Name: light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins
Uploaded: 2019-10-11T13:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

Detta arbete stöds av BBSRC, EPSRC, MRC och Wellcome Trust. Den C.B. Laboratory är en del av Wellcome Trust Center för cell-Matrix Research, University of Manchester, som stöds av grundläggande finansiering från Wellcome Trust (Grant nummer 088785/Z/09/Z). Författarna vill erkänna finansieringen från Vetenskapsrådet för bioteknik och biologisk vetenskap (BBSRC) till C.M., K.J. (BB/M020630/1) och P.A. (BB/P000681/1) och av ingenjörs-och fysikalisk Vetenskapsrådet (EPSRC) och Medical Forskningsrådet (MRC) centrum för forskarutbildning i regenerativ medicin till Arvidsson (EP/L014904/1). Författarna tackar Alvéole för deras korrespondens och deras kundserviceteam. Författarna tackar Peter March och Roger Meadows från bioimaging Facility, University of Manchester för deras hjälp med mikroskopi. Den bioimaging Facility Mikroskop som används i denna studie köptes med bidrag från BBSRC, Wellcome Trust och University of Manchester strategiska fonden.

Författarna har inget att avslöja.

LIMAP (PRIMO) Micro-Patterning fördelar och jämförelse med microcontact utskrift Även microcontact utskrift är möjligen den mest använda mikro-Patterning teknik i det biologiska fältet39, det verkar finnas ett ökande antal forskare som använder limap teknik40,41,42 ,43,44. Här presenterade vi ett protokoll med PRIMO, ett kommersiellt tillgängligt system för LIMAP. Nedan diskuterar vi kortfattat potentiella fördelar och begränsningar av microcontact utskrift och LIMAP foto-mönkning.
Microcontact utskrift kräver litograferad plåt Masters produceras av spin-beläggning en foto-mask (i allmänhet SU-8) på ett glas eller kisel wafer, som sedan laseretsad med önskad mikro-funktioner. Dessa bakgrunder används som mallar för att skapa en PDMS Stamp45. Stämpeln är inkuberas med ett utvalt protein som absorberas av det, och sedan överförs (stämplas) på cellkultur skålen. Processen för adsorption av proteinet till PDMS stämpel är beroende av proteinkoncentration, buffert och inkubationstid. Dessa parametrar måste testas i förväg för optimala resultat46.
Masters kan användas i ett stort antal experiment, som varar i månader eller till och med år, om korrekt bevarade. Men en begränsande faktor för denna teknik är nödvändigheten att åter designa nya litograferade mästare för varje önskad modifiering. Förändringar i experimentella konstruktioner kan resultera i tidskrävande produktion av nya Masters (upp till flera veckor) vilket försenar experiment. I jämförelse kräver LIMAP photopatterning inte en läkarundersökning ledar-; den använder programvarugenererade mönstermallar som kan användas för att flexibelt anpassa önskade geometrier av mikro-mönster till förändrade forskningsfrågor. LIMAP kan också användas för att generera protein gradienter inom samma mikro-mönster (figur 8), vilket är svårare att få på ett reproducerbart sätt med hjälp av microcontact utskrift47.
Dessutom, den mikro-mönster upplösning uppnås med LIMAP, i vårt fall, är 2 μm (figur 6B).
Att närma sig denna resolution ökade variationer inom och mellan mönster. Att generera mönster runt eller över 10 μm bredd var mycket reproducerbar (figur 6G, H). Tvärtom, med microcontact utskrift är det svårt att konsekvent få upplösningar under 10 μm och det är vanligt att hitta artefakter när stämpling små funktioner (data som inte visas).
Vi har visat att LIMAP kan användas för att mikro-mönster flera proteiner (figur 9) inom samma mikro-brunn, vilket gör att ytterligare nivåer av komplexitet som skall läggas till experiment. Även om detta kan åstadkommas med microcontact utskrift, kan justera olika proteiner med hög precision vara tekniskt ganska krävande. Medan mönster flera proteiner med limap verkar rakt fram, är det viktigt att nämna att kors bindning av proteiner genom sekventiella beläggnings procedurer kan reduceras genom att blockera reagenser men inte helt elimineras (figur 9).
När det gäller kostnaden för en eller annan teknik, LIMAP som beskrivs här kräver inköp av mikro-Patterning utrustning (PRIMO) som kan installeras på olika fluorescensmikroskop och kräver en motoriserad fas. Även om denna investering är initialt kostnadskrävande, det finns inga ytterligare inköp än förbrukningsartiklar (stenciler, PEG och PLPP) på lång sikt i samband med LIMAP. Alternativt kan PDMS-stencilerna också produceras i labbet av den egna försöksledaren efter publicerade protokoll18,32. De största kostnaderna för tryckning av microcontact kan vara förknippade med produktionen av nya mästare, som kan bli betydande om experiment kräver nya mönster.
En nackdel med LIMAP är den relativt låga genomströmningsmetoden av denna teknik. Microcontact utskrift kan producera ett stort antal mikro-mönster snabbt och effektivt i en samtidig stämpling steg, jämfört med den erforderliga sekventiella laser Micro-Patterning med LIMAP. Till exempel är det möjligt att producera 6 stämplade glas täckband i ca 2 h med microcontact utskrift med PDMS frimärken (exklusive stämpel förberedelse); mönstra ett liknande område (6-väl maträtt) med limap skulle ta runt 4 h, exklusive förfarandet för ytan passivering (med tanke på mönstret mall konfiguration beskrivs i steg 5,12 och se figur 5B).
En annan hastighetsbegränsande faktor för LIMAP-tekniken är den långa belysningstid som krävs för möntring av stora ytor (30 s per konstruktionsenhet med en 7,5 mW/mm2 -laser). I dessa fall kan det vara ett alternativ att skriva ut med microcontact. En nyligen tillgänglig foto-initiativtagare (PLPP gel, tabell över material) bör avsevärt minska den tid det tar för mönstring, vilket möjliggör generering av hundratals mikro-mönster i stora områden (upp till 8 mm2) på bara några minuter.
En annan viktig faktor att ta hänsyn till när mikromönstrar ytor för cellodling är reproducerbarheten av mikro-mönster bland olika experimentella upprepningar, i jämförelse med den variation som erhålls med microcontact utskrift. Diagrammen som visas i figur 7B, D är till exempel representativa data för tre oberoende experimentella upprepningar med mycket likartade resultat (data visas inte). Baserat på vår erfarenhet och tidigare publikationer, denna nivå av reproducerbarhet är svårt att uppnå med microcontact utskrift48,49,50,51,52.
I motsats till andra foto-mönster tekniker som kräver antingen dedikerad kemi för att iscensätta ljuskänsliga material eller användning av foto-sensibiliserande, som i allmänhet inte är mycket biokompatibla3, den ljuskänsliga komponenten i limap (plpp ) är biokompatibelt och tolereras väl av celler21; i våra händer har vi inte upplevt någon cytotoxicitet i en mängd olika celler, inklusive CAD, DRG neuroner (figur 10), fibroblaster, epitelceller, och melanomceller (data som inte visas). En annan fördel med LIMAP med PRIMO jämfört med andra foto-mönster tekniker är att ingen photomasken krävs. Liknar microcontact utskrift, nya photomfrågar skulle behöva utformas och genereras för varje önskat mönster.
Alla de begränsningar som nämns ovan för microcontact utskrift, hänvisa till den manuella metoden av tekniken. Det är dock möjligt att förbättra dataflödet och reproducerbarheten av microcontact utskrift med hjälp av en automatiserad enhet med stämpel belastning och tryckkontroll53.
Viktiga steg i protokollet och problemlösning för LIMAP med PRIMO Ett av de vanligaste problemen som finns under detta protokoll är att ha höga nivåer av bakgrundsfluorescens i mikro-mönster. Detta kan bero på uttorkning av mikro-brunnar som ofta uppstår på grund av sin lilla volym. När detta inträffar, PBS kristaller ofta visas omger ECM mönster (figur 11A).
Otillräcklig eller ineffektiv tvättsteg efter proteininkubation kan också resultera i höga nivåer av bakgrundsfluorescens. Detta kan observeras särskilt vid användning av proteinkoncentrationer på 10 μg/mL (figur 11B) eller högre. Överskottet av protein i bakgrunden kan minskas genom att inkludera ytterligare tvättsteg med PBS.
Närvaron av protein bakgrund måste mätas och kännetecknas i varje experiment, beräkna bakgrundfluorescensintensiteten (figur 6E) och subtrahera den från Mikromönstren intensitet (figur 6F-H och figur 7B, D). Hög protein bakgrund kan ha en inverkan på fastsättning och groning av CAD-celler, vilket äventyrar tolkningen av resultaten.
Att ha luckor mellan designenheter är ett vanligt problem när användare har begränsad erfarenhet (figur 11B), som uppstår till följd av otillräcklig överlappning mellan mönstren. Två parametrar i Leonardo programvaran kan justeras för att övervinna detta: 1) ett negativt mellanrum mellan kolumnerna kan krävas, beroende på mönstret (steg 5,7 och se figur 5B, C). Alternativt, 2) Använd alternativet gradient i expert menyn för att sy kolumnerna. Ett snabbt test för att bestämma de optimala avstånds parametrarna kan utföras med UV-lim (tabell över material). En liten droppe av detta Lim appliceras på en glas rutschbana, som sedan täcks med en glastäckslip, vilket gör en film. Den inbäddade UV-lim är fotomönstrad med mönstret mall av intresse med hjälp av en låg laser dos (30 mJ/mm2). De UV-exponerade regionerna i den inbäddade lim kommer att botas, blir synlig under Bright-fältmikroskopi. Testresultaten visualiseras för att utvärdera det erhållna avståndet i mönstret. I våra neuronala experiment, en klyfta mellan ränder kan negativt påverka cellens beteende, producerar variationer i tillväxtdynamik (antingen reducerad hastighet eller nedläggning av vägen).
I den senaste uppdateringen av Leonardo programvara (vid tidpunkten för offentliggörandet, Leonardo 4,11), är det möjligt att ladda upp tidigare designade större mönster mallar som täcker ett mycket större område (upp till 8 mm2 med 20x mål) av mikro-brunn yta jämfört med nuvarande 0,1 mm2 per konstruktionsenhet, vilket eliminerar behovet av att sy ihop de mindre konstruktionsenheterna. Odefinierade kanter kan bero på bristande justering av laser skärpan under mönstergenerering (figur 11C). Det är därför viktigt att kalibrera lasern och utföra referensmönster steg (se steg 4) före mönstringen. Dåligt definierade ränder resultera i variationer i stripe bredd, vilket gör sambandet mellan Axon tillväxtdynamik och stripe bredd svårt. Axoner tenderar också att överge ränder som har diffuserade kanter. Dessutom kan variationer i kanterna också hittas vid utskrift av ränder på 10-20 μm bredd eller högre, vilket resulterar i en högre proteinhalt vid kanterna jämfört med de centrala delarna av mönstret (figur 6B, D). Denna kant effekt produceras av en icke-homogen diffusion av Photo-initieraren under photopatterning processen. Photoscission reaktionen är syre anhörigen, som sprider ut mer på kantar. Denna kant effekt kan minimeras homogenisera Photo-initieraren med en pipett i mikro-brunn under photopatterning processen. Dessutom kan en ny kommersialiserad foto-initiativtagare (PLPP gel), också minska Edge Effect (PRIMO system support team, personlig kommunikation).
Mikrotryck av mer än ett protein kan resultera i tvärbindning (figur 9A-D). Detta kan minimeras genom att öka blockeringseffektiviteten som används för att ockupera ospecifika bindnings platser mellan inkubationsstegen för de två olika proteinerna. Kors bindning av proteiner kan stör reproducerbarhet av experimentella resultat och kan leda till feltolkning av data, eftersom det är svårt att avgöra bidraget av varje protein till Axon tillväxtdynamik och andra cell beteenden.
Slutsats Vi hoppas att det medföljande protokollet med hjälp av LIMAP underlättar generering av protein mikromönster genom användning av PRIMO-systemet. Även om vårt protokoll fokuserar på hur man tillförlitligt producera mikro-mönster i 2D glasytor, andra har visat att det är möjligt att använda LIMAP för mikro-mönster av mjuka substrat54, och mikrostrukturerade ytor för 3D-kulturer42. Dessa mikro-mönster kan vara ett mångsidigt verktyg för att studera cellulära svar på förändringar i deras mikro-miljö.

De senaste åren har de biologiska vetenskaperna i allt högre grad fått använda sig av de framsteg som materialvetenskaper erbjuder. Ett framträdande exempel är mikro-mönkning av substrat, som kan användas för att studera cellulära reaktioner såsom cellproliferation1,2Differentiering3,4,5,6, cell migration7,8,9och pathfinding10,11. Det finns ett antal tillgängliga tekniker som möjliggör mikromönkning av substrat, såsom multiphoton upphetsad fotokemi12, AFM DIP-penna nanolithografi13, PIN-och Inkjet Direct-utskrift14, elektronstråle litografi15eller mikrofluidik16. Men två tekniker som ofta används i det biologiska fältet är microcontact utskrift17,18,19eller laserassisterad mönkning3(Figur 1). Laserassisterad mönstrar anses ge mer pålitliga resultat när det gäller protein och PEG stabilitet och cell inneslutning på mönstren, jämfört med microcontact utskrift20. En mer ny metod för mikro-Patterning beskrivs här är användningen av Ljusinducerad molekylär adsorption av proteiner21(LIMAP,Figur 1 D) med ett kommersiellt tillgängligt system (PRIMO,Tabell över material). Var och en av metoderna har fördelar och begränsningar som kortfattat beskrivs nedan. Microcontact utskrift använder PDMS formar (frimärken) med önskade mikro-funktioner som genereras från litograferad plåt Masters. Stämplarna inkuberas med ett utvalt protein som sedan överförs (stämplas) på cell odlingssubstrat18(Figur 1 A). Laserassisterad mönkning använder UV-ljus för att klyva en antifoulingfilm22,23,24,25, utsätta regioner som senare kan beläggas med proteinet av intresse (Figur 1 B). Medan den upplösning som uppnås med foto-mönkning närmar sig är i micron Range25,26, de flesta av dessa tekniker kräver en foto-mask, antingen i kontakt med provet, eller ligger i objekt planet av mikroskopet mål23,27,28. Kraven för masker i både microcontact utskrift och foto-mönster kan vara en begränsning; specifika masker krävs för varje geometriskt mönster och storlek, vilket kan vara dyrt och tidskrävande att generera. I motsats till dessa tekniker, LIMAP kräver inte en mask (Figur 1 D). Att använda PRIMO-systemet för LIMAP kan vara kostnadskrävande i början eftersom det kräver inköp av utrustning. Dock används programvara med öppen källkod för att designa mönster av önskad geometri, vilket ger mycket mer frihet och möjliggör mer komplexa experiment, inklusive användning av proteinkoncentrationsgradienter. PRIMO laser styrs och leds av en digitalt kontrollerad Micromirror Device-enhet (DMD) för att skapa mönster i valfritt antal användardefinierade geometrier. LIMAP kräver att odlingsytan är belagd med molekyler som förhindrar cell infästning. Polyetylenglykol (PEG) används oftast som en sådan "antifouling" reagens; den bildar en tät anti-lim film på glas eller plast yta29. Därefter en Photo-initiativtagare läggs som gör att PEG filmen tas bort med hög precision genom en fotoscission mekanism30genom lokal exponering för UV-ljus under kontroll av DMD. Dessa PEG-fria regioner kan beläggas med proteiner som adsorberas till den laseretsade ytan, vilket genererar ett mikro-mönster. Genom att variera lasereffekten kan olika kvantiteter av PEG avlägsnas från ytan så att användaren får möjlighet att generera proteingradienter. PEG-borttagning och beläggnings proceduren kan upprepas för att skapa mönster med två eller flera distinkta proteiner i samma mikro-och21. De genererade mikro-mönster ger lim ytor för celler, vilket gör att studera cell beteende. I våra studier använder vi mikro-Patterning för att studera neurit eller Axon pathfinding av en neuronala cellinjer (CAD (Cathecholaminergic-a differentierade) celler31) eller primära råttor dorsala-root ganglion (DRG) neuroner, respektive. Här skisserar vi ett steg-för-steg-protokoll för LIMAP (Figur 2) med hjälp av det kommersiellt tillgängliga PRIMO-systemet och medföljande Leonardo-programvara. Vi visar hur det kan användas för generering av mönster med definierade geometrier och multipla proteiner, som vi använder för att studera axonal pathfinding. Vi diskuterar vanliga frågor som kan uppstå och hur dessa kan undvikas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 488 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10235</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647 protein labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20173</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>8100805</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conjugated fibrinogen-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti inverted</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4759</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-Image J</td>
			<td><a href="http://www.imagej.nih.gov" target="_blank">www.imagej.nih.gov</a></td>
			<td>Version 2.0.0-rc-54/1.51f</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent highlighter</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>Stabilo Boss Original</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Working concentration: 1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkscape software</td>
			<td>Inkscape</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-red fluorescent rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>LMN01</td>
			<td>Working concentration: 10 &#956;g/ml 
			(diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leonardo software</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>version 4.11</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager software</td>
			<td>Open imaging</td>
			<td>Check last update</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized x/y stage</td>
			<td>PRIOR Scientific</td>
			<td>Proscan II</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Working concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Stencils</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>visit <a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-SVA</td>
			<td>Laysan bio, Inc.</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Working concentration: 50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176752</td>
			<td>Working concentration: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>Classic PLPP</td>
			<td>Working concentration: 14.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-initiator (PLPP gel)</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td>PLPP gel</td>
			<td>Working concentration: 4.76% diluted in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS (also distributed by Alv&#233;ole)</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/ProductLookup.html?ProdNo=P4707&amp;Brand=SIGMA">P4707</a></td>
			<td>Working concentration: 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo equipment</td>
			<td>Alv&#233;ole</td>
			<td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122">15140122</a></td>
			<td>Working concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-alpha antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>DM1A</td>
			<td>Working concentration: 1:1000 
			CAD cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin anti-beta 3 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td>Working concentration: 1:500 
			DRG neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well glass bottom dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-20-1.5-N</td>
			<td>Working concentration: N.A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective**</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>no phase ring (check updated catalogue)</td>
			<td>Working concentration: N.A. 
			**Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alv&#233;ole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins

Celler känner en mängd extracellulära ledtrådar, inklusive sammansättningen och geometrin hos den extracellulära matrisen, som syntetiseras och remodeled av cellerna själva. Här presenterar vi metoden för ljus-inducerad molekylär adsorption av proteiner (LIMAP) med hjälp av PRIMO-systemet som en mönster teknik för att producera mikromönstrade extracellulära matrix (ECM) substrat med hjälp av en enda eller kombination av proteiner. Metoden möjliggör tryckning av ECM-mönster i micron upplösning med utmärkt reproducerbarhet. Vi tillhandahåller ett steg-för-steg-protokoll och visar hur detta kan tillämpas för att studera processerna för neuronala pathfinding. LIMAP har betydande fördelar jämfört med befintliga mikro-Printing metoder i termer av enkel mönstra mer än en komponent och förmågan att generera ett mönster med någon geometri eller lutning. Protokollet kan enkelt anpassas för att studera bidraget från nästan alla kemiska komponenter mot cellernas öde och cell beteende. Slutligen diskuterar vi gemensamma frågor som kan uppstå och hur dessa kan undvikas.

Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins at JoVE.co

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Vårt övergripande mål är att förstå hur celler känner av extracellulära ledtrådar som leder till riktad axonal tillväxt. Här beskriver vi metoden för ljus-inducerad molekylär adsorption av proteiner, används för att producera definierade mikro-mönster av extracellulära matrix komponenter för att studera specifika händelser som styr Axon utväxt och pathfinding.

Ljusinducerad molekylär adsorption av proteiner med hjälp av PRIMO-systemet för Mikromönkning för att studera Cellresponser till extracellulära matrix proteiner

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Mikro-mönstrar är ett mycket kraftfullt verktyg eftersom det gör det möjligt att studera cellulära svar för att definiera biokemiska och biofysiska signaler som celler möter i levande organismer. I motsats till andra metoder är den beskrivna mer flexibel för mönstergenerering. Till exempel, det tillåter produktion av gradienter och mikro-mönster av flera proteiner med hög reproducerbarhet.Vår grupp använder LIMAP inte bara för att studera neuronal pathfinding, men också hur andra celler reagerar på signaler som har inflytande på cellproliferation, differentiering och migration. Mikro-mönstring används för att besvara fundamentala frågor inom cellbiologin. Den fick kunskap kan användas för att modifiera befintliga enheter i regenerativ medicin, till exempel, nerv reparation efter perifer nerv skada.Börja med att utforma mallar för mönster på digital ritprogramvara. Välj en bildstorlek på 1, 824 pixlar i längd och 1, 140 pixlar i bredd. Designa mallen, och spara mallen som en 8-bitars TIFF-fil.Innan du mönstrar, rengör och aktiverar ytan med en plasmarengörare med hjälp av ett processtryck på 1, 000 till 1, 300 millitorr och en effekt på 29,6 watt under en till fem minuter. Använd en glas-botten skålen med en 20-millimeters inre brunnsstorlek och glastjocklek på 0,16 till 0,19 millimeter. Välj antingen en sex-brunn eller en enda brunn maträtt, beroende på antalet villkor som testas.Skär PDMS schabloner under sterila förhållanden för att säkerställa att de passar i den inre glas-botten väl. Ta bort de inre mikrobrunnsfyllningar med sterila tuten, och stick stencilerna på glasbrunnen. Förbered en 0,1-milligram per milliliter PLL-PEG-lösning i PBS, och lägg till 20 mikroliter till varje mikrobrunn.Sedan, inkubera skålen i rumstemperatur i en timme. Efter inkubation, ta bort 15 mikroliter av PLL-PEG från varje brunn, och tvätta den fem gånger med 20 mikroliter PBS utan att låta den torka. Förbered en mikrobrunn för att skapa ett referensmönster genom att ta bort 18 mikroliter PBS från en enda brunn och lägga till fem mikroliter av fotoinitiator, vilket gör att PBS i de återstående mikrobrunnarna.Använd sedan en fluorescerande highlighter för att markera en tom inre glas väl. Placera väl över målet, och justera objektivt fokus tills PRIMO logotypen och tagline ta hand om dina celler "är i fokus. Sedan, spela in Z-positionen för fokalplanet.För att skapa ett referensmönster visualiserar du kanten på mikrobrunn med fotoinitiatorn med hjälp av det överförda ljuset genom kameran och väljer ROI-symbolen från högermenyn. Välj PRIMO för att ladda upp önskad mönstermall, som kommer att projiceras på ROI som en designenhet. Navigera till en perifer region i mikrobrunn, välj Lås och justera fokus till Z-positionen för kalibreringen.Sedan väljer du Spela upp för att börja fotomönster. Tvätta referensmönstret microwell tre gånger med 20 mikroliter pbs för att ta bort fotoinitiatorn. Sedan, tillsätt 20 mikroliter av fluorescerande märkt extracellulär matris, eller ECM, proteinlösning.Inkubera skålen i rumstemperatur i 10 till 20 minuter, se till att skydda referensen väl från ljus. Efter inkubation, ta bort 18 mikroliter proteinlösning, och tvätta brunnen tre gånger med 20 mikroliter pbs. Använd ett epifluorescensmikroskop för att visualisera referensmönstret.Justera fokus på mönsterkanterna genom kamerabanan, och spela in Z-positionen enligt bästa fokus. Denna position kommer att vara den optimala laserfokus som används för efterföljande mönster. Under sterila förhållanden, ta bort 18 mikroliter PBS från alla mikrobrunnar.Lägg till fem mikroliter av fotoinitiatorn till varje brunn, och homogenisera genom pipettering upp och ner. Om mönster flera proteiner i samma microwell, ladda upp alla uppsättningar av önskade mönster mallar samtidigt. Välj sedan antalet rader, kolumner och dos.Spara mallkonfigurationen som fil i programvaran. Navigera till området där referensmönstret producerades, och justera fokus till den optimala Z-positionen. Sedan väljer du Spela upp för att initiera fotomönster.Konstruktionsenheterna blir från rött till blått när fotomönstereringen är klar. Ta bort fotoinitiatorn från mikrobrunnarna genom att tvätta dem tre gånger med 20 mikroliter PBS. Efter den sista tvätten, ta bort 18 mikroliter pbs från varje microwell, och tillsätt 20 mikroliter av ECM proteinlösning.Inkubera skålen i rumstemperatur i 20 till 30 minuter, se till att skydda den från ljus. Därefter tar du bort 15 mikroliter av ECM-proteinlösningen och tvättar mikrobrunnarna tre gånger med 20 mikroliter PBS. För att förhindra korsbindning, tillsätt 20 mikroliter PLL-PEG, eller BSA, till mikrobrunnarna, och inkubera skålen i rumstemperatur i en timme, i mörker.Ta sedan bort 15 mikroliter av blockeringsmedlet och tvätta alla mikrobrunnar tre gånger med 20 mikroliter PBS. Ta bort 18 mikroliter av PBS, och tillsätt 5 mikroliter av fotoinitiatorn till varje microwell, vilket säkerställer att fotoinitiatorn är homogen på hela ytan av mikrobrunnarna. Navigera till den första mikrobrunn, och ladda mallkonfigurationen som sparats tidigare.Välj sedan de åtgärder som ska mönstrades för den andra omgången av fotomönster, se till att avmarkera åtgärder från den första omgången. Efter fotomönstertagning, ta bort PLPP genom att tvätta med PBS. Sedan, inkubera i 20 minuter med den andra ECM proteinlösningen, och tvätta mikrobrunnarna tre gånger med 20 mikroliter PBS.Använd ett epifluorescensmikroskop för att visualisera och avbilda de tryckta mönstren. När du är redo att platta cellerna, tillsätt en milliliter medium med celler till det inre glaset väl, se till att täcka alla mikrobrunnar. Och placera kultur skålen i en 37 grader celsius, och 5% koldioxid inkubator.För att säkerställa att de genererade mönstren är en exakt återgivning av mallen erhålls fluorescensintensitetsmätningar längs ränderna, och från en motsvarande bakgrundsregion ovanför varje rand. Reproducerbara definierade mikromönster uppnås från 20 till 2 mikrometer i bredd, men en kanteffekt kan observeras vid utskrift av funktioner 20 mikrometer eller bredare. Definierade proteinkoncentrationer erhålls genom att antingen inkubera med varierande koncentrationer av protein, eller variera den laserdos som används för att klyva antiadhesivfilmen.Laser intensitet är proportionell mot gråskala nivå av mallen, genererar gradienter av UV-belysning. Mätningen av fluorescensintensitetsprofilen längs övertoningens rand, är linjär i mönstermallen och i det genererade toningsmönstret. Detta protokoll kan användas för att skapa mikro-mönster med flera proteiner i samma microwell, såsom korsmönster med horisontella ränder av fibronectin, och vertikala ränder av laminin.Men ett blockerande steg är nödvändigt för att förhindra korsbindning av proteiner. Den genererade kors mönster kan senare användas för cellulära analyser med neuronala cellinjer, eller CAD-celler, eller primära nervceller, råtta DRGs. När du utför detta protokoll, de viktigaste aspekterna att komma ihåg gör en ordentlig systemkalibrering, inte låta microwells torkar ut under flera tvättsteg, och med hjälp av rätt parametrar för protein inkubation och blockering.Analys av cellbeteende innebär vanligtvis mikroskopi, såsom fluorescens, time-lapse, AFM. Ytterligare karakterisering kan omfatta andra biokemiska metoder, såsom genuttrycksprofilering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

Med hjälp av en jämförande Arter metoden för att undersöka neurobiologi av Paternal svar

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-inbäddade immunoguld Märkning av Synaptic proteiner i hippocampus slice kulturer

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

ETT<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modellsystem för Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Differential Märkning för cell-ytan och internalis Proteiner efter Antibody Utfodring av Live odlade nervceller

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Isolering av CA1 Nuclear anrikade Fraktioner från hippocampus skivor att studera aktivitetsberoende Nuclear Import av Synapto-nukleära Messenger Proteiner

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Luktsystemet som en modell för att studera axonal tillväxt Mönster och morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Använda Linear Agarose kanaler att studera<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Genomsökning Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

I livmodern elektroporering Approaches att studera retbarhet av neuronala Subpopulationer och encelliga Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsberoende ökning av nätverkssvaret till stimulering av neuronala cellkulturer på mikroelektroder

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

In Vivo Mikrodialys metod att samla stora extracellulära proteiner från hjärnan interstitiell vätska med High-molecular vikt Cut-off sonder

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...