quando si stampano piccole caratteristiche (dati non mostrati).
Abbiamo dimostrato che LIMAP può essere utilizzato per micro-modello più proteine (Figura 9) all'interno dello stesso micro-pozzo, consentendo ulteriori livelli di complessità da aggiungere agli esperimenti. Anche se questo potrebbe essere ottenuto con la stampa a microcontatto, allineare diverse proteine con un alto livello di precisione può essere tecnicamente piuttosto impegnativo. Mentre la modellazione di più proteine utilizzando LIMAP sembra dritto in avanti, è importante ricordare che il cross-binding delle proteine attraverso procedure di rivestimento sequenziale può essere ridotto attraverso il blocco di reagenti, ma non del tutto eliminato (Figura 9).
Per quanto riguarda il costo di una o l'altra tecnica, LIMAP come descritto qui richiede l'acquisto di apparecchiature di micro-patterning (PRIMO) che possono essere installate su diversi microscopi a fluorescenza e richiedono una fase motorizzata. Anche se questo investimento è inizialmente dispendioso in termini di costi, al lungo periodo non sono previsti acquisti aggiuntivi oltre agli articoli di consumo (stencil, PEG e PLPP) associati a LIMAP. In alternativa, gli stencil PDMS possono essere prodotti anche in laboratorio dal proprio sperimentatore seguendo i protocolli pubblicati18,32. I maggiori costi per la stampa di microcontatti possono essere associati alla produzione di nuovi maestri, che possono diventare notevoli se gli esperimenti richiedono nuovi modelli.
Uno svantaggio di LIMAP è l'approccio relativamente basso throughput di questa tecnica. La stampa a microcontatto è in grado di produrre un gran numero di micromodelli in modo rapido ed efficiente in una fase di stampaggio simultanea, rispetto alla micro-modellazione laser sequenziale richiesta con LIMAP. Ad esempio, è possibile produrre 6 coperture in vetro stampatoin obiscante in circa 2 h con stampa a microcontatto utilizzando francobolli PDMS (esclusa la preparazione dei francobolli); la modellazione di un'area simile (piatto di 6 pozze) con LIMAP richiederebbe circa 4 h, escludendo la procedura di passività della superficie (considerando la configurazione del modello di modello descritta nel passaggio 5.12 e vedere la figura 5B).
Un altro fattore di limitazione della velocità della tecnologia LIMAP è il lungo tempo di illuminazione necessario per la modellazione di grandi aree (30 s per unità di progettazione con un laser da 7,5 mW/mm2). In questi casi, la stampa di microcontatto potrebbe essere un'opzione preferita. Un nuovo foto-initiator (PLPP gel, Table of Materials) dovrebbe ridurre notevolmente il tempo impiegato per la modellazione, consentendo la generazione di centinaia di micro-modelli in grandi aree (fino a 8 mm2) in pochi minuti.
Un altro fattore importante da prendere in considerazione quando le superfici di micro-patterning per la coltura cellulare è la riproducibilità dei micromodelli tra diverse ripetizioni sperimentali, rispetto alla variabilità ottenuta con la stampa a microcontatto. Ad esempio, i grafici illustrati nella Figura 7B,D sono dati rappresentativi di tre ripetizioni sperimentali indipendenti con risultati molto simili (dati non mostrati). Sulla base della nostra esperienza e delle pubblicazioni precedenti, questo livello di riproducibilità è difficile da raggiungere con la stampa microcontatto48,49,50,51,52.
A differenza di altre tecniche di fotomodellamento che richiedono chimica dedicata per progettare materiali fotosensibili o l'uso di fotosensibilizzanti, che sono generalmente non molto biocompatibili3, la componente fotosensibile di LIMAP (PLPP ) è biocompatibile e ben tollerato dalle cellule21; nelle nostre mani non abbiamo sperimentato alcuna citotossicità in una varietà di cellule, tra cui CAD, neuroni DRG (Figura 10), fibroblasti, cellule epiteliali e cellule melanoma (dati non mostrati). Un altro vantaggio di LIMAP utilizzando PRIMO rispetto ad altre tecniche di foto-patterning è che non è necessaria alcuna fotomaschera. Simile alla stampa di microcontatti, nuove fotomaschere dovrebbero essere progettate e generate per ogni modello desiderato.
Tutte le limitazioni di cui sopra per la stampa microcontatto, si riferiscono all'approccio manuale della tecnica. Tuttavia, è possibile migliorare la produttività e la riproducibilità della stampa di microcontatto utilizzando un dispositivo automatizzato con carico del timbro e controllo della pressione53.
Passaggi chiave del protocollo e risoluzione dei problemi per LIMAP utilizzando PRIMO Uno dei problemi più comuni riscontrati durante questo protocollo è avere alti livelli di fluorescenza di fondo all'interno dei micro-modelli. Ciò può essere dovuto all'essiccazione di micro-pozzi che spesso si verifica a causa del loro piccolo volume. In questo caso, i cristalli PBS spesso appaiono intorno ai modelli ECM (Figura 11A).
Passaggi di lavaggio insufficienti o inefficienti dopo l'incubazione delle proteine possono anche provocare alti livelli di fluorescenza di fondo. Ciò può essere osservato in particolare con l'utilizzo di concentrazioni proteiche di 10 g/mL (Figura 11B) o superiore. L'eccesso di proteine sullo sfondo può essere ridotto includendo ulteriori passaggi di lavaggio con PBS.
La presenza di fondo proteico deve essere misurata e caratterizzata in ogni esperimento, calcolando l'intensità della fluorescenza di fondo (Figura 6E) e sottraendola dall'intensità dei micromodelli (Figura 6F-H e Figura 7B,D). Un elevato scarico proteico può avere un impatto sull'attaccamento e sulla germogliazione delle cellule CAD, compromettendo l'interpretazione dei risultati.
Avere spazi tra le unità di progettazione è un problema comune quando gli utenti hanno un'esperienza limitata (Figura 11B), che si verifica a causa di una sovrapposizione insufficiente tra i modelli. Due parametri nel software Leonardo possono essere regolati per superare questo: 1) una spaziatura negativa tra le colonne può essere richiesto, a seconda della progettazione del modello (passaggio 5.7 e vedere Figura 5B,C). In alternativa, 2) utilizzare l'opzione sfumatura nel menu Esperto per cucire le colonne. Un test rapido per determinare i parametri di spaziatura ottimali può essere eseguito utilizzando l'adesivo UV (Tabella dei materiali). Una piccola goccia di questo adesivo viene applicata a uno scivolo di vetro, che viene poi coperto con una vetrina di vetro, facendo un film. L'adesivo UV incorporato è fotografato con il modello modello di interesse utilizzando una dose laser bassa (30 mJ/mm2). Le regioni esposte ai raggi UV dell'adesivo incorporato saranno curate, diventando visibili sotto microscopia a campo luminoso. I risultati del test vengono visualizzati per valutare la spaziatura ottenuta all'interno del modello. Nei nostri esperimenti neuronali, un divario tra le strisce può influenzare negativamente il comportamento cellulare, producendo variazioni nelle dinamiche di crescita (sia a velocità ridotta che all'abbandono del percorso).
Nell'ultimo aggiornamento del software Leonardo (al momento della pubblicazione, Leonardo 4.11), è possibile caricare modelli di pattern più grandi progettati in precedenza che coprono un'area molto più grande (fino a 8 mm2 utilizzando l'obiettivo 20X) della superficie del micro-pozzo rispetto all'attuale 0,1 mm2 per unità di progettazione, eliminando la necessità di unire le unità di design più piccole. I bordi non definiti possono derivare da una mancanza di regolazione della messa a fuoco laser durante la generazione del modello (Figura 11C). È quindi fondamentale calibrare il laser ed eseguire i passaggi del modello di riferimento (vedere il passaggio 4) prima della modellazione. Strisce scarsamente definite si traducono in variazioni nella larghezza delle strisce, rendendo difficile la correlazione tra le dinamiche di crescita degli assoni e la larghezza delle strisce. Gli assoni tendono anche ad abbandonare le strisce che hanno bordi diffusi. Inoltre, la variabilità dei bordi può essere riscontrata anche quando si stampano strisce di 10-20 m di larghezza o superiore, con conseguente un contenuto proteico più elevato ai bordi rispetto alle regioni centrali del modello (Figura 6B,D). Questo effetto bordo è prodotto da una diffusione non omogenea del foto-initiator durante il processo di fotomodellazione. La reazione di fotocissione dipende dall'ossigeno, che si diffonde maggiormente ai bordi. Questo effetto bordo può essere ridotto al minimo omogeneizzando il foto-introiatore con una pipetta nel micro-pozzo durante il processo di fotomodellazione. Inoltre, un nuovo foto-introcorso commercializzato (gel PLPP), può anche ridurre l'effetto bordo (team di supporto del sistema PRIMO, comunicazione personale).
La microstampa di più di una proteina può provocare un incrocio (Figura 9A-D). Questo può essere ridotto al minimo aumentando l'efficienza di blocco che viene utilizzato per occupare siti di legame non specifici tra le fasi di incubazione per le due diverse proteine. Il legame incrociato delle proteine può perturbare la riproducibilità dei risultati sperimentali e può portare a un'errata interpretazione dei dati, poiché è difficile determinare il contributo di ciascuna proteina alle dinamiche di crescita degli assoni e ad altri comportamenti cellulari.
conclusione f Ci auguriamo che il protocollo fornito utilizzando LIMAP faciliti la generazione di micro-modelli proteici attraverso l'uso del sistema PRIMO. Mentre il nostro protocollo si concentra su come produrre in modo affidabile micro-modelli in superfici di vetro 2D, altri hanno dimostrato che è possibile utilizzare LIMAP per micro-patterning di substrati morbidi54, e superfici microstrutturate per le colture 3D42. Questi micromodelli possono essere uno strumento versatile per studiare le risposte cellulari ai cambiamenti nel loro micro-ambiente.

Negli ultimi anni, le scienze biologiche hanno sempre più fatto uso dei progressi forniti dalle scienze dei materiali. Un esempio importante è il micropatterning dei substrati, che può essere utilizzato per studiare le risposte cellulari come la proliferazione cellulare1,2Differenziazione3,4,5,6, migrazione cellulare7,8,9e la ricerca del percorso10,11. Ci sono una serie di tecniche disponibili che consentono il micro-patterning dei substrati, come la fotochimica eccitata multifotone12, nanolitografia a2-penna AFM13, stampa diretta per pin e getto d'inchiostro14, litografia a fascio di elettroni15o microfluidica16. Tuttavia, due tecniche ampiamente utilizzate in campo biologico sono la stampa di microcontatti17,18,19o patterning assistiti da laser3(Figura 1). La modellazione assistita da laser è considerata per fornire risultati più affidabili in termini di stabilità di proteine e PEG e confinamento cellulare sui modelli, rispetto alla stampa a microcontatto20. Un approccio più nuovo per il micro-modello descritto qui è l'uso di adsorbimento molecolare indotta dalla luce delle proteine21(LIMAP,Figura 1 d) utilizzando un sistema disponibile in commercio (PRIMO,Tabella dei materiali). Ognuno dei metodi presenta vantaggi e limitazioni descritti brevemente di seguito. La stampa microcontact utilizza stampi PDMS (timbri) con le microcaratteristiche desiderate generate da master litografati. I francobolli vengono incubati con una proteina prescelta che viene poi trasferita (stampata) sul substrato di coltura cellulare18(Figura 1 un). La patterning assistita da laser utilizza la luce UV per fendere una pellicola anti-fouling22,23,24,25, esponendo regioni che possono essere successivamente rivestite con la proteina di interesse (Figura 1 B). Mentre la risoluzione ottenuta con approcci foto-patterning è nella gamma micron25,26, la maggior parte di queste tecniche richiede una fotomaschera, sia a contatto con il campione, sia situata nel piano oggetto dell'obiettivo del microscopio23,27,28. I requisiti per le maschere sia nella stampa microcontatto che nella foto-patterning possono essere una limitazione; sono necessarie maschere specifiche per ogni motivo geometrico e dimensione, che può essere costoso e richiedere molto tempo per generare. A differenza di queste tecniche, LIMAP non richiede una maschera (Figura 1 d). L'utilizzo del sistema PRIMO per LIMAP può richiedere costi all'inizio perché richiede l'acquisto di attrezzature. Tuttavia, il software open-source viene utilizzato per progettare modelli di qualsiasi geometria desiderata, dando molta più libertà e consentendo esperimenti più complessi, tra cui l'uso di gradienti di concentrazione proteica. Il laser PRIMO è controllato e diretto da un dispositivo a microspecchio a controllo digitale (DMD) per creare modelli in un numero qualsiasi di geometrie definite dall'utente. LIMAP richiede che la superficie di coltura sia rivestita con molecole che impediscono l'attaccamento cellulare. Il glicole in polietilene (PEG) è più comunemente usato come tale reagente "antifouling"; forma una densa pellicola anti-adesiva sulla superficie di vetro o plastica29. Successivamente, viene aggiunto un foto-intatore che consente di rimuovere la pellicola PEG con alta precisione attraverso un meccanismo di fotocissione30dall'esposizione locale alla luce UV sotto il controllo del DMD. Queste regioni prive di PEG possono essere rivestite con proteine che assorbenano alla superficie incisa al laser, generando un micro-modello. Variando la potenza laser, diverse quantità di PEG possono essere rimosse dalla superficie consentendo all'utente di generare gradienti proteici. La rimozione del PEG e la procedura di rivestimento possono essere ripetute per creare modelli con due o più proteine distinte nello stesso micro-pozzo21. I micromodelli generati forniscono superfici adesive per le cellule, consentendo lo studio del comportamento cellulare. Nei nostri studi, utilizziamo micro-patterning per studiare il percorso neurite o assone di una linea cellulare neuronale (CAD (Cathecholaminergic-a differenziato) cellule31) o i neuroni primari del ganglio della radice dorsale-rata (DRG), rispettivamente. In questo articolo viene descritto un protocollo passo-passo per LIMAP (Figura 2) utilizzando il sistema PRIMO disponibile in commercio e il relativo software Leonardo. Dimostriamo come può essere utilizzato per la generazione di modelli con geometrie definite e proteine multiple, che usiamo per studiare la ricerca del percorso assonale. Discutiamo di questioni comuni che possono sorgere e di come queste possano essere evitate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 488 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20173</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>8100805</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conjugated fibrinogen-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti inverted</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-Image J</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov" target="_blank">www.imagej.nih.gov</a></td>
			<td>Version 2.0.0-rc-54/1.51f</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent highlighter</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>Stabilo Boss Original</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Working concentration: 1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkscape software</td>
			<td>Inkscape</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-red fluorescent rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>LMN01</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>version 4.11</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager software</td>
			<td>Open imaging</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized x/y stage</td>
			<td>PRIOR Scientific</td>
			<td>Proscan II</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Working concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Stencils</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>visit <a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>Laysan bio, Inc.</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Working concentration: 50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176752</td>
			<td>Working concentration: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>Classic PLPP</td>
			<td>Working concentration: 14.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP gel)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>Working concentration: 4.76% diluted in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS (also distributed by Alv&#233;ole)</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/ProductLookup.html?ProdNo=P4707&amp;Brand=SIGMA">P4707</a></td>
			<td>Working concentration: 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo equipment</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122">15140122</a></td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-alpha antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>DM1A</td>
			<td>Working concentration: 1:1000 
			CAD cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-beta 3 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td>Working concentration: 1:500 
			DRG neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>no phase ring (check updated catalogue)</td>
			<td>Working concentration: N.A. 
			**Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alv&#233;ole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins

Le cellule percepiscono una varietà di segnali extracellulari, tra cui la composizione e la geometria della matrice extracellulare, che viene sintetizzata e rimodellata dalle cellule stesse. Qui, presentiamo il metodo di adsortioni molecolari indotti dalla luce delle proteine (LIMAP) utilizzando il sistema PRIMO come tecnica di modellazione per produrre substrati esmatici a matrice extracellulare (ECM) micromodellati utilizzando una singola o combinazione di proteine. Il metodo consente la stampa di modelli ECM in risoluzione micron con eccellente riproducibilità. Forniamo un protocollo passo-passo e dimostriamo come questo può essere applicato per studiare i processi di ricerca del percorso neuronale. LIMAP presenta vantaggi significativi rispetto ai metodi di microstampa esistenti in termini di facilità di modellazione di più componenti e la possibilità di generare un modello con qualsiasi geometria o gradiente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare il contributo di quasi tutte le componenti chimiche verso il destino cellulare e il comportamento cellulare. Infine, discutiamo di questioni comuni che possono sorgere e di come queste possano essere evitate.

Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Il nostro obiettivo generale è quello di capire come le cellule percepiscono segnali extracellulari che portano alla crescita assonale diretta. Qui, descriviamo la metodologia dell'adsordimento molecolare delle proteine indotta dalla luce, utilizzata per produrre micromodelli definiti di componenti della matrice extracellulare al fine di studiare eventi specifici che regolano la crescita degli assoni e la ricerca del percorso.

Adsordimento molecolare indotto dalla luce delle proteine utilizzando il sistema PRIMO per micro-patterning per studiare le risposte cellulari alle proteine a matrice extracellulare

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Il micro-patterning è uno strumento molto potente perché consente di studiare le risposte cellulari per definire segnali biochimici e biofisici che le cellule incontrano negli organismi viventi. A differenza di altri metodi, il descritto è più flessibile per la generazione di modelli. Ad esempio, consente la produzione di gradienti e micro-pattern di più proteine ad alta riproducibilità.Il nostro gruppo utilizza limap non solo per studiare la ricerca del percorso neuronale, ma anche come altre cellule rispondono a segnali che hanno influenza sulla proliferazione, differenziazione e migrazione cellulare. Il micro-patterning è usato per rispondere a domande fondamentali in biologia cellulare. Le conoscenze acquisite possono essere utilizzate per modificare i dispositivi esistenti in medicina rigenerativa, ad esempio la riparazione dei nervi dopo la lesione del nervo periferico.Inizia progettando modelli per la creazione di modelli su software di disegno digitale. Selezionare una dimensione dell'immagine di 1.824 pixel di lunghezza e 1.140 pixel di larghezza. Progettare il modello e salvarlo come file TIFF a 8 bit.Prima di modellare, pulire e attivare la superficie con un detergente al plasma utilizzando una pressione di processo da 1.000 a 1.300 millitorr e una potenza di 29,6 watt per uno o cinque minuti. Utilizzare un piatto con fondo di vetro con dimensioni del pozzo interno di 20 millimetri e spessore del vetro da 0,16 a 0,19 millimetri. Selezionare un piatto a sei o un singolo pozzo, a seconda del numero di condizioni testate.Tagliare gli stencil PDMS in condizioni sterili per assicurarsi che si adattino bene al fondo interno del vetro. Rimuovere le otturazioni interne del microwell con forcep sterili e attaccare bene gli stencil sul vetro. Preparare una soluzione PLL-PEG da 0,1 milligrammi per millilitro in PBS e aggiungere 20 microlitri a ciascun microwell.Quindi, incubare il piatto a temperatura ambiente per un'ora. Dopo l'incubazione, rimuovere 15 microlitri del PLL-PEG da ogni pozzo e lavarlo cinque volte con 20 microlitri di PBS senza lasciarlo asciugare. Preparare un microwell per creare un modello di riferimento rimuovendo 18 microlitri di PBS da un singolo pozzo e aggiungendo cinque microlitri di fotoiniziatore, lasciando PBS nei microlitri rimanenti.Quindi, utilizzare un evidenziatore fluorescente per contrassegnare bene un vetro interno vuoto. Posiziona il pozzo al di sopra dell'obiettivo e regola la messa a fuoco oggettiva fino a quando il logo PRIMO e lo slogan non si prendono cura delle tue cellule"sono a fuoco. Quindi, registrare la posizione Z del piano focale.Per creare un motivo di riferimento, visualizzare il bordo del microwell con il fotoiniziore utilizzando la luce trasmessa attraverso la fotocamera e scegliere il simbolo ROI dal menu di destra. Selezionare PRIMO per caricare il modello di modello desiderato, che verrà proiettato sul ROI come unità di progettazione. Passare a una regione periferica del microwell, selezionare Blocca e regolare la messa a fuoco nella posizione Z di calibrazione.Quindi, selezionate Riproduci (Play) per iniziare a creare una serie fotografica del modello di riferimento. Lavare il microwell del modello di riferimento tre volte con 20 microlitri di PBS per rimuovere il fotoiniziore. Quindi, aggiungere 20 microlitri di matrice extracellulare etichettata fluorescentmente, o ECM, soluzione proteica.Incubare il piatto a temperatura ambiente per 10-20 minuti, assicurandosi di proteggere bene il riferimento dalla luce. Dopo l'incubazione, rimuovere 18 microlitri di soluzione proteica e lavare il pozzo tre volte con 20 microlitri di PBS. Utilizzare un microscopio a epifluorescenza per visualizzare il modello di riferimento.Regolare la messa a fuoco sui bordi del motivo attraverso il percorso della fotocamera e registrare la posizione Z in base alla messa a fuoco migliore. Questa posizione sarà la messa a fuoco laser ottimale utilizzata per la successiva creazione di modelli. In condizioni sterili, rimuovere 18 microlitri di PBS da tutti i microlitri.Aggiungere cinque microlitri del fotoinizionte a ciascun pozzo e omogeneizzare pipettando su e giù. Se si modellano più proteine nello stesso microwell, caricare contemporaneamente tutti i set di modelli desiderati. Quindi, selezionare il numero di righe, colonne e dose.Salvare la configurazione del modello come file nel software. Passare all'area in cui è stato prodotto il modello di riferimento e regolare la messa a fuoco nella posizione Z ottimale. Quindi, selezionate Riproduci (Play) per avviare la photopatterning.Le unità di progettazione diventano dal rosso al blu al completamento della fotopatterning. Rimuovere il fotoinizio dal microwell lavandoli tre volte con 20 microlitri di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere 18 microlitri di PBS da ogni microwell e aggiungere 20 microlitri di soluzione proteica ECM.Incubare il piatto a temperatura ambiente per 20-30 minuti, assicurandosi di proteggerlo dalla luce. Successivamente, rimuovere 15 microlitri della soluzione proteica ECM e lavare i microlitri tre volte utilizzando 20 microlitri di PBS. Per evitare il cross-binding, aggiungere 20 microlitri di PLL-PEG, o BSA, ai microwell e incubare il piatto a temperatura ambiente per un'ora, al buio.Quindi, rimuovere 15 microlitri dell'agente bloccante e lavare tutti i microlitri tre volte con 20 microlitri di PBS. Rimuovere 18 microlitri di PBS e aggiungere 5 microlitri del fotoiniziore a ciascun microwell, assicurando che il fotoiniziore sia omogeneo su tutta la superficie dei microlitri. Passare al primo microwell e caricare la configurazione del modello salvata in precedenza.Quindi, selezionate le azioni da modellare per il secondo ciclo di photopatterning, assicurandovi di deselezionare le azioni dal primo round. Dopo la fotopatterning, rimuovere PLPP lavando con PBS. Quindi, incubare per 20 minuti con la seconda soluzione proteica ECM e lavare i microlitri tre volte con 20 microlitri di PBS.Utilizzare un microscopio a epifluorescenza per visualizzare e visualizzare i motivi stampati. Quando sei pronto a placcare le cellule, aggiungi un millilitro di mezzo con le cellule al pozzo interno del vetro, assicurandoti di coprire tutti i microwell. E metti il piatto della coltura in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi celsius e 5%.Al fine di garantire che i modelli generati siano una rappresentazione precisa del modello, le misurazioni dell'intensità della fluorescenza sono ottenute lungo le strisce e da una corrispondente regione di sfondo sopra ogni striscia. Si ottengono micro-pattern definiti riproducibili che vanno da 20 a 2 micrometri di larghezza, ma si può osservare un effetto bordo quando la stampa presenta 20 micrometri o più larghi. Concentrazioni proteiche definite si ottengono incubando con concentrazioni variabili di proteine o variando la dose laser utilizzata per scindere il film antiadesivo.L'intensità del laser è proporzionale al livello in scala di grigi del modello, generando gradienti di illuminazione UV. La misurazione del profilo di intensità della fluorescenza lungo la striscia di gradiente, è lineare nel modello di motivo e nel modello di sfumatura generato. Questo protocollo può essere utilizzato per creare micro-pattern con più proteine nello stesso microwell, come motivi incrociati con strisce orizzontali di fibronectina e strisce verticali di laminina.Ma è necessario un passaggio di blocco per prevenire il cross-binding delle proteine. I modelli incrociati generati possono essere successivamente utilizzati per saggi cellulari con linee cellulari neuronali, o cellule CAD, o neuroni primari, DRG di ratto. Quando si esegue questo protocollo, gli aspetti più importanti da ricordare sono fare una corretta calibrazione del sistema, non lasciare che i microwell si asciughino durante le molteplici fasi di lavaggio e utilizzare i parametri giusti per l'incubazione e il blocco delle proteine.L'analisi del comportamento cellulare coinvolge tipicamente la microscopia, come la fluorescenza, il time-lapse, l'AFM. Un'ulteriore caratterizzazione può comprendere altri metodi biochimici, come la profilazione dell'espressione genica.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

Utilizzando un approccio comparativo Specie per Indagare sulla Neurobiologia delle risposte paterno

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

Ricerca

Neuroscienze

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-embedding Etichettatura immuno di proteine ​​sinaptiche in Culture Slice ippocampali

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema modello per Amylopathy Studio

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Isolamento di CA1 nucleari arricchiti Frazioni di fettine di ippocampo per studiare l&#39;attività-dipendente nucleare Importazione di Messenger proteine ​​Synapto-nucleari

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Utilizzando canali lineari Agarose per studiare<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamento larvale Crawling

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

Elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Aumento del tempo della risposta alla rete alla stimolazione delle colture cellulari neuronali sulle matrici di microelettrodi

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In Vivo Sonde di microdialysis metodo di raccogliere grandi proteine extracellulari dal cervello liquido interstiziale con cut-off di alto peso molecolare

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...