Name: light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins
Uploaded: 2019-10-11T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

この作業は、BBSRC、EPSRC、MRC、ウェルカムトラストによってサポートされています。C.B.ラボは、ウェルカム・トラスト(助成番号088785/Z/09/Z)からのコア資金によって支えられているマンチェスター大学のウェルカム・トラスト・センターの一部です。著者らは、バイオテクノロジー・生物科学研究評議会(BBSRC)からC.M.J.(BB/M020630/1)、およびP.A.(BB/P000681/1)および工学・物理科学研究協議会(EPSRC)および医学によって提供された資金を承認したいと考えています。研究評議会(MRC)再生医療博士後期訓練センター(EP/L014904/1)著者は、アルベオールの対応とアフターサポートチームに感謝しています。著者らは、マンチェスター大学バイオイメージング施設のピーター・マーチとロジャー・メドウズに、顕微鏡検査の助けに感謝している。この研究で使用されるバイオイメージング施設顕微鏡は、BBSRC、ウェルカムトラスト、マンチェスター大学戦略基金からの助成金で購入されました。

著者は何も開示していない。

LIMAP(PRIMO)マイクロパターニングの利点とマイクロコンタクト印刷との比較 マイクロコンタクト印刷は、おそらく生物学的分野で最も一般的に使用されるマイクロパターニング技術である一方で、LIMAP技術40、41、42を使用する研究者が増加しているようです。 、43、44。ここでは、LIMAPの市販システムであるPRIMOを用いてプロトコルを紹介した。以下では、マイクロコンタクト印刷とLIMAPフォトパターニングの潜在的な利点と限界について簡単に説明します。
マイクロコンタクト印刷では、フォトマスク(一般にSU-8)をガラスまたはシリコンウエハにスピンコーティングして作成したリソグラフマスターが必要です。これらのマスタは、PDMS スタンプ45を作成するためのテンプレートとして使用されます。スタンプは、選択したタンパク質でインビキュベートされ、細胞培養皿に移されます。PDMSスタンプにタンパク質を吸着するプロセスは、タンパク質濃度、緩衝液およびインキュベーション時間に依存する。これらのパラメータは、最適な結果46を事前にテストする必要があります。
マスターは、正しく保存されている場合、数ヶ月または数年続く実験のかなりの数で使用することができます。しかし、この技術の制限要因は、すべての所望の変更のための新しいリソグラフマスターを再設計する必要性です。実験計画の変更により、新しいマスターの生産に時間がかかる(数週間まで)ため、実験が遅れる可能性があります。これに対し、LIMAP フォトパターニングでは物理マスターは必要ありません。ソフトウェア生成のパターンテンプレートを使用して、マイクロパターンの所望のジオメトリを変化する研究の質問に柔軟に適応させることができます。LIMAPは、同じマイクロパターン内でタンパク質勾配を生成するためにも使用できます(図8)。
さらに、LIMAPで達成されるマイクロパターン分解能は、我々の場合、2 μm(図6B)である。
この解像度に近づくと、パターン内およびパターン間の可変性が増加しました。幅10μm以上のパターンを生成する場合は、非常に再現性が高かった(図6G,H)。逆に、マイクロコンタクト印刷では、10 μm未満の解像度を一貫して得ることは困難であり、小さな特徴をスタンプする際にアーティファクトを見つけるのが一般的です(データは示されていません)。
LIMAPは、同じマイクロウェル内で複数のタンパク質(図9)をマイクロパターン化するために使用できることを示し、実験にさらに複雑さのレベルを追加することができます。これはマイクロコンタクト印刷で実現できますが、異なるタンパク質を高い精度で整列させることは技術的にかなり厳しい場合があります。LIMAPを用いて複数のタンパク質をパターン化することは簡単に見えますが、シーケンシャルコーティング手順を通じてタンパク質のクロスバインディングはブロッキング試薬を通じて減少することができますが、完全に排除されるわけではありません(図9)。
一方または他の技術のコストに関しては、ここで説明するLIMAPは、異なる蛍光顕微鏡に設置できるマイクロパターニング装置(PRIMO)の購入を必要とし、電動段階を必要とする。この投資は最初はコストが高いですが、LIMAP に関連する長期的には消耗品(ステンシル、PEG、PLPP)以外の追加購入はありません。あるいは、PDMSステンシルは、公開されたプロトコル18、32に続く独自の実験者によってラボで製造することもできる。マイクロコンタクト印刷の最大のコストは、新しいマスターの生産に関連する可能性があり、実験に新しいパターンが必要な場合は相当な額になる可能性があります。
LIMAP の欠点の 1 つは、この手法の比較的低いスループット アプローチです。マイクロコンタクト印刷は、LIMAPで必要なシーケンシャルレーザーマイクロパターニングと比較して、同時プレスステップで多数のマイクロパターンを迅速かつ効率的に生成できます。例えば、PDMSスタンプ(スタンプ調製を除く)を用いてマイクロコンタクト印刷を行い、約2時間で6枚のスタンプガラスカバースリップを製造することが可能です。LIMAPで同様の領域(6ウェル皿)をパターン化すると、表面のパッシベーションの手順を除いて約4時間かかります(ステップ5.12で説明するパターンテンプレート構成を考慮すると、図5Bを参照)。
LIMAP 技術のもう 1 つのレート制限要因は、大きな領域をパターン化するために必要な長い照明時間 (7.5 mW/mm2レーザーを使用した設計単位あたり 30 s) です。このような場合は、マイクロコンタクト印刷が推奨される場合があります。新しく利用可能なフォトイニシエータ(PLPPゲル、材料のテーブル)は、パターニングに要する時間を大幅に短縮し、わずか数分で大きな領域(最大8mm2)で数百のマイクロパターンを生成できるようにする必要があります。
細胞培養用のマイクロパターニング表面を考慮に入れるもう一つの重要な要因は、マイクロコンタクト印刷で得られた変動性と比較して、異なる実験繰り返し間のマイクロパターンの再現性である。例えば、図7B、Dに示すグラフは、非常に類似した結果を持つ3つの独立した実験繰り返しの代表的なデータである(図は示さない)。私たちの経験と以前の出版物に基づいて、再現性のこのレベルは、マイクロコンタクト印刷48、49、50、51、52で達成することは困難です。
光感受性材料を設計するための専用の化学または一般的にあまり生体適合性のない光感度3の使用を必要とする他の光パターニング技術とは対照的に、LIMAP(PLPP))は、細胞21によって生体適合性と十分に許容される。私たちの手の中で、CAD、DRGニューロン(図10)、線維芽細胞、上皮細胞、黒色腫細胞を含む様々な細胞間で細胞毒性を経験していません(データは示されていません)。他のフォトパターニング技術と比較してPRIMOを使用するLIMAPのもう一つの利点は、フォトマスクが必要ではないことです。マイクロコンタクト印刷と同様に、新しいフォトマスクは、必要なパターンごとに設計および生成する必要があります。
マイクロコンタクト印刷に関して上記のすべての制限事項は、技術の手動アプローチを参照してください。しかしながら、スタンプ負荷及び圧力制御53を備えた自動化装置を用いてマイクロコンタクト印刷のスループットと再現性を高めることができる。
PRIMO を使用した LIMAP のプロトコルと問題解決の主な手順 このプロトコル中に見つかった最も一般的な問題の1つは、マイクロパターン内のバックグラウンド蛍光の高レベルを有することです。これは、多くの場合、その小さな体積のために発生するマイクロウェルの乾燥に起因することができます。これが起こると、PBS結晶はしばしばECMパターンの周囲に現れる(図11A)。
タンパク質インキュベーション後の不十分または非効率的な洗浄ステップはまた、バックグラウンド蛍光の高レベルをもたらすことができます。これは、特に10μg/mL(図11B)以上のタンパク質濃度を用いた場合に観察することができる。バックグラウンドでのタンパク質の過剰は、PBSと追加の洗浄ステップを含むことで低減することができます。
タンパク質の背景の存在を測定し、各実験で特徴付け、背景蛍光強度(図6E)を計算し、マイクロパターン強度から差し引く(図6F-H)図7B,D)高タンパク質の背景は、CAD細胞の付着および発芽に影響を与え、結果の解釈を損なう可能性があります。
設計単位間にギャップを持つことは、ユーザーの経験が限られている場合に一般的な問題です (図 11B)。レオナルドソフトウェアの2つのパラメータは、これを克服するために調整することができます:1)パターンの設計に応じて、列間の負の間隔が必要な場合があります(ステップ5.7と図5B、Cを参照)。または、2) [エキスパート]メニューのグラデーション オプションを使用して列をステッチします。最適な間隔パラメータを決定するためのクイックテストは、UV接着剤(材料の表)を使用して行うことができます。この接着剤の小さな滴は、ガラススライドに適用され、その後、フィルムを作る、ガラスカバースリップで覆われています。埋め込まれたUV接着剤は、低レーザー線量(30 mJ/mm2)を使用して目的のパターンテンプレートでフォトパターン化されています。埋め込まれた接着剤のUV露出領域は硬化し、明視野顕微鏡下で見えるようになります。テスト結果は、パターン内で得られた間隔を評価するために視覚化されます。私たちのニューロン実験では、ストライプ間のギャップが細胞の挙動に悪影響を及ぼし、成長力学の変動(速度の低下または経路の放棄)を生み出す可能性があります。
レオナルドソフトウェアの最新アップデート(公開時点、レオナルド4.11)では、マイクロウェル表面のはるかに大きな領域(20X目的を使用して最大8ミリメートル2)をカバーする以前に設計された大きなパターンテンプレートをアップロードすることが可能です。設計単位ごとの現在の0.1 mm2と比較して、より小さい設計単位を一緒にステッチする必要性を除去する。未定義のエッジは、パターン生成中にレーザーフォーカス調整が行われなことから生じる可能性があります(図 11C)。したがって、レーザーを校正し、パターニングの前に参照パターンステップ(ステップ4を参照)を実行することが重要です。ストライプの定義が不十分な場合、ストライプ幅のばらつきが生じ、軸が成長ダイナミクスとストライプ幅の相関関係を困難にします。アクソンはまた、エッジが拡散したストライプを放棄する傾向があります。さらに、幅10~20μm以上のストライプを印刷するとエッジのばらつき性も見出され、パターンの中央領域と比較してエッジでタンパク質含有量が高くなります(図6B,D)。このエッジ効果は、フォトパターニングプロセス中にフォトイニシエータの非均質な拡散によって生成されます。光化反応は酸素依存性であり、エッジでより拡散します。このエッジ効果は、フォトパターニングプロセス中にマイクロウェルにピペットを使用してフォトイニシエータを均質化することを最小限に抑えることができます。さらに、新たに製品化されたフォトイニシエータ(PLPPゲル)は、エッジ効果を低減することもできる(PRIMOシステムサポートチーム、パーソナルコミュニケーション)。
複数のタンパク質のマイクロプリンティングは、クロスバインディングをもたらす可能性があります(図9A-D)。これは、2つの異なるタンパク質のインキュベーションステップ間の非特異的結合部位を占めるために使用されるブロッキング効率を高めることによって最小化することができる。タンパク質のクロスバインディングは、実験結果の再現性を乱し、各タンパク質が軸次成長力学やその他の細胞挙動に対する寄与を決定することが困難であるため、データの誤解釈につながる可能性があります。
結論 LIMAPを用いて提供されるプロトコルが、PRIMOシステムを用いてタンパク質マイクロパターンの生成を容易にすることを期待する。我々のプロトコルは、2Dガラス表面でマイクロパターンを確実に生成する方法に焦点を当てていますが、他の人は、柔らかい基板54のマイクロパターニングにLIMAPを使用することが可能であることを示しています42.これらのマイクロパターンは、マイクロ環境の変化に対する細胞応答を研究するための汎用性の高いツールです。

近年、生物科学は物質科学の進歩を生かしてますます進歩を遂行しています。顕著な例の一つは、細胞増殖などの細胞応答を研究するために使用することができる基板のマイクロパターニングです1,2分化3,4,5,6、セルの移行7,8,9とパスファインディング10,11.多光子励起光化学など、基板のマイクロパターニングを可能にする技術は数多く用意されています。12, AFM ディップペンナノリソグラフィー13、ピンおよびインクジェット直接印刷14、電子ビームリソグラフィ15またはマイクロ流体16.しかし、生物分野で広く使用されている2つの技術は、マイクロコンタクト印刷です。17,18,19またはレーザー支援パターニング3(図 1).レーザーアシストパターニングは、マイクロコンタクト印刷と比較して、タンパク質およびPEG安定性およびパターン上の細胞閉じ込めの点でより信頼性の高い結果を提供すると考えられています。20.ここで説明するマイクロパターニングのためのより新しいアプローチは、タンパク質の光誘発分子吸着の使用です21(リマップ、図 1D)を使用して、市販のシステム(PRIMO、材料の表).各方法には、以下で簡単に説明する利点と制限があります。マイクロコンタクト印刷では、リソグラフ付きマスタから生成される必要なマイクロフィーチャーを使用して、PDMS 金型 (スタンプ) を使用します。切手は選択したタンパク質でインキュベートされ、細胞培養基板に移される(スタンプ)。18(図 1A).レーザーアシストパターニングは、UV光を使用して防汚フィルムをクチクします22,23,24,25、その後、目的のタンパク質でコーティングすることができる領域を公開する(図 1B).フォトパターニングアプローチで達成される解像度はミクロンの範囲内にありますが、25,26これらの技術のほとんどは、サンプルと接触するか、顕微鏡目的の物体面に位置するフォトマスクを必要とします。23,27,28.マイクロコンタクト印刷とフォトパターニングの両方におけるマスクの要件は、制限される場合があります。特定のマスクは、すべての幾何学的パターンとサイズに必要であり、発生にコストと時間がかかる場合があります。これらの手法とは対照的に、LIMAP はマスクを必要としません(図 1D).LIMAP に PRIMO システムを使用すると、機器の購入が必要なため、最初はコストが高くなる可能性があります。しかし、オープンソースソフトウェアは、任意のジオメトリのパターンを設計するために使用され、はるかに自由を与え、タンパク質濃度勾配の使用を含むより複雑な実験を可能にします。PRIMOレーザーはデジタル制御されたマイクロミラー装置(DMD)によって制御され、ユーザー定義の幾何学の任意の数のパターンを作成するために指示される。LIMAPは、培養面に細胞の付着を防ぐ分子でコーティングする必要があります。ポリエチレングリコール(PEG)は、このような「防汚」試薬として最も一般的に使用されます。それはガラスまたはプラスチック表面に密な抗粘着性フィルムを形成する29.その後、光化機構を介してPEGフィルムを高精度に除去できるフォトイニシエータが追加されます。30DMDの制御下で紫外線への局所的な露出によって。これらのPEGフリー領域は、レーザーエッチング表面に吸着するタンパク質でコーティングすることができ、マイクロパターンを生成します。レーザーパワーを変化させることにより、異なる量のPEGを表面から除去し、ユーザーがタンパク質勾配を生成できるようにします。PEG除去とコーティング手順を繰り返して、同じマイクロウェル内に2つ以上の異なるタンパク質を含むパターンを作成することができます21.生成されたマイクロパターンは、細胞の接着面を提供し、細胞の挙動の研究を可能にします。我々の研究では、神経細胞株(CAD(カテコラミン作動性-分化)細胞のニューライトまたは軸線の経路を研究するためにマイクロパターニングを使用しています。31)または原発ラット後根神経節(DRG)ニューロンは、それぞれ。ここでは、LIMAP のステップ バイ ステップ プロトコルの概要を説明します。図 2)市販のPRIMOシステムと付属のレオナルドソフトウェアを使用しています。定義された幾何学と複数のタンパク質を用いたパターンの生成にどのように使用できるかを示し、軸道の経路発見を研究するために使用する。発生する可能性のある一般的な問題とその回避方法について説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 488 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20173</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>8100805</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conjugated fibrinogen-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti inverted</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-Image J</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov" target="_blank">www.imagej.nih.gov</a></td>
			<td>Version 2.0.0-rc-54/1.51f</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent highlighter</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>Stabilo Boss Original</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Working concentration: 1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkscape software</td>
			<td>Inkscape</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-red fluorescent rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>LMN01</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>version 4.11</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager software</td>
			<td>Open imaging</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized x/y stage</td>
			<td>PRIOR Scientific</td>
			<td>Proscan II</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Working concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Stencils</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>visit <a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>Laysan bio, Inc.</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Working concentration: 50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176752</td>
			<td>Working concentration: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>Classic PLPP</td>
			<td>Working concentration: 14.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP gel)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>Working concentration: 4.76% diluted in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS (also distributed by Alv&#233;ole)</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/ProductLookup.html?ProdNo=P4707&amp;Brand=SIGMA">P4707</a></td>
			<td>Working concentration: 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo equipment</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122">15140122</a></td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-alpha antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>DM1A</td>
			<td>Working concentration: 1:1000 
			CAD cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-beta 3 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td>Working concentration: 1:500 
			DRG neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>no phase ring (check updated catalogue)</td>
			<td>Working concentration: N.A. 
			**Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alv&#233;ole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins

細胞は、細胞外マトリックスの組成と幾何学を含む様々な細胞外手がかりを感知し、細胞自体によって合成され、改造される。ここでは、単一または組み合わせのタンパク質を用いてマイクロパターン化細胞外マトリックス(ECM)基質を作製するパターニング技術としてPRIMOシステムを用いたタンパク質(LIMAP)の光誘導分子吸着法を紹介する。この方法は、優れた再現性を持つミクロン分解能でECMパターンの印刷を可能にします。我々はステップバイステップのプロトコルを提供し、これをニューロン経路発見のプロセスを研究するためにどのように適用できるかを示す。LIMAP には、複数のコンポーネントのパターン化の容易さと、ジオメトリやグラデーションを使用してパターンを生成する機能という点で、既存のマイクロ印刷方法に比べて大きな利点があります。プロトコルは、細胞の運命と細胞の行動に対するほぼすべての化学成分の寄与を研究するために容易に適応することができる。最後に、発生する可能性のある一般的な問題とその回避方法について説明します。

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Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

私たちの全体的な目的は、細胞が指示された軸方向の成長につながる細胞外の手がかりを感知する方法を理解することです。ここでは、軸ゾンの成長と経路検査を支配する特定の事象を研究するために、細胞外マトリックス成分の定義されたマイクロパターンを生成するために使用されるタンパク質の光誘導分子吸着の方法論について説明する。

細胞外マトリックスタンパク質に対する細胞応答を研究するためのマイクロパターニングのためのPRIMOシステムを用いてタンパク質の光誘導分子吸着

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

マイクロパターニングは、細胞応答を研究して、細胞が生物に遭遇する生化学的および生物物理学的シグナルを定義することを可能にするので、非常に強力なツールです。他の方法とは対照的に、説明する方法はパターン生成に対してより柔軟である。例えば、再現性の高い複数のタンパク質の勾配やマイクロパターンの生成が可能です。我々のグループは、LIMAPを用いて神経経路探索を研究するだけでなく、細胞の増殖、分化、および移動に影響を与えるシグナルに対する他の細胞の反応を研究しています。マイクロパターニングは、細胞生物学における基本的な質問に答えるために使用されます。得られた知識は、再生医療における既存の装置、例えば末梢神経損傷後の神経修復を変更するために使用することができる。まず、デジタル描画ソフトウェアでパターニングするためのテンプレートを設計します。画像サイズとして、長さ 1,824 ピクセル、幅 1,140 ピクセルを選択します。テンプレートをデザインし、テンプレートを 8 ビット TIFF ファイルとして保存します。パターニングの前に、1,000~1,300ミリトールのプロセス圧力と29.6ワットの電力を1〜5分間使用して、プラズマクリーナーで表面を清掃してアクティブ化します。20ミリメートルのインナーウェルサイズと0.16〜0.19ミリメートルのガラス厚さのガラス底皿を使用してください。テスト対象の条件の数に応じて、6ウェルまたはシングルウェル皿を選択します。PDMSステンシルを無菌状態でカットして、内部ガラス底によく収まるようにします。無菌鉗子で内部マイクロウェルフィリングを取り外し、ガラスによくステンシルを貼り付け。PBSで0.1ミリグラム/ミリリットルPLL-PEG溶液を調製し、各マイクロウェルに20マイクロリットルを加えます。その後、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルからPLL-PEGの15マイクロリットルを取り除き、乾燥させることなく20マイクロリットルのPBSで5回洗浄します。1つのウェルから18マイクロリットルのPBSを取り除き、5マイクロリットルの光導入器を追加し、残りのマイクロウェルにPBSを残して、参照パターンを作成するために1マイクロウェルを準備します。次に、蛍光蛍光ペンを使用して空の内部ガラスウェルをマークします。目的の上に位置を決め、目的のフォーカスを調整して、PRIMOロゴとキャッチフレーズがセルの世話をする」がフォーカスされます。次に、焦点面の Z 位置を記録します。参照パターンを作成するには、カメラを通して透過光を使用して光起即者とマイクロウェルのエッジを視覚化し、右側のメニューからROIシンボルを選択します。目的のパターン テンプレートをアップロードするには、PRIMO を選択します。マイクロウェルの周辺領域に移動し、「ロック」を選択して、Z位置のキャリブレーションに合わせてフォーカスを調整します。次に、[再生] を選択して、参照パターンのフォトパターンを開始します。参照パターンマイクロウェルを20マイクロリットルのPBSで3回洗浄し、光始子を除去します。次いで、20マイクロリットルの蛍光標識された細胞外マトリックス、またはECM、タンパク質溶液を添加する。室温で10〜20分間インキュベートし、リファレンスを光からよく保護します。インキュベーション後、18マイクロリットルのタンパク質溶液を取り除き、20マイクロリットルのPBSでウェルを3回洗浄します。蛍光顕微鏡を使用して、参照パターンを可視化します。カメラパスを通してパターンエッジに焦点を合わせ、最適な焦点に従ってZ位置を記録します。この位置は、後続のパターニングに使用される最適なレーザー焦点になります。滅菌条件下では、すべてのマイクロウェルからPBSの18マイクロリットルを除去します。各ウェルに光起分器の5マイクロリットルを加え、上下にピペットを入れ、均質化します。同じマイクロウェル内で複数のタンパク質をパターニングする場合は、必要なパターンテンプレートのセットをすべて同時にアップロードします。次に、行数、列数、および線量を選択します。テンプレートの構成をファイルとしてソフトウェアに保存します。参照パターンが生成された領域に移動し、最適な Z 位置にフォーカスを調整します。次に、[再生] を選択してフォトパターンを開始します。フォトパターン化が完了すると、デザイン単位が赤から青に変わります。20マイクロリットルのPBSで3回洗浄して、マイクロウェルから光刺激器を取り除きます。最後の洗浄後、各マイクロウェルから18マイクロリットルのPBSを取り除き、20マイクロリットルのECMタンパク質溶液を添加します。室温で20~30分インキュベートし、光から守ります。次に、15マイクロリットルのECMタンパク質溶液を除去し、20マイクロリットルのPBSを用いてマイクロウェルを3回洗浄する。クロス結合を防ぐには、20マイクロリットルのPLL-PEG(BSA)をマイクロウェルに加え、暗闇の中で室温で1時間インキュベートします。次いで、ブロッキング剤の15マイクロリットルを取り除き、20マイクロリットルのPBSですべてのマイクロウェルを3回洗浄する。PBSの18マイクロリットルを取り除き、各マイクロウェルに光刺激体の5マイクロリットルを加え、光刺激体がマイクロウェルの全面で均質であることを確認する。最初のマイクロウェルに移動し、前に保存したテンプレート設定をロードします。次に、第 2 ラウンドのフォトパターン作成にパターン化するアクションを選択し、最初のラウンドからアクションの選択を解除します。フォトパターニング後、PBSで洗浄してPLPPを取り除きます。次いで、第2のECMタンパク質溶液で20分間インキュベートし、20マイクロリットルのPBSでマイクロウェルを3回洗浄する。蛍光顕微鏡を使用して、印刷されたパターンを視覚化して画像化します。細胞をプレートする準備ができたら、内側のガラスによく細胞を持つ培地の1ミリリットルを追加し、すべてのマイクロウェルをカバーすることを確認します。そして、培養皿を摂氏37度、および5%の二酸化炭素インキュベーターに入れます。生成されたパターンがテンプレートの正確な表現であることを確実にするために、各ストライプに沿って、および各ストライプの上の対応する背景領域から蛍光強度測定が得られます。再現可能な定義済みのマイクロパターンは幅20~2マイクロメートルの範囲で達成されますが、20マイクロメートル以上のプリント機能を使用するとエッジ効果が得られます。定義されたタンパク質濃度は、タンパク質の様々な濃度でインキュベートするか、または抗接着フィルムを切断するために使用されるレーザー用量を変化させることによって得られる。レーザー強度はテンプレートのグレースケールレベルに比例し、UV照明の勾配を生成します。勾配ストライプに沿った蛍光強度プロファイルの測定は、パターンテンプレートで線形であり、生成された勾配パターンにおいて行われます。このプロトコルは、フィブロネクチンの水平ストライプを持つクロスパターンやラミニンの垂直ストライプなど、同じマイクロウェル内の複数のタンパク質を持つマイクロパターンを作成するために使用することができます。しかし、タンパク質のクロス結合を防ぐためにブロッキングステップが必要です。生成されたクロスパターンは、その後、ニューロン細胞株、またはCAD細胞、または一次ニューロン、ラットDRGを有する細胞アッセイに使用することができる。このプロトコルを実行する際に覚えておかねばならない最も重要な側面は、適切なシステム較正を行い、マイクロウェルが複数の洗浄工程で乾燥しないようにし、タンパク質のインキュベーションとブロッキングに適切なパラメータを使用することです。細胞行動の分析は、典型的には、蛍光、タイムラプス、AFMなどの顕微鏡検査を伴う。さらなる特徴付けは、遺伝子発現プロファイリングなどの他の生化学的方法を含むことができる。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

父親の応答の神経生物学を調査するための比較種のアプローチを使用する

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emAmylopathyの研究のための&gt;モデルシステム

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

ライブ培養神経細胞の抗体供給した後細胞表面および内在化タンパク質の異なる標識化

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Synapto核メッセンジャータンパク質の活性に依存する核内移行を研究するために海馬スライスからCA1原子力エンリッチ画分の単離

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

勉強するリニアアガロースチャネルを使用します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫クロールの動作

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

生体内で高分子量カットオフと間質液を脳から大規模な細胞外タンパク質を収集するマイクロダイアリシス法プローブします。

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...