마이크로 패터닝은 세포가 살아있는 유기체에서 만나는 생화학적 및 생물리신호를 정의하기 위해 세포 반응을 연구할 수 있기 때문에 매우 강력한 도구입니다. 다른 방법과 달리, 설명된 것은 패턴 생성을 위해 더 유연하다. 예를 들어, 그것은 높은 재현성을 가진 다중 단백질의 그라데이션 및 마이크로 패턴의 생산을 허용합니다.
우리 그룹은 LIMAP를 사용하여 신경 병리학을 연구할 뿐만 아니라 다른 세포가 세포 증식, 분화 및 마이그레이션에 영향을 미치는 신호에 어떻게 반응하는지연구합니다. 마이크로 패터닝은 세포 생물학의 근본적인 질문에 대답하는 데 사용됩니다. 얻은 지식은 재생 의학에서 기존 장치를 수정하는 데 사용할 수 있습니다, 예를 들어, 말초 신경 부상 후 신경 수리.
디지털 드로잉 소프트웨어에서 패터닝을 위한 템플릿을 디자인하는 것으로 시작합니다. 길이 1, 824픽셀, 너비 1, 140픽셀의 이미지 크기를 선택합니다. 템플릿을 디자인하고 템플릿을 8비트 TIFF 파일로 저장합니다.
패터닝 전에 1, 000 ~ 1, 300 밀리토르 및 1 ~ 5 분 동안 29.6 와트의 전력을 사용하여 플라즈마 클리너로 표면을 청소하고 활성화하십시오. 20mm 이너 웰 사이즈와 유리 두께0.16 ~0.19밀리미터의 유리 바닥 접시를 사용하십시오. 테스트 중인 조건의 수에 따라 6웰 또는 단일 웰 요리를 선택합니다.
멸균 조건에서 PDMS 스텐실을 잘라 내부 유리 바닥에 잘 맞도록 합니다. 멸균 집게로 내부 마이크로웰 충전재를 제거하고 스텐실을 유리에 잘 붙입니다. PBS에서 밀리리터 당 0.1밀리그램 PLL-PEG 솔루션을 준비하고 각 마이크로웰에 20마이크로리터를 추가합니다.
그런 다음 실온에서 1 시간 동안 접시를 배양하십시오. 인큐베이션 후, PLL-PEG의 마이크로리터 15개를 각 웰에서 제거하고, 건조시키지 않고 PBS 20 마이크로리터로 5회 세척합니다. 하나의 우물에서 PBS의 18 마이크로리터를 제거하고 5 개의 광시니티에이터를 추가하여 나머지 마이크로웰에 PBS를 남겨 서 기준 패턴을 만들기 위해 하나의 마이크로웰을 준비합니다.
그런 다음 형광형광을 사용하여 빈 내부 유리를 잘 표시합니다. 목표 보다 잘 배치하고 PRIMO 로고와 태그라인이 셀을 돌볼 때까지 목표 초점을 조정합니다." 그런 다음 초점 평면의 Z 위치를 기록합니다.
참조 패턴을 만들려면 카메라를 통해 전송된 빛을 사용하여 광합성기로 마이크로웰의 가장자리를 시각화하고 오른쪽 메뉴에서 ROI 기호를 선택합니다. 설계 단위로 ROI에 투영될 원하는 패턴 템플릿을 업로드하려면 PRIMO를 선택합니다. 마이크로웰의 주변 영역으로 이동하여 잠금을 선택하고 교정의 Z 위치에 초점을 조정합니다.
그런 다음 레퍼런스 패턴을 포토패닝하기 시작하려면 재생을 선택합니다. 기준 패턴을 PBS 20 마이크로리터로 3회 세척하여 광신염을 제거합니다. 그런 다음 형광으로 표지된 세포외 매트릭스 또는 ECM, 단백질 용액20 마이크로리터를 추가합니다.
10~20분 동안 실온에서 접시를 배양하여 빛으로부터 참조를 잘 보호하십시오. 인큐베이션 후 18마이크로리터의 단백질 용액을 제거하고 PBS 20마이크로리터로 3회 세척합니다. 상피 현미경을 사용하여 참조 패턴을 시각화합니다.
카메라 경로를 통해 패턴 모서리에 초점을 조정하고 최상의 초점에 따라 Z 위치를 기록합니다. 이 위치는 후속 패터닝에 사용되는 최적의 레이저 초점이 될 것입니다. 멸균 조건하에서 모든 마이크로웰에서 18마이크로리터의 PBS를 제거하십시오.
각 웰에 5개의 마이크로리터를 추가하고 위아래로 파이프를 사용하여 균질화합니다. 동일한 마이크로웰에 여러 단백질을 패킹하는 경우 원하는 패턴 템플릿의 모든 세트를 동시에 업로드합니다. 그런 다음 행, 열 및 용량 수를 선택합니다.
템플릿 구성을 소프트웨어에 파일로 저장합니다. 참조 패턴이 생성된 영역으로 이동하여 최적의 Z 위치로 초점을 조정합니다. 그런 다음 재생을 선택하여 포토패팅을 시작합니다.
포토패싱이 완료되면 디자인 단위가 빨간색에서 파란색으로 바뀝니다. PBS의 20 마이크로 리터로 세 번 세척하여 마이크로웰에서 광신료를 제거합니다. 마지막 세척 후 각 마이크로웰에서 18마이크로리터의 PBS를 제거하고 20마이크로리터의 ECM 단백질 용액을 추가합니다.
20~30분 동안 실온에서 접시를 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 다음으로, ECM 단백질 용액의 15 마이크로리터를 제거하고 PBS 20 마이크로리터를 사용하여 마이크로웰을 세 번 세척합니다. 교차 결합을 방지하기 위해 20 마이크로리터(PLL-PEG) 또는 BSA를 마이크로웰에 추가하고 어둠 속에서 실온에서 접시를 1시간 동안 배양합니다.
그런 다음 차단제의 마이크로리터 15를 제거하고 PBS 20 마이크로리터로 모든 마이크로웰을 세 번 세척합니다. PBS의 18 마이크로리터를 제거하고 각 마이크로웰에 광리니티에이터 5 마이크로리터를 추가하여 마이크로웰의 전체 표면에 균일한 광신염을 보장합니다. 첫 번째 마이크로웰로 이동하여 이전에 저장한 템플릿 구성을 로드합니다.
그런 다음 두 번째 포토패팅에 대해 패턴화할 작업을 선택하여 첫 번째 라운드에서 작업을 선택 해제합니다. 포토패싱 후 PBS로 세척하여 PLPP를 제거하십시오. 그런 다음, 제2 ECM 단백질 용액으로 20 분 동안 배양하고 PBS의 20 마이크로 리터로 마이크로웰을 세 번 세척합니다.
인쇄된 패턴을 시각화하고 이미지화하기 위해 피형성 현미경을 사용합니다. 세포를 플레이트할 준비가 되면, 모든 마이크로웰을 커버해야 하는 내유리에 세포가 있는 1밀리리터의 매체를 잘 추가합니다. 그리고 문화 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%에 놓습니다.
생성된 패턴이 템플릿을 정확하게 표현하도록 하기 위해 형광 강도 측정은 줄무늬를 따라, 각 스트라이프 위의 해당 배경 영역에서 얻어집니다. 재현 가능한 정의 된 마이크로 패턴은 폭 20에서 2 마이크로 미터에 이르기까지 달성되지만 인쇄 가 20 마이크로 미터 또는 더 넓은 기능을 인쇄 할 때 에지 효과를 관찰 할 수 있습니다. 정의된 단백질 농도는 다양한 단백질 농도로 배양하거나 항응고 필름을 크리브하는 데 사용되는 레이저 용량을 변화시킴으로써 얻어진다.
레이저 강도는 템플릿의 그레이스케일 레벨에 비례하여 UV 조명의 그라데이션을 생성합니다. 그라데이션 스트라이프를 따라 형광 강도 프로파일을 측정하고 패턴 템플릿및 생성된 그라데이션 패턴에서 선형입니다. 이 프로토콜은 동일한 마이크로웰에 여러 단백질을 가진 마이크로 패턴을 만드는 데 사용할 수 있습니다, 이러한 섬유 네틴의 가로 줄무늬와 교차 패턴, 라미닌의 수직 줄무늬.
그러나 단백질의 교차 결합을 방지하기 위해 차단 단계가 필요합니다. 생성된 교차 패턴은 뉴런 세포주, 또는 CAD 세포, 또는 1차 뉴런, 쥐 DRG를 이용한 세포 검사에 나중에 사용될 수 있다. 이 프로토콜을 수행할 때 기억해야 할 가장 중요한 측면은 적절한 시스템 교정을 수행하고, 여러 세척 단계에서 마이크로웰이 건조시키지 않고, 단백질 인큐베이션 및 차단에 적합한 매개 변수를 사용하는 것입니다.
세포 행동의 분석은 전형적으로 형광, 시간 경과, AFM과 같은 현미경 검사를 관련시킵니다. 추가 특성화는 유전자 발현 프로파일링과 같은 다른 생화학적 방법을 포함할 수 있다.
