Name: light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins
Uploaded: 2019-10-11T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

Dette arbeidet er støttet av BBSRC, EPSRC, MRC og Wellcome Trust. C.B. Laboratory er en del av Wellcome Trust senter for Cell-Matrix forskning, University of Manchester, som er støttet av kjernen finansiering fra Wellcome Trust (Grant nummer 088785/Z/09/Z). Forfatterne ønsker å anerkjenne finansieringen gitt av bioteknologi og biologisk vitenskap Research Council (BBSRC) til C.M., K.J. (BB/M020630/1) og PA (BB/P000681/1) og av Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) og medisinsk Forskningsråd (MRC) senter for doktorgrads opplæring i regenererende medisin til A.K. (EP/L014904/1). Forfatterne takker Alvéole for deres korrespondanse og deres etter-salg support team. Forfatterne takker Peter mars og Roger Meadows fra Bioimaging Facility, University of Manchester for deres hjelp med mikroskopi. Den Bioimaging Facility mikroskop brukt i denne studien ble kjøpt med tilskudd fra BBSRC, Wellcome Trust og University of Manchester Strategic Fund.

Forfatterne har ingenting å avsløre.

LIMAP (PRIMO) fordeler med mikro-mønster og sammenligning med microcontact utskrift Mens microcontact utskrift er muligens den mest brukte mikro-mønstre teknikk i biologisk felt39, synes det å være et økende antall forskere bruker LIMAP teknologi40,41,42 ,43,44. Her presenterte vi en protokoll ved hjelp av PRIMO, et kommersielt tilgjengelig system for LIMAP. Nedenfor diskuterer vi kort mulige fordeler og begrensninger ved microcontact utskrift og LIMAP Foto mønstre.
Microcontact utskrift krever litograferte mestere produsert av Spin-belegg en foto-maske (vanligvis SU-8) på et glass eller silisium wafer, som deretter laser-etset med ønsket mikro-funksjoner. Disse malene brukes som maler for å opprette et PDMS-stempel45. Stempelet er inkubert med et valgt protein som absorberer til det, og blir deretter overført (stemplet) på cellen kultur parabolen. Prosessen med absorpsjon av proteinet til PDMS stempel er avhengig av proteinkonsentrasjon, buffer og inkubasjonstid. Disse parametrene må testes på forhånd for optimale resultater46.
Masters kan brukes i et betydelig antall eksperimenter, som varer i måneder eller år, hvis riktig bevart. Men en begrensende faktor av denne teknologien er nødvendigheten av å re-designe nye litograferte mestere for hver ønsket endring. Endringer i eksperimentell design kan føre til tidkrevende produksjon av nye mestere (opp til flere uker) og dermed forsinke eksperimenter. Til sammenligning krever ikke LIMAP photopatterning en fysisk original. den brukerprogramvare gener ert mønster maler som kan brukes til fleksibelt tilpasse ønsket geometri av mikro-mønstre til å endre forskningsspørsmål. LIMAP kan også brukes til å generere protein graderinger innenfor samme mikro-mønster (Figur 8), som er vanskeligere å få i en reproduserbar måte ved hjelp av microcontact utskrift47.
Videre er mikro-mønster oppløsning oppnås med LIMAP, i vårt tilfelle, er 2 μm (figur 6B).
Ved å nærme seg denne resolusjonen økte variasjonen mellom-og mønster. Generering av mønstre rundt eller over 10 μm bredde var svært reproduserbar (figur 6G, H). Tvert imot, med microcontact utskrift er det vanskelig å konsekvent få oppløsninger under 10 μm og det er vanlig å finne gjenstander når stempling små funksjoner (data ikke vist).
Vi har vist at LIMAP kan brukes til mikro-mønster flere proteiner (figur 9) innenfor samme mikro-brønn, slik at ytterligere nivåer av kompleksitet som skal legges til eksperimenter. Selv om dette kan oppnås med microcontact utskrift, samkjøre forskjellige proteiner med høy presisjon kan være teknisk ganske krevende. Mens mønstre flere proteiner bruker LIMAP synes rett frem, er det viktig å nevne at kryss-binding av proteiner gjennom sekvensiell belegg prosedyrer kan reduseres gjennom blokkering reagenser, men ikke helt eliminert (figur 9).
Når det gjelder kostnaden av den ene eller den andre teknikken, LIMAP som beskrevet her krever kjøp av mikro-mønster utstyr (PRIMO) som kan installeres på ulike fluorescens mikroskop og krever en motorisert scenen. Selv om denne investeringen er i utgangspunktet kostnadskrevende, er det ingen ekstra kjøp annet enn forbruksvarer (sjablonger, PEG og PLPP) på lang sikt forbundet med LIMAP. Alternativt kan PDMS sjablonger også produseres i laboratoriet av egne eksperimentator følgende publiserte protokoller18,32. De største kostnadene for microcontact utskrift kan knyttes til produksjon av nye mestere, som kan bli betydelige hvis eksperimenter krever nye mønstre.
En ulempe med LIMAP er den relativt lave gjennomstrømningen tilnærming av denne teknikken. Microcontact utskrift kan produsere et stort antall mikro-mønstre raskt og effektivt i et samtidig stempling trinn, sammenlignet med den nødvendige sekvensielle laser mikro-mønstre med LIMAP. For eksempel er det mulig å produsere 6 stemplet glass coverslips i ca 2 h med microcontact utskrift ved hjelp PDMS frimerker (unntatt stempel forberedelse); mønstre et lignende område (6-vel parabol) med LIMAP ville ta rundt 4 h, unntatt prosedyren av overflaten passivering (vurderer mønsteret malen konfigurasjonen beskrevet i trinn 5,12 og se figur 5B).
En annen rate begrensende faktor av LIMAP-teknologi er den lange belysnings tiden som kreves for mønster store områder (30 s per design enhet med en 7,5 mW/mm2 laser). I slike tilfeller kan microcontact utskrift være et foretrukket alternativ. En nylig tilgjengelig Foto-initiator (PLPP gel, tabell av materialer) bør betydelig redusere tiden det tar for mønsteret, slik at generering av hundrevis av mikro-mønstre i store områder (opp til 8 mm2) i løpet av få minutter.
En annen viktig faktor å ta hensyn til når mikro-mønster overflater for cellekultur er reproduserbarhet av mikro-mønstre blant ulike eksperimentelle repetisjoner, i forhold til variasjon oppnådd med microcontact utskrift. For eksempel er diagrammene vist i figur 7B, D representative data for tre uavhengige eksperimentelle repetisjoner med svært like resultater (data ikke vises). Basert på vår erfaring og tidligere publikasjoner, er dette nivået av reproduserbarhet vanskelig å oppnå med microcontact Printing48,49,50,51,52.
I motsetning til andre foto mønstre teknikker som krever enten dedikert kjemi til ingeniør fotosensitive materialer eller bruk av foto-allergifremkallende stoffer, som vanligvis ikke er veldig biokompatible3, den lysfølsomme komponenten av LIMAP (PLPP ) er biokompatible og godt tolerert av cellene21; i våre hender har vi ikke opplevd noen cytotoksisitet over en rekke celler, inkludert CAD, DRG neurons (Figur 10), fibroblaster, epitelceller, og melanom celler (data ikke vist). En annen fordel med LIMAP som bruker PRIMO sammenlignet med andre foto mønster teknikker er at ingen photomask er nødvendig. Analog med microcontact trykking, ny photomasks ville nød å bli designet og utviklet for enhver ønsket mønster.
Alle begrensningene nevnt ovenfor for microcontact utskrift, se den manuelle tilnærmingen til teknikken. Det er imidlertid mulig å øke gjennomstrømningen og reproduserbarhet for microcontact utskrift ved hjelp av en automatisert enhet med stempel belastning og trykk kontroll53.
Viktige trinn i protokollen og problemløsing for LIMAP ved hjelp av PRIMO En av de vanligste problemene som finnes i denne protokollen er å ha høye nivåer av bakgrunnen fluorescens innenfor mikro-mønstre. Dette kan skyldes uttørking av mikro-brønner som ofte oppstår på grunn av deres små volum. Når dette skjer, vises PBS-krystaller ofte rundt ECM-mønstrene (Figur 11A).
Utilstrekkelig eller ineffektiv vasketrinn etter protein inkubasjons kan også føre til høye nivåer av bakgrunns fluorescens. Dette kan observeres spesielt ved bruk av protein konsentrasjoner på 10 μg/mL (fig. 11B) eller høyere. Det overskytende av protein i bakgrunnen kan reduseres ved å inkludere ekstra vasketrinn med PBS.
Tilstedeværelsen av protein bakgrunn må måles og karakteriseres i hvert eksperiment, beregning bakgrunnen fluorescens intensitet (figur 6E) og trekke den fra mikro-mønstre intensitet (figur 6F-H og figur 7B, D). Høy protein bakgrunn kan ha en innvirkning på vedlegget og spirende av DAK-celler, og kompromittere tolkningen av resultatene.
Å ha mellomrom mellom design enheter er et vanlig problem når brukere har begrenset erfaring (Figur 11B), som oppstår som et resultat av utilstrekkelig overlapping mellom mønstre. To parametre i Leonardo programvare kan justeres for å overvinne dette: 1) en negativ avstand mellom kolonnene kan være nødvendig, avhengig av utformingen av mønsteret (trinn 5,7 og se figur 5B, C). Alternativt, 2) bruke gradient alternativet i Expert menyen for å sy kolonnene. En rask test for å bestemme optimale avstands parametre kan utføres ved hjelp av UV-lim (tabell av materialer). En liten dråpe av dette limet påføres et glass lysbilde, som deretter dekkes med et glass dekkglass, lage en film. Den innebygde UV limet er photopatterned med mønster malen av interesse ved hjelp av en lav laser dose (30 mJ/mm2). Den UV-eksponerte områder av den innebygde limet vil bli kurert, blir synlig under lyse-feltet mikroskopi. Testresultatene er visualisere for å evaluere oppnådd avstand innenfor mønsteret. I våre neuronal eksperimenter kan et gap mellom striper ha negativ innvirkning på celle atferden og produsere variasjoner i vekst dynamikk (enten redusert hastighet eller oppgivelse av banen).
I den siste oppdateringen av Leonardo programvare (på tidspunktet for publisering, Leonardo 4,11), er det mulig å laste opp tidligere utformet større mønster maler som dekker et mye større område (opp til 8 mm2 ved hjelp av 20x objektiv) av mikro-brønn overflaten sammenlignet med dagens 0,1 mm2 per design enhet, eliminerer behovet for å sy sammen de mindre design enheter. Udefinert kanter kan skyldes mangel på laser fokus justering under mønster generering (Figur 11C). Det er derfor viktig å kalibrere laseren og utføre referanse mønster trinn (se trinn 4) før mønsteret. Dårlig definerte striper resultere i variasjoner i stripe bredde, noe som gjør sammenhengen mellom axon vekst dynamikk og stripe bredde vanskelig. Axons har også en tendens til å forlate striper som har diffust kanter. I tillegg kan variasjon i kantene også bli funnet ved utskrift av striper på 10-20 μm bredde eller høyere, noe som resulterer i et høyere proteininnhold på kantene i forhold til de sentrale regionene i mønsteret (figur 6B, D). Denne kanten effekten er produsert av en ikke-homogen diffusjon av foto-initiativtaker under photopatterning prosessen. Den photoscission reaksjonen er oksygen avhengig, noe som diffunderer mer på kantene. Denne kanten effekten kan minimeres homogenisere bildet-initiativtaker med en pipette i mikro-brønnen under photopatterning prosessen. Videre kan en ny kommersialisert Foto-initiator (PLPP gel), også redusere kant effekten (PRIMO system support team, personlig kommunikasjon).
Mikro-utskrift av mer enn ett protein kan resultere i kryssbinding (figur 9A-D). Dette kan minimeres ved å øke blokkerings effektiviteten som brukes til å oppta løs bindings områder mellom de inkubasjons trinnene for de to forskjellige proteinene. Cross-binding av proteiner kan forurolige reproduserbarhet av eksperimentelle utfall og kan føre til feil tolkning av data, siden det er vanskelig å bestemme bidraget av hvert protein for å axon vekst dynamikk og andre celle atferd.
Konklusjon Vi håper at den oppgitte protokollen ved hjelp av LIMAP forenkler generering av protein mikro-mønstre gjennom bruk av PRIMO systemet. Mens vår protokoll fokuserer på hvordan du pålitelig produsere mikro-mønstre i 2D glassoverflater, andre har vist at det er mulig å bruke LIMAP for mikro-mønstre av myke underlag54, og microstructured overflater for 3D-kulturer42. Disse mikro-mønstre kan være et allsidig verktøy for å studere cellulære svar på endringer i deres mikro-miljø.

De siste årene har de biologiske vitenskaper i økende grad gjort bruk av fremskrittene som er gitt av materiell vitenskap. Et fremtredende eksempel er mikro-mønstre av underlag, som kan brukes til å studere cellulære reaksjoner som celle spredning1,2Differensiering3,4,5,6, celle migrering7,8,9og pathfinding10,11. Det finnes en rekke teknikker tilgjengelig som muliggjør mikro-mønstre av underlag, slik som multiphoton spent fotokjemi12, AFM DIP-penn nanolithography13, PIN og blekkskriver direkte utskrift14, elektronstråle Litografi15eller materialer16. Men to teknikker som er mye brukt i det biologiske feltet er microcontact utskrift17,18,19eller laser-assistert mønster3(Figur 1). Laser-assistert mønster anses å levere mer pålitelige resultater i form av protein og PEG stabilitet og celle isolasjon på mønstrene, sammenlignet med microcontact utskrift20. En mer ny tilnærming for mikro-mønstre som er beskrevet her er bruken av lys-indusert molekylær absorpsjon av proteiner21(LIMAP,Figur 1 D) ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig system (PRIMO,Tabell av materialer). Hver av metodene har fordeler og begrensninger som er kort beskrevet nedenfor. Microcontact utskrift bruker PDMS muggsopp (frimerker) med ønskede mikro-funksjoner som er generert fra litograferte mestere. Stemplene er inkubert med en utvalgt protein som deretter overføres (stemplet) på cellen kultur substrat18(Figur 1 A). Laser-assistert mønster bruker UV-lys for å holde en anti-forurensning film22,23,24,25, utsette områder som senere kan belagt med protein av interesse (Figur 1 B). Mens oppløsningen oppnås med foto-mønstre tilnærminger er i mikron området25,26, de fleste av disse teknikkene krever en foto-maske, enten i kontakt med prøven, eller ligger i objektet flyet av mikroskopet objektiv23,27,28. Kravene til masker i både microcontact utskrift og foto mønstre kan være en begrensning; spesifikke masker er nødvendig for alle geometriske mønster og størrelse, som kan være kostbart og tidkrevende å generere. I motsetning til disse teknikkene, LIMAP ikke krever en maske (Figur 1 D). Bruk av PRIMO-systemet for LIMAP kan være kostnadskrevende i begynnelsen fordi det krever kjøp av utstyr. Men åpen kildekode programvare brukes til å designe mønstre av ønsket geometri, noe som gir mye mer frihet og gir mer komplekse eksperimenter, inkludert bruk av proteinkonsentrasjon graderinger. PRIMO laser styres og ledes av en digitalt kontrollert Micromirror Device enhet (DMD) for å skape mønstre i en rekke brukerdefinerte geometri. LIMAP krever at kultur overflaten er belagt med molekyler som hindrer celle feste. Polyetylen glykol (PEG) brukes vanligvis som en slik "Bunnstoff" reagens; det danner en tett anti-lim film på glass eller plastoverflate29. Deretter legges en foto-initiator som gjør at PEG filmen skal fjernes med høy presisjon gjennom en photoscission mekanisme30av lokal eksponering for UV-lys under kontroll av DMD. Disse PEG-frie regionene kan være belagt med proteiner som adsorbere til laser etset overflate, genererer et mikro-mønster. Ved å variere laser kraft, ulike mengder PEG kan fjernes fra overflaten tillater brukeren å generere protein graderinger. PEG fjerning og belegget prosedyren kan gjentas for å lage mønstre med to eller flere forskjellige proteiner i samme mikro-brønn21. De genererte mikro-mønstrene gir selvklebende overflater for celler, slik at studiet av celle atferd. I våre studier bruker vi mikro-mønstre for å studere neurite eller axon pathfinding av en neuronal cellelinje (CAD (Cathecholaminergic-en differensiert) celler31) eller primær rotte rygg-root Ganglion (DRG) neurons, henholdsvis. Her skisserer vi en trinnvis protokoll for LIMAP (Figur 2) ved bruk av det kommersielt tilgjengelige PRIMO-systemet og med følgende Leonardo-programvare. Vi viser hvordan den kan brukes til generering av mønstre med definert geometri og flere proteiner, som vi bruker til å studere axonal pathfinding. Vi diskuterer vanlige problemer som kan oppstå, og hvordan disse kan unngås.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 488 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20173</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>8100805</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conjugated fibrinogen-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti inverted</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-Image J</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov" target="_blank">www.imagej.nih.gov</a></td>
			<td>Version 2.0.0-rc-54/1.51f</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent highlighter</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>Stabilo Boss Original</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Working concentration: 1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkscape software</td>
			<td>Inkscape</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-red fluorescent rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>LMN01</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>version 4.11</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager software</td>
			<td>Open imaging</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized x/y stage</td>
			<td>PRIOR Scientific</td>
			<td>Proscan II</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Working concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Stencils</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>visit <a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>Laysan bio, Inc.</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Working concentration: 50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176752</td>
			<td>Working concentration: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>Classic PLPP</td>
			<td>Working concentration: 14.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP gel)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>Working concentration: 4.76% diluted in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS (also distributed by Alv&#233;ole)</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/ProductLookup.html?ProdNo=P4707&amp;Brand=SIGMA">P4707</a></td>
			<td>Working concentration: 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo equipment</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122">15140122</a></td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-alpha antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>DM1A</td>
			<td>Working concentration: 1:1000 
			CAD cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-beta 3 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td>Working concentration: 1:500 
			DRG neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>no phase ring (check updated catalogue)</td>
			<td>Working concentration: N.A. 
			**Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alv&#233;ole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins

Celler forstand en rekke ekstracellulære signaler, inkludert sammensetning og geometri av ekstracellulære matrise, som er syntetisert og ombygd av cellene selv. Her presenterer vi metoden for Light-indusert molekylær absorpsjon av proteiner (LIMAP) som bruker PRIMO-systemet som mønster teknikk for å produsere mikro-mønstret ekstracellulære Matrix (ECM) ved hjelp av en enkelt eller kombinasjon av proteiner. Metoden muliggjør utskrift av ECM-mønstre i mikron oppløsning med utmerket reproduserbarhet. Vi gir en trinnvis protokoll og demonstrerer hvordan dette kan anvendes for å studere prosessene i neuronal pathfinding. LIMAP har betydelige fordeler i forhold til eksisterende mikro-utskrift metoder i forhold til den enkle mønstre mer enn én komponent og evnen til å generere et mønster med noen geometri eller gradient. Protokollen kan enkelt tilpasses for å studere bidraget fra nesten alle kjemiske komponenter mot celle skjebne og celle adferd. Til slutt diskuterer vi vanlige problemer som kan oppstå, og hvordan disse kan unngås.

Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Vårt overordnede mål er å forstå hvordan cellene forstand ekstracellulære signaler som fører til rettet axonal vekst. Her beskriver vi metodikken for lys-indusert molekylær absorpsjon av proteiner, som brukes til å produsere definerte mikro-mønstre av ekstracellulære matrise komponenter for å studere bestemte hendelser som styrer axon utvekst og pathfinding.

Lys-indusert molekylær absorpsjon av proteiner ved hjelp av PRIMO system for mikro-mønstre å studere Cell Svar å ekstracellulære Matrix proteiner

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Mikromønster er et veldig kraftig verktøy fordi det gjør det mulig å studere cellulære responser for å definere biokjemiske og biofysiske signaler som celler møter i levende organismer. I motsetning til andre metoder er de beskrevne mer fleksible for mønstergenerering. For eksempel tillater det produksjon av gradienter og mikromønstre av flere proteiner med høy reproduserbarhet.Vår gruppe bruker LIMAP ikke bare til å studere nevronal pathfinding, men også hvordan andre celler reagerer på signaler som har innflytelse på cellespredning, differensiering og migrasjon. Mikromønster brukes til å svare på grunnleggende spørsmål i cellebiologi. Den oppnådde kunnskapen kan brukes til å modifisere eksisterende enheter i regenerativ medisin, for eksempel nervereparasjon etter perifer nerveskade.Begynn med å utforme maler for mønster på digital tegneprogramvare. Velg en bildestørrelse på 1, 824 piksler i lengde og 1, 140 piksler i bredden. Ut designe malen, og lagre malen som en 8-biters TIFF-fil.Før mønster, rengjør og aktiver overflaten med en plasmarenser ved hjelp av et prosesstrykk på 1000 til 1, 300 millitorr og en effekt på 29,6 watt i ett til fem minutter. Bruk en glassbunnsrett med en 20 millimeter indre brønnstørrelse og glasstykkelse på 0,16 til 0,19 millimeter. Velg enten en seksbrønns eller en enkeltbrønnsrett, avhengig av antall forhold som testes.Kapp PDMS-sjablonger under sterile forhold for å sikre at de passer godt inn i den indre glassbunnen. Fjern de indre mikrobrønnfyllingene med sterile tang, og fest sjablongene på glasset godt. Forbered en 0,1 milligram per milliliter PLL-PEG-løsning i PBS, og tilsett 20 mikroliter til hver mikrobrønn.Deretter inkubere parabolen ved romtemperatur i en time. Etter inkubasjon fjerner du 15 mikroliter av PLL-PEG fra hver brønn, og vasker den fem ganger med 20 mikroliter PBS uten å la den tørke. Forbered en mikrobrønn for å lage et referansemønster ved å fjerne 18 mikroliter PBS fra en enkelt brønn og legge til fem mikroliter fotoinitiator, slik at PBS i de resterende mikrobrønnene.Deretter bruker du en fluorescerende merkepenn til å markere en tom indre glassbrønn. Plasser brønnen over målet, og juster objektivt fokus til PRIMO-logoen og slagordet tar vare på cellene dine"er i fokus. Deretter registrerer du Z-posisjonen til fokalplanet.Hvis du vil opprette et referansemønster, visualiserer du kanten av mikrobrønnen med fotoinitiatoren ved hjelp av det overførte lyset gjennom kameraet, og velger ROI-symbolet fra menyen til høyre. Velg PRIMO for å laste opp ønsket mønstermal, som vil bli projisert på avkastningen som en designenhet. Naviger til et perifert område av mikrobrønnen, velg Lås, og juster fokuset til Z-kalibreringens posisjon.Velg deretter Spill av for å starte fotografering av referansemønsteret. Vask referansemønsteret microwell tre ganger med 20 mikroliter PBS for å fjerne fotoinitiatoren. Deretter legger du til 20 mikroliter fluorescerende merket ekstracellulær matrise, eller ECM, proteinoppløsning.Inkuber fatet ved romtemperatur i 10 til 20 minutter, og sørg for å beskytte referansen godt mot lys. Etter inkubasjon fjerner du 18 mikroliter proteinoppløsning, og vask brønnen tre ganger med 20 mikroliter PBS. Bruk et epifluorescencemikroskop til å visualisere referansemønsteret.Juster fokus på mønsterkantene gjennom kamerabanen, og ta opp Z-posisjonen i henhold til det beste fokuset. Denne posisjonen vil være det optimale laserfokuset som brukes til etterfølgende mønster. Under sterile forhold fjerner du 18 mikroliter PBS fra alle mikrobrønnene.Tilsett fem mikroliter av fotoinitiatoren til hver brønn, og homogeniser ved å pipetter opp og ned. Hvis du mønstrer flere proteiner i samme mikrobrønn, laster du opp alle sett med ønskede mønstermaler samtidig. Velg deretter antall rader, kolonner og dose.Lagre malkonfigurasjonen som fil i programvaren. Naviger til området der referansemønsteret ble produsert, og juster fokuset til optimal Z-posisjon. Velg deretter Spill av for å starte fotopapirering.Designenhetene blir fra rød til blå når fotopapiringen er fullført. Fjern fotoinitiatoren fra mikrobrønnene ved å vaske dem tre ganger med 20 mikroliter PBS. Etter siste vask fjerner du 18 mikroliter PBS fra hver mikrobrønn, og tilsett 20 mikroliter ECM-proteinoppløsning.Inkuber parabolen ved romtemperatur i 20 til 30 minutter, og sørg for å beskytte den mot lys. Deretter fjerner du 15 mikroliter av ECM-proteinoppløsningen, og vasker mikrobrønnene tre ganger ved hjelp av 20 mikroliter PBS. For å unngå kryssbinding, tilsett 20 mikroliter PLL-PEG, eller BSA, til mikrobrønnene, og inkubere parabolen ved romtemperatur i en time, i mørket.Fjern deretter 15 mikroliter av blokkeringsmiddelet, og vask alle mikrobrønner tre ganger med 20 mikroliter PBS. Fjern 18 mikroliter PBS, og tilsett 5 mikroliter av fotoinitiatoren til hver mikrobrønn, slik at fotoinitiatoren er homogen på hele overflaten av mikrobrønnene. Naviger til den første mikrobrønnen, og last inn malkonfigurasjonen som ble lagret tidligere.Deretter velger du handlingene som skal mønstres for den andre runden med fotopapirering, og pass på at du fjerner merket for handlinger fra første runde. Etter fotopapirering fjerner du PLPP ved å vaske med PBS. Deretter inkuber i 20 minutter med den andre ECM-proteinoppløsningen, og vask mikrobrønnene tre ganger med 20 mikroliter PBS.Bruk et epifluorescence mikroskop for å visualisere og bilde de trykte mønstrene. Når du er klar til å plate cellene, legg til en milliliter medium med celler til det indre glasset godt, og sørg for å dekke alle mikrobrønner. Og legg kulturretten i en 37 grader celsius, og 5% karbondioksid inkubator.For å sikre at de genererte mønstrene er en presis representasjon av malen, oppnås fluorescensintensitetsmålinger langs stripene, og fra et tilsvarende bakgrunnsområde over hver stripe. Reproduserbare definerte mikromønstre oppnås fra 20 til 2 mikrometer i bredde, men en kanteffekt kan observeres når du skriver ut funksjoner 20 mikrometer eller bredere. Definerte proteinkonsentrasjoner oppnås ved enten inkubering med varierende konsentrasjoner av protein, eller varierende laserdosen som brukes til å holde antiadhesiv filmen.Laserintensiteten er proporsjonal med malens gråtoner, og genererer graderinger av UV-belysning. Målingen av fluorescensintensitetsintensitetsprofilen langs graderingsstripen, er lineær i mønstermalen, og i det genererte graderingsmønsteret. Denne protokollen kan brukes til å lage mikromønstre med flere proteiner i samme mikrobrønn, for eksempel kryssmønstre med horisontale striper av fibronectin og vertikale striper av laminin.Men et blokkeringstrinn er nødvendig for å forhindre kryssbinding av proteiner. De genererte kryssmønstrene kan senere brukes til cellulære analyser med nevronale cellelinjer, eller CAD-celler, eller primære nevroner, rotte DRGs. Når du utfører denne protokollen, gjør de viktigste aspektene å huske en riktig systemkalibrering, ikke lar mikrobrønnene tørke ut under de mange vasketrinnene, og bruke de riktige parametrene for proteininkubasjon og blokkering.Analyse av celleatferd involverer vanligvis mikroskopi, for eksempel fluorescens, tidsforløp, AFM. Videre karakterisering kan omfatte andre biokjemiske metoder, for eksempel profilering av genuttrykk.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-embedding immunogold merking av Synaptic Proteiner i hippocampus Slice kulturer

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

En<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Differensial Merking av Cell-overflaten og internalisert Proteiner etter Antistoff Fôring av Levende Cultured Neuroner

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Isolering av CA1 Nuclear beriket fraksjoner fra hippocampus Slices til studieaktivitet avhengig Nuclear Import av Synapto-nukleære Messenger Proteiner

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Luktsystemet som en modell for å studere aksonal vekst mønstre og morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Bruke Lineær Agarose kanaler å studere<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

I Utero Electroporation Tilnærminger til Studer Excitability av neuronal subpopulasjoner og Single-celle Tilkobling

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsavhengig økning i nettverksresponsen til stimulering av neuronale cellekulturer på mikroelektrodearrayer

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

I Vivo Microdialysis-metoden for å samle inn store ekstracellulære proteiner fra hjernen interstitiell væske med høy-molekylær vekt Cut-off sonder

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...