Name: light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins
Uploaded: 2019-10-11T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

Este trabajo es apoyado por los BBSRC, EPSRC, MRC y Wellcome Trust. El laboratorio C.B. forma parte del Wellcome Trust Centre for Cell-Matrix research, Universidad de Manchester, que cuenta con el apoyo de la financiación básica del Wellcome Trust (número de concesión 088785/Z/09/Z). Los autores desean reconocer la financiación proporcionada por el Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC) a C.M., K.J. (BB/M020630/1) y P.A. (BB/P000681/1) y por el Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas (EPSRC) y el Consejo de Investigación de Ciencias Médicas (EPSRC) y el Consejo de Investigación médica (EPSRC) y el Consejo de Investigación Médica (EPSRC) y el Consejo de Investigación médica (EPSRC) y el Consejo de Investigación de Ciencias Médicas (EPSRC) y Centro de Formación doctoral en Medicina Regenerativa al Consejo de Investigación (MRC) (EP/L014904/1). Los autores agradecen a Alvéole por su correspondencia y su equipo de soporte post-venta. Los autores agradecen a Peter March y Roger Meadows del Centro de Bioimagen de la Universidad de Manchester por su ayuda con la microscopía. Los microscopios de la Instalación de Bioimagen utilizados en este estudio fueron comprados con subvenciones de BBSRC, Wellcome Trust y el Fondo Estratégico de la Universidad de Manchester.

Los autores no tienen nada que revelar.

Ventajas de micropatrones LIMAP (PRIMO) y comparación con la impresión de microcontactos Si bien la impresión de microcontactos es posiblemente la técnica de micropatrones más utilizada en el campo biológico39, parece haber un número creciente de investigadores que utilizan la tecnología LIMAP40,41,42 ,43,44. Aquí, presentamos un protocolo usando PRIMO, un sistema disponible comercialmente para LIMAP. A continuación analizamos brevemente las posibles ventajas y limitaciones de la impresión de microcontactos y el patrón fotográfico LIMAP.
La impresión de microcontacto requiere maestros litografiados producidos por el recubrimiento de espín de una foto-máscara (generalmente SU-8) en una oblea de vidrio o silicio, que luego se graba con láser con las microcaracterísticas deseadas. Estos maestros se utilizan como plantillas para crear un sello PDMS45. El sello se incuba con una proteína elegida que se adsorbe a él, y luego se transfiere (estampada) en el plato de cultivo celular. El proceso de adsorción de la proteína al sello PDMS depende de la concentración de proteínas, el tampón y el tiempo de incubación. Estos parámetros deben probarse previamente para obtener resultados óptimos46.
Los maestros se pueden utilizar en un número sustancial de experimentos, que duran meses o incluso años, si se conservan correctamente. Sin embargo, un factor limitante de esta tecnología es la necesidad de rediseñar nuevos maestros litografíados para cada modificación deseada. Los cambios en los diseños experimentales pueden dar lugar a la producción lenta de nuevos maestros (hasta varias semanas) retrasando así los experimentos. En comparación, el fotopatrón LIMAP no requiere un maestro físico; utiliza plantillas de patrones generadas por software que se pueden utilizar para adaptar de forma flexible las geometrías deseadas de los micropatrones a las preguntas de investigación cambiantes. LIMAP también se puede utilizar para generar gradientes proteicos dentro del mismo micropatrón(Figura 8), que es más difícil de obtener de manera reproducible utilizando la impresión de microcontacto47.
Además, la resolución de micropatrones lograda con LIMAP, en nuestro caso, es de 2 m(Figura 6B).
Al aproximarse a esta resolución se aumentó la variabilidad intra e inter-patrón. La generación de patrones alrededor o por encima de 10 m de ancho era altamente reproducible(Figura 6G,H). Por el contrario, con la impresión de microcontactos es difícil obtener de forma consistente resoluciones inferiores a 10 m y es común encontrar artefactos al estampar pequeñas características (datos no mostrados).
Hemos demostrado que LIMAP se puede utilizar para micro-patrón de múltiples proteínas(Figura 9) dentro del mismo micro-pozo, permitiendo que se agreguen más niveles de complejidad a los experimentos. Aunque esto podría lograrse con la impresión de microcontactos, alinear diferentes proteínas con un alto nivel de precisión puede ser técnicamente bastante exigente. Si bien el patrón de múltiples proteínas utilizando LIMAP parece directo, es importante mencionar que la unión cruzada de proteínas a través de procedimientos de recubrimiento secuencial puede reducirse mediante el bloqueo de reactivos, pero no eliminado sin eliminar por completo(Figura 9).
En cuanto al costo de una u otra técnica, LIMAP como se describe aquí requiere la compra de equipos de micro-patrones (PRIMO) que se pueden instalar en diferentes microscopios de fluorescencia y requiere una etapa motorizada. Aunque esta inversión es inicialmente intensiva en costos, no hay compras adicionales que no sean artículos consumibles (plantillas, PEG y PLPP) a largo plazo asociados con LIMAP. Alternativamente, las plantillas PDMS también pueden ser producidas en el laboratorio por el propio experimentador siguiendo los protocolos publicados18,32. Los mayores costos para la impresión de microcontactos pueden estar asociados con la producción de nuevos maestros, que pueden llegar a ser sustanciales si los experimentos requieren nuevos patrones.
Un inconveniente de LIMAP es el enfoque de rendimiento relativamente bajo de esta técnica. La impresión por microcontacto puede producir un gran número de micropatrones de forma rápida y eficiente en un paso de estampado simultáneo, en comparación con el micropatrón láser secuencial requerido con LIMAP. Por ejemplo, es posible producir 6 cubiertas de vidrio estampadas en aproximadamente 2 h con impresión de microcontacto utilizando sellos PDMS (excluyendo la preparación de sellos); el patrón de un área similar (plato de 6 pozos) con LIMAP tomaría alrededor de 4 h, excluyendo el procedimiento de pasivación de la superficie (considerando la configuración de la plantilla de patrón descrita en el paso 5.12 y vea la Figura 5B).
Otro factor limitante de la velocidad de la tecnología LIMAP es el largo tiempo de iluminación necesario para el patrón de grandes áreas (30 s por unidad de diseño con un láser de 7,5 mW/mm2). En estos casos, la impresión de microcontactos podría ser una opción preferida. Un fotoiniciador recién disponible (gel PLPP, Tabla de Materiales)debería reducir considerablemente el tiempo necesario para el patrón, permitiendo la generación de cientos de micropatrones en grandes áreas (hasta 8 mm2)en pocos minutos.
Otro factor importante a tener en cuenta cuando las superficies de micropatrones para el cultivo celular es la reproducibilidad de los micropatrones entre las diferentes repeticiones experimentales, en comparación con la variabilidad obtenida con la impresión de microcontactos. Por ejemplo, los gráficos que se muestran en la Figura 7B,D son datos representativos de tres repeticiones experimentales independientes con resultados muy similares (datos no mostrados). Basándonos en nuestra experiencia y publicaciones anteriores, este nivel de reproducibilidad es difícil de alcanzar con la impresión de microcontacto48,49,50,51,52.
A diferencia de otras técnicas de foto-patrones que requieren química dedicada para diseñar materiales fotosensibles o el uso de fotosensibilizantes, que generalmente no son muy biocompatibles3, el componente fotosensible de LIMAP (PLPP ) es biocompatible y bien tolerado por las células21; en nuestras manos no hemos experimentado ninguna citotoxicidad a través de una variedad de células, incluyendo CAD, neuronas DRG (Figura 10), fibroblastos, células epiteliales, y células de melanoma (datos no mostrados). Otra ventaja de LIMAP usando PRIMO en comparación con otras técnicas de foto-patrón es que no se requiere fotomáscara. Al igual que la impresión de microcontactos, las nuevas máscaras de foto serían necesarios para cada patrón deseado.
Todas las limitaciones mencionadas anteriormente para la impresión de microcontactos, consulte el enfoque manual de la técnica. Sin embargo, es posible mejorar el rendimiento y la reproducibilidad de la impresión de microcontacto utilizando un dispositivo automatizado con carga de sellos y control de presión53.
Pasos clave del protocolo y resolución de problemas para LIMAP utilizando PRIMO Uno de los problemas más comunes encontrados durante este protocolo es tener altos niveles de fluorescencia de fondo dentro de los micropatrones. Esto puede deberse al secado de micro-pozos que a menudo ocurre debido a su pequeño volumen. Cuando esto ocurre, los cristales PBS a menudo aparecen alrededor de los patrones ECM(Figura 11A).
Los pasos de lavado insuficientes o ineficientes después de la incubación de proteínas también pueden resultar en altos niveles de fluorescencia de fondo. Esto se puede observar particularmente al utilizar concentraciones proteicas de 10 g/ml(Figura 11B)o superiores. El exceso de proteína en el fondo se puede reducir incluyendo pasos de lavado adicionales con PBS.
La presencia de fondo proteico debe medirse y caracterizarse en cada experimento, calculando la intensidad de la fluorescencia de fondo(Figura 6E)y restándola de la intensidad de los micropatrones(Figura 6F-H y Figura 7B,D). El fondo de proteína alta puede tener un impacto en la fijación y la brotación de células CAD, comprometiendo la interpretación de los resultados.
Tener espacios entre unidades de diseño es un problema común cuando los usuarios tienen una experiencia limitada(Figura 11B),que se produce como resultado de una superposición insuficiente entre patrones. Dos parámetros en el software Leonardo se pueden ajustar para superar esto: 1) puede ser necesario un espaciado negativo entre columnas, dependiendo del diseño del patrón (paso 5.7 y ver figura 5B,C). Alternativamente, 2) utilice la opción de degradado en el menú Experto para coser las columnas. Una prueba rápida para determinar los parámetros de espaciado óptimos se puede realizar utilizando adhesivo UV(Tabla de materiales). Una pequeña gota de este adhesivo se aplica a un portaobjetos de vidrio, que luego se cubre con un cubreobjetos de vidrio, haciendo una película. El adhesivo UV incrustado está fotopatrónizado con la plantilla de patrón de interés utilizando una dosis láser baja (30 mJ/mm2). Las regiones expuestas a los rayos UV del adhesivo incrustado se curarán, haciéndose visibles bajo microscopía de campo brillante. Los resultados de la prueba se visualizan para evaluar el espaciado obtenido dentro del patrón. En nuestros experimentos neuronales, una brecha entre las rayas puede afectar negativamente el comportamiento celular, produciendo variaciones en la dinámica de crecimiento (ya sea velocidad reducida o abandono del camino).
En la última actualización del software Leonardo (en el momento de la publicación, Leonardo 4.11), es posible cargar plantillas de patrones más grandes previamente diseñadas que cubren un área mucho más grande (hasta 8 mm2 usando el objetivo 20X) de la superficie de micro-pozos en comparación con la actual 0,1 mm2 por unidad de diseño, eliminando la necesidad de unir las unidades de diseño más pequeñas. Los bordes indefinidos pueden resultar de la falta de ajuste del enfoque láser durante la generación del patrón(Figura 11C). Por lo tanto, es fundamental calibrar el láser y realizar pasos de patrón de referencia (véase el paso 4) antes del patrón. Las franjas mal definidas dan lugar a variaciones en el ancho de las rayas, lo que dificulta la correlación entre la dinámica de crecimiento del axón y el ancho de la franja. Los axones también tienden a abandonar rayas que tienen bordes difusos. Además, la variabilidad en los bordes también se puede encontrar al imprimir franjas de 10-20 ám de ancho o superior, lo que resulta en un mayor contenido de proteínas en los bordes en comparación con las regiones centrales del patrón(Figura 6B,D). Este efecto de borde se produce mediante una difusión no homogénea del fotoiniciador durante el proceso de fotopatrón. La reacción de fotocissión depende del oxígeno, que se difunde más en los bordes. Este efecto de borde se puede minimizar homogeneizando el fotoiniciador con una pipeta en el micropozo durante el proceso de fotopatrón. Además, un nuevo fotoiniciador comercializado (gel PLPP), también puede reducir el efecto de borde (equipo de soporte del sistema PRIMO, comunicación personal).
La microimpresión de más de una proteína puede dar lugar a la unión cruzada(Figura 9A-D). Esto se puede minimizar aumentando la eficiencia de bloqueo que se utiliza para ocupar sitios de unión inespecíficos entre los pasos de incubación para las dos proteínas diferentes. La unión cruzada de proteínas puede perturbar la reproducibilidad de los resultados experimentales y puede conducir a una interpretación errónea de los datos, ya que es difícil determinar la contribución de cada proteína a la dinámica de crecimiento del axón y a otros comportamientos celulares.
Conclusión Esperamos que el protocolo proporcionado mediante LIMAP facilite la generación de micropatrones proteicos mediante el uso del sistema PRIMO. Mientras que nuestro protocolo se centra en cómo producir de forma fiable micropatrones en superficies de vidrio 2D, otros han demostrado que es posible utilizar LIMAP para micro-patrones de sustratos blandos54,y superficies microestructuradas para cultivos3D 42. Estos micropatrones pueden ser una herramienta versátil para estudiar las respuestas celulares a los cambios en su microambiente.

En los últimos años, las ciencias biológicas han hecho cada vez más uso de los avances proporcionados por las ciencias materiales. Un ejemplo destacado es el micro-patrón de sustratos, que se puede utilizar para estudiar las respuestas celulares como la proliferación celular1,2Diferenciación3,4,5,6, migración celular7,8,9y búsqueda de caminos10,11. Hay una serie de técnicas disponibles que permiten el micro-patrón de sustratos, tales como fotoquímica excitada multifotón12, Nanolitografía afm dip-pen13, impresión directa de pin e inyección de tinta14, litografía de haz de electrones15o microfluidos16. Sin embargo, dos técnicas que se utilizan ampliamente en el campo biológico son la impresión de microcontactos17,18,19o patrones asistidos por láser3(Figura 1). El patrón asistido por láser se considera para ofrecer resultados más confiables en términos de estabilidad de proteínas y PEG y confinamiento celular en los patrones, en comparación con la impresión de microcontactos20. Un enfoque más novedoso para el micro-patrones descrito aquí es el uso de la adsorción molecular inducida por la luz de las proteínas21(LIMAP,Figura 1 D) utilizando un sistema disponible comercialmente (PRIMO,Tabla de materiales). Cada uno de los métodos tiene ventajas y limitaciones que se describen brevemente a continuación. La impresión de microcontactos utiliza moldes PDMS (sellos) con microfunciones deseadas que se generan a partir de maestros litografiados. Los sellos se incuban con una proteína elegida que luego se transfiere (estampada) al sustrato de cultivo celular18(Figura 1 Un). El patrón asistido por láser utiliza luz UV para cleave una película antiincrustante22,23,24,25, exponiendo regiones que posteriormente pueden ser recubiertas con la proteína de interés (Figura 1 B). Si bien la resolución alcanzada con enfoques de fotopatrones está en el rango de micras25,26, la mayoría de estas técnicas requieren una foto-máscara, ya sea en contacto con la muestra, o situada en el plano del objeto del objetivo del microscopio23,27,28. Los requisitos para las máscaras tanto en la impresión de microcontactos como en el patrón fotográfico pueden ser una limitación; máscaras específicas son necesarias para cada patrón geométrico y tamaño, que puede ser costoso y lento para generar. A diferencia de estas técnicas, LIMAP no requiere una máscara (Figura 1 D). El uso del sistema PRIMO para LIMAP puede ser intensivo en costos al principio porque requiere la compra de equipos. Sin embargo, el software de código abierto se utiliza para diseñar patrones de cualquier geometría deseada, dando mucha más libertad y permitiendo experimentos más complejos, incluyendo el uso de gradientes de concentración de proteínas. El láser PRIMO es controlado y dirigido por un dispositivo de microespejo controlado digitalmente (DMD) para crear patrones en cualquier número de geometrías definidas por el usuario. LIMAP requiere que la superficie de cultivo esté recubierta con moléculas que impidan la unión celular. El polietilenglicol (PEG) se utiliza más comúnmente como un reactivo "antifouling"; forma una película antiadhesiva densa en la superficie de vidrio o plástico29. Posteriormente, se añade un fotoiniciador que permite retirar la película PEG con alta precisión a través de un mecanismo de fotocissión30por la exposición local a la luz UV bajo el control del DMD. Estas regiones libres de PEG pueden ser recubiertas con proteínas que se adsorban a la superficie grabada con láser, generando un micro-patrón. Al variar la potencia del láser, se pueden eliminar diferentes cantidades de PEG de la superficie permitiendo al usuario generar gradientes de proteína. La eliminación de PEG y el procedimiento de recubrimiento se pueden repetir para crear patrones con dos o más proteínas distintas en el mismo micropozo21. Los micropatrones generados proporcionan superficies adhesivas para las células, lo que permite el estudio del comportamiento celular. En nuestros estudios, utilizamos micropatrones para estudiar la neurita o la búsqueda de axón de una línea celular neuronal (CÉLULAs CAD (Cathecholaminergic-a diferenciadas)31) o neuronas ganglios de raíz dorsal de rata primaria (DRG), respectivamente. Aquí, delineamos un protocolo paso a paso para LIMAP (Figura 2) utilizando el sistema PRIMO disponible comercialmente y el software Leonardo que lo acompaña. Demostramos cómo se puede utilizar para la generación de patrones con geometrías definidas y múltiples proteínas, que utilizamos para estudiar la búsqueda de rutas axonales. Discutimos los problemas comunes que pueden surgir y cómo se pueden evitar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 488 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20173</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>8100805</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conjugated fibrinogen-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti inverted</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-Image J</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov" target="_blank">www.imagej.nih.gov</a></td>
			<td>Version 2.0.0-rc-54/1.51f</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent highlighter</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>Stabilo Boss Original</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Working concentration: 1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkscape software</td>
			<td>Inkscape</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-red fluorescent rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>LMN01</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>version 4.11</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager software</td>
			<td>Open imaging</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized x/y stage</td>
			<td>PRIOR Scientific</td>
			<td>Proscan II</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Working concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Stencils</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>visit <a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>Laysan bio, Inc.</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Working concentration: 50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176752</td>
			<td>Working concentration: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>Classic PLPP</td>
			<td>Working concentration: 14.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP gel)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>Working concentration: 4.76% diluted in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS (also distributed by Alv&#233;ole)</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/ProductLookup.html?ProdNo=P4707&amp;Brand=SIGMA">P4707</a></td>
			<td>Working concentration: 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo equipment</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122">15140122</a></td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-alpha antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>DM1A</td>
			<td>Working concentration: 1:1000 
			CAD cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-beta 3 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td>Working concentration: 1:500 
			DRG neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>no phase ring (check updated catalogue)</td>
			<td>Working concentration: N.A. 
			**Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alv&#233;ole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins

Las células detectan una variedad de señales extracelulares, incluyendo la composición y geometría de la matriz extracelular, que es sintetizada y remodelada por las propias células. Aquí, presentamos el método de Adsorción Molecular Inducida por la Luz de Proteínas (LIMAP) utilizando el sistema PRIMO como una técnica de patrón para producir sustratos de matriz extracelular micro-patrón (ECM) utilizando una sola o combinación de proteínas. El método permite la impresión de patrones ECM en resolución de micras con excelente reproducibilidad. Proporcionamos un protocolo paso a paso y demostramos cómo esto se puede aplicar para estudiar los procesos de búsqueda de trayectoria neuronal. LIMAP tiene ventajas significativas sobre los métodos de microimpresión existentes en términos de la facilidad de patrón de más de un componente y la capacidad de generar un patrón con cualquier geometría o gradiente. El protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar la contribución de casi cualquier componente químico hacia el destino celular y el comportamiento celular. Por último, discutimos los problemas comunes que pueden surgir y cómo se pueden evitar.

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Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Nuestro objetivo general es entender cómo las células detectan señales extracelulares que conducen al crecimiento axonal dirigido. Aquí, describimos la metodología de la Adsorción Molecular Inducida por la Luz de Proteínas, utilizada para producir micropatrones definidos de componentes de matriz extracelular con el fin de estudiar eventos específicos que rigen el crecimiento de axón y la búsqueda de rutas.

Adsorción molecular inducida por la luz de proteínas utilizando el sistema PRIMO para micro-patrones para estudiar las respuestas celulares a las proteínas de matriz extracelular

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

El micro-patrón es una herramienta muy poderosa porque permite estudiar las respuestas celulares para definir señales bioquímicas y biofísicas que las células encuentran en los organismos vivos. A diferencia de otros métodos, el descrito es más flexible para la generación de patrones. Por ejemplo, permite la producción de gradientes y micro-patrones de múltiples proteínas con alta reproducibilidad.Nuestro grupo utiliza LIMAP no sólo para estudiar la búsqueda de caminos neuronales, sino también cómo otras células responden a las señales que tienen influencia en la proliferación celular, diferenciación y migración. El microdobo se utiliza para responder preguntas fundamentales en la biología celular. El conocimiento adquirido se puede utilizar para modificar los dispositivos existentes en la medicina regenerativa, por ejemplo, la reparación del nervio después de la lesión del nervio periférico.Comience diseñando plantillas para el patrón en el software de dibujo digital. Seleccione un tamaño de imagen de 1. 824 píxeles de longitud y 1, 140 píxeles de ancho. Diseñe la plantilla y guarde la plantilla como un archivo TIFF de 8 bits.Antes del patrón, limpie y active la superficie con un limpiador de plasma utilizando una presión de proceso de 1.000 a 1, 300 militores y una potencia de 29,6 vatios durante uno a cinco minutos. Utilice un plato de fondo de vidrio con un tamaño de pozo interior de 20 milímetros y un espesor de vidrio de 0,16 a 0,19 milímetros. Seleccione un plato de seis bienes o de un solo pozo, dependiendo del número de condiciones que se estén probando.Corte las plantillas PDMS en condiciones estériles para asegurarse de que encajan en el pozo interior de fondo de vidrio. Retire los rellenos de micropocillos internos con fórceps estériles y pegue bien las plantillas en el vidrio. Prepare una solución PLL-PEG de 0,1 miligramos por mililitro en PBS y agregue 20 microlitros a cada micropocillos.Luego, incuba el plato a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, retire 15 microlitros del PLL-PEG de cada pocóptica, y lávelo cinco veces con 20 microlitros de PBS sin dejar que se seque. Prepare un micropozo para crear un patrón de referencia eliminando 18 microlitros de PBS de un solo pozo y añadiendo cinco microlitros de fotoiniciador, dejando PBS en los micropocillos restantes.A continuación, utilice un resaltador fluorescente para marcar un pozo de vidrio interior vacío. Coloque el pozo por encima del objetivo y ajuste el enfoque objetivo hasta que el logotipo de PRIMO y el eslogan se ocupen de sus celdas"están enfocados. A continuación, registre la posición Z del plano focal.Para crear un patrón de referencia, visualice el borde del micropozo con el fotoiniciador utilizando la luz transmitida a través de la cámara y elija el símbolo ROI en el menú de la derecha. Seleccione PRIMO para cargar la plantilla de patrón deseada, que se proyectará en el ROI como una unidad de diseño. Vaya a una región periférica del micropocillos, seleccione Bloquear y ajuste el enfoque a la posición Z de calibración.A continuación, seleccione Reproducir para empezar a fotopatterning el patrón de referencia. Lave el micropozo del patrón de referencia tres veces con 20 microlitros de PBS para eliminar el fotoiniciador. A continuación, agregue 20 microlitros de matriz extracelular con etiqueta fluorescente, o ECM, solución proteica.Incubar el plato a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos, asegurándose de proteger bien la referencia de la luz. Después de la incubación, retire 18 microlitros de solución proteica y lave el pozo tres veces con 20 microlitros de PBS. Utilice un microscopio de epifluorescencia para visualizar el patrón de referencia.Ajuste el enfoque en los bordes del patrón a través de la trayectoria de la cámara y grabe la posición Z de acuerdo con el mejor enfoque. Esta posición será el enfoque láser óptimo utilizado para el patrón posterior. En condiciones estériles, retire 18 microlitros de PBS de todos los micropocillos.Añadir cinco microlitros del fotoiniciador a cada pozo, y homogeneizar por pipeteo arriba y abajo. Si modela varias proteínas en el mismo micropozo, cargue todos los conjuntos de plantillas de patrones deseadas simultáneamente. A continuación, seleccione el número de filas, columnas y dosis.Guarde la configuración de la plantilla como archivo en el software. Navegue hasta el área donde se produjo el patrón de referencia y ajuste el enfoque a la posición Z óptima. A continuación, seleccione Reproducir para iniciar el fotopaso.Las unidades de diseño se convierten de rojo a azul a medida que se completa el fotopatrón. Retire el fotoiniciador de los micropocillos lavándolos tres veces con 20 microlitros de PBS. Después del último lavado, retire 18 microlitros de PBS de cada micropocillos y agregue 20 microlitros de solución de proteína ECM.Incubar el plato a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos, asegurándose de protegerlo de la luz. A continuación, retire 15 microlitros de la solución proteica ECM y lave los micropocillos tres veces utilizando 20 microlitros de PBS. Para evitar la unión cruzada, agregue 20 microlitros de PLL-PEG, o BSA, a los micropocillos, e incubar el plato a temperatura ambiente durante una hora, en la oscuridad.A continuación, retire 15 microlitros del agente bloqueador y lave todos los micropocillos tres veces con 20 microlitros de PBS. Retire 18 microlitros de PBS y agregue 5 microlitros del fotoiniciador a cada micropocillos, asegurando que el fotoiniciador sea homogéneo en toda la superficie de los micropocillos. Navegue hasta el primer micropozo y cargue la configuración de la plantilla guardada previamente.A continuación, seleccione las acciones que se van a modelar para la segunda ronda de fotopatrón, asegurándose de anular la selección de las acciones de la primera ronda. Después del fotopatrón, retire el PLPP lavándolo con PBS. Luego, incuba durante 20 minutos con la segunda solución proteica ECM, y lava los micropocillos tres veces con 20 microlitros de PBS.Utilice un microscopio de epifluorescencia para visualizar e imaginar los patrones impresos. Cuando esté listo para planchar las células, agregue un mililitro de medio con células al vidrio interior bien, asegurándose de cubrir todos los micropocillos. Y coloque el plato de cultivo en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados centígrados y un 5%.Con el fin de garantizar que los patrones generados son una representación precisa de la plantilla, se obtienen mediciones de intensidad de fluorescencia a lo largo de las rayas, y de una región de fondo correspondiente por encima de cada franja. Los micromasmas definidos reproducibles se logran de 20 a 2 micrómetros de ancho, pero se puede observar un efecto de borde cuando la impresión cuenta con 20 micrómetros o más ancho. Las concentraciones de proteínas definidas se obtienen incubando con diferentes concentraciones de proteínas, o variando la dosis láser que se utiliza para cortar la película antiadhesiva.La intensidad del láser es proporcional al nivel de escala de grises de la plantilla, generando gradientes de iluminación UV. La medición del perfil de intensidad de fluorescencia a lo largo de la franja de degradado, es lineal en la plantilla de patrón y en el patrón de degradado generado. Este protocolo se puede utilizar para crear micro-patrones con múltiples proteínas en el mismo micropozo, tales como patrones cruzados con rayas horizontales de fibronectina, y rayas verticales de laminina.Pero es necesario un paso de bloqueo para evitar la unión cruzada de proteínas. Los patrones cruzados generados se pueden utilizar posteriormente para ensayos celulares con líneas celulares neuronales, o células CAD, o neuronas primarias, DRGs de rata. Al realizar este protocolo, los aspectos más importantes a recordar son hacer una calibración adecuada del sistema, no dejar que los micropocillos sequen durante los múltiples pasos de lavado, y el uso de los parámetros adecuados para la incubación y el bloqueo de proteínas.El análisis del comportamiento celular suele implicar microscopía, como fluorescencia, lapso de tiempo, AFM. La caracterización adicional puede comprender otros métodos bioquímicos, como el perfilado de expresión génica.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

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A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

Investigación

Neurociencias

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-Etiquetado Inmunoelectrónica incorporación de proteínas sinápticas en cultivos de cortes de hipocampo

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

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La<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

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Aislamiento de CA1 nucleares enriquecidos fracciones de hipocampo rebanadas para estudiar la actividad dependiente Nuclear importación de proteínas mensajeras Synapto nucleares

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The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

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En Vivo Sondas de microdiálisis método para recolectar grandes proteínas extracelulares de líquido intersticial cerebral con corte de peso molecular alto

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...