Name: a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل حكومة ماينكو الإسبانية منح BFU2014-58686-P (LAN) وSAF-2017-84708-R (DJB). تم دعم الشبكة المحلية من قبل ماينكو رامون ذ كاخال الوطنية زمالة RYC-2012-11700 وجائزة خطة GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), وFMN من قبل الإقليمية ValI +D الطلاب من الجنرالات فالنسيا ACIF/2016/020. ويود البرنامج أن ينوه بالبروفيسور إيوا ك. بالوش على التمويل. نشكر الدكتورة أليسيا مارتينيز روميرو (خدمة قياس الخلايا CIPF) على المساعدة في منصة IN Cell Analyzer.

وقد سبق أن وافقت لجنة الأخلاقيات التابعة للمؤسسة على جميع التجارب على الحيوانات. تم إيواء الفئران في منشأة خالية من مسببات الأمراض في مركز الاستثمار Príncipe فيليبي (فالنسيا، إسبانيا)، مسجلة كمربي الحيوانات التجريبية، والمستخدم، ومركز العرض (reg. لا. ES 46 250 0001 002) بموجب اللوائح الأوروبية والإسب?...

<ol>
	<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+in+liver+tissue.">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+polyploidy:+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide?.">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?.</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Restricts+Hepatocyte+Proliferation+and+Liver+Regeneration+in+Mice.">The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice.</a> Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploid+Hepatocytes+Facilitate+Adaptation+and+Regeneration+to+Chronic+Liver+Injury.">Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury.</a> The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver.">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li><li>Chao, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clock+regulates+hepatic+polyploidy+by+modulating+Mkp1-Erk1/2+signaling+pathway.">Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway.</a> Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).</li><li>Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin/Akt+pathway+controls+a+specific+cell+division+program+that+leads+to+generation+of+binucleated+tetraploid+liver+cells+in+rodents.">The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).</li><li>Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+polyploidization+and+its+association+with+pathophysiological+processes.">Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (5), e2805 (2017).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Toyoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+to+hepatocyte+ploidy+and+binuclearity+profiles+during+human+chronic+viral+hepatitis.">Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis.</a> Gut. 54 (2), 297-302 (2005).</li><li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+and+Unconventional+Cell+Division+of+Hepatocytes+Underlie+Liver+Regeneration.">Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration.</a> Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. , (2019).</li><li>Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+determining+ploidy+distributions+in+liver+tissue+by+stereological+analysis+of+nuclear+size+calibrated+by+flow+cytometric+DNA+analysis.">A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis.</a> Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).</li><li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Cell+Polyploidization:+A+Pivotal+Role+for+Binuclear+Hepatocytes.">Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li><li>Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+mouse+hepatocyte+ploidy+-+I.+Preparative+and+mathematical+protocol.">Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol.</a> Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).</li><li>Manzano-N&#250;&#241;ez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury.">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214 (2015).</li><li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+of+normal+mouse+liver:+A+histological,+quantitative+immunocytochemical,+and+fine+structural+analysis.">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li><li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells.">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li><li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hepatocyte+ploidy+levels+with+body+size+and+growth+rate+in+mammals.">Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals.</a> Genome. 44 (3), 350-360 (2001).</li><li>Tanami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+zonation+of+liver+polyploidy.">Dynamic zonation of liver polyploidy.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).</li><li>Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+and+liver+proliferation.">Polyploidy and liver proliferation.</a> Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).</li><li>Uhl&#233;n, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-based+map+of+the+human+proteome.">Tissue-based map of the human proteome.</a> Science. 347 (6220), 1260419 (2015).</li></ol>

يتم وصف نهج عالي المحتوى وعالي الإنتاجية لتحليل إعادة عرض الأنسجة وتقدير البوليد النووي الكبدي في كبد المورين. بمجرد معرفة الإجراء، يمكن للمستخدم معالجة عينات متعددة وصورتها وتحليلها في فترة 3-5 أيام، مما يؤدي إلى إنشاء مجموعات بيانات كبيرة قابلة للاختبار توفر توقيعًا مفصلًا لصحة الكبد. ?...

يمكن أن تخضع خلايا الكبد في الكبد الثديي للخلايا المتوقفة لإنتاج خلايا ثنائية النووي ، وتكرار الحمض النووي لإنتاج نواة متعددة البلوية تحتوي على ما يصل إلى محتوى الحمض النووي 16N. زيادة إجمالية الخلوية والنووية في البوليد خلال تطور ما بعد الولادة، والشيخوخة واستجابة للضغوط الخلوية المتنوعة1. عملية تعدد البلح ديناميكية وعكسها2، على الرغم من أن وظيفتها البيولوجية الدقيقة لا تزال غير واضحة3. ويرتبط زيادة ploidy مع انخفاض القدرة التكاثرية4،والتنوع الوراثي2،والتكيف مع الإصابة المزمنة5 وحماية السرطان6. التعديلات بوكريات يبيدي تحدث نتيجة لإيقاع circadianالمعدلة 7, والفوط8. أبرزها, يتم تغيير الملف الجانبي بليفي للكبد من قبل الإصابة والمرض9,وتشير أدلة دامغة إلى أن تغييرات محددة ploidy, مثل زيادة ≥ 8N نواة أو فقدان خلايا الكبد 2N, توفير توقيعات مفيدة لتتبع مرض الكبد الدهني غير الكحولية (NAFLD) تطور3,,10,أو التأثير التفاضلي للعدوى الفيروسية11.
بشكل عام، ترتبط إصابة الكبد وتجديد مع زيادة حجم خلايا الكبد والمنطقة النووية12،جنبا إلى جنب مع انخفاض الأعداد الإجمالية من خلايا الكبد، ولا سيما تلك التي مع محتوى الحمض النووي 2N10،,11. كما أن إصابة Parenchymal في الكبد كثيرا ما يرافقه امكانية توسع الخلايا غير parenchymal (NPCs) ، بما في ذلك الخلايا العضلية سترومال ، والخلايا الالتهابية وخلايا السلف الكبد ية القدرات. طرق عالية الإنتاجية التي توفر لمحة كمية من الخلايا من عدد الخلايا parenchymal وploidy النووية، في حين المحاسبة أيضا للتغيرات في NPCs، وبالتالي لديها إمكانات كبيرة كأدوات بحثية وسريرية لتتبع استجابة الكبد أثناء الإصابة والمرض. مقنعة في الآونة الأخيرة تحليل في الموقع من أطياف ploidy في عينات بشرية من سرطان الكبد الخلوي أيضا تبين أن يتم زيادة كبيرة في البلبيدية النووية داخل الأورام ويتم تضخيمها على وجه التحديد في الأنواع الفرعية للورم أكثر عدوانية مع انخفاض التمايز وفقدان TP5313. وبالتالي، هناك احتمال قوي بأن يساعد التقدم المنهجي في التقييم الكمي للبوليدي النووي في التنميط التكهني لسرطان الكبد في المستقبل.
في هذا البروتوكول ، يتم وصف منهجية مرنة عالية الإنتاجية للتحليل المقارن لأقسام أنسجة كبد الماوس ، والتي توفر التنميط الخلوي التفصيلي لأرقام الخلايا الكبدية ، واستجابة المجلس الوطني للصحافة وطريقة معايرة داخليًا لتقدير ploidy النووي(الشكل 1). وتتميز خلايا الكبد عن الخلايا النووية من قبل عامل الكبد النووي 4 ألفا (HNF4α) وضع العلامات المناعية، قبل توصيف حجم نووي وقياس مورفومات النووية. يتم تقدير "الحد الأدنى من محتوى الحمض النووي" لجميع الأقنعة النووية الدائرية عن طريق دمج كثافة هويشت 33342 (وكيل لكثافة الحمض النووي) مع الحجم النووي ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) المُبلغ به. ثم يتم معايرة الحد الأدنى من محتوى الحمض النووي الكبدي باستخدام NPCs لتوليد ملف تعريف ploidy النووية.
يتم إجراء الحصول على الصور والتقسيم النووي وتحليل الصور باستخدام التصوير عالي المحتوى ، مما يتيح فحص مساحات كبيرة من أقسام الكبد ثنائية الأبعاد (2D) التي تحتوي على عشرات الآلاف من الخلايا. يتم توفير برنامج مكتوب خصيصًا للمعالجة الآلية لبيانات تحليل الصور عالية المحتوى لإنتاج ملف تعريف بويدي على نطاق العينة لجميع نواة الكبد الدائرية. يتم تنفيذ هذا باستخدام البرمجيات مجانا لتحميل لحساب ploidy النووية على أساس تحليل الصور ستيريولوجي (SIA)10،11،14،15. وقد تم التحقق من منهجية SIA سابقا عن طريق قياس الخلايا التدفق كطريقة دقيقة، وإن كانت شاقة، لتقدير الكبد النووي ploidy في الكبد14،على افتراض مورفولوجيا نووية دائرية وعلاقة رتيبة بين الحجم النووي ومحتوى الحمض النووي. وفي هذا البروتوكول، تقاس كلا البارامترات النووية بتقييم قياس المورفولوجيا النووية ووضع العلامات على هويشت 33342. ويتبع حساب "الحد الأدنى من محتوى الحمض النووي" لكل قناع نووي معايرة للبوليد النووي الكبدي باستخدام مصادر القدرة النووية، التي لها محتوى معروف للحمض النووي 2-4N وبالتالي فهي بمثابة رقابة داخلية مفيدة.
وبالمقارنة بأساليب قياس الخلايا التقليدية في التدفق16، يتيح النهج الموصوف تقييم البوسيتي النووي الكبدي في الموقع ولا يتطلب الوصول إلى الأنسجة الطازجة أو أساليب التصنيف التي يمكن أن تحيّز النتائج ويصعب توحيدها. وكما هو الحال مع جميع النهج القائمة على المبادرة، فإن الفئات الفرعية النووية الخالية من المواد النووية > 2N ممثلة تمثيلاً ناقصاً بأخذ العينات من الأبعاد الثانية بسبب تقسيم النوى الأكبر خارج المستوى الاستوائي. كما يصف الملف الشخصي على نطاق الأنسجة الحد الأدنى من محتوى الحمض النووي لجميع الأقنعة النووية المنتقلة للكبد، ولا يميز بشكل مباشر بين خلايا الكبد أحادية النووي والخلايا النووية الثنائية التي تحتوي على نويتين منفصلتين ("غير مؤثرة") من نفس البوسيتي. ومع ذلك، فإن بساطة هذا البروتوكول تسمح بتكييف نطاق كبير لمراعاة بارامترات إضافية مثل التباعد بين النواة أو تحليل محيط الخلايا، من شأنها أن تسهل تحديد الخلايا النووية الثنائية التي توفر تقييمًا أكثر تفصيلاً للخلايا الخلوية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)</td>
			<td>TestDiet</td>
			<td>1810704</td>
			<td>Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM1850 UV</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>CM1850 UV</td>
			<td>Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statistical software for graphing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IN Cell Analyzer 1000</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td>
			<td></td>
			<td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>630-2864</td>
			<td>Size of 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Speadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Tissue Tek</td>
			<td>Pascual y Furi&#243;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>141451.121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen for immunostaining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>5mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine Microscope Slides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-79380</td>
			<td>Dilution 1:250 (alternative)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6556</td>
			<td>Dilution 1:200 (antibody used in the study)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice

عندما يصاب الكبد، تنخفض أعداد خلايا الكبد، في حين أن حجم الخلية وحجمها النووي وزيادة البوليد. التوسع في الخلايا غير parenchymal مثل cholangiocytes، الخلايا العضلية، السلف والخلايا الالتهابية تشير أيضا إلى تلف الكبد المزمن، وإعادة عرض الأنسجة وتطور المرض. في هذا البروتوكول، نصف نهج بسيط عالي الإنتاجية لحساب التغيرات في التركيب الخلوي للكبد المرتبطة بالإصابة والأمراض المزمنة والسرطان. نعرض كيف يمكن استخدام المعلومات المستخرجة من أقسام الأنسجة ثنائية الأبعاد (2D) لقياس ومعايرة البوسيتي النووي الكبدي داخل عينة وتمكين المستخدم من تحديد موقع مجموعات فرعية محددة داخل الكبد في الموقع. تتطلب طريقتنا الوصول إلى مواد الكبد الثابتة /المجمدة، وكواشف الكيمياء المناعية الأساسية وأي منصة تصوير قياسية عالية المحتوى. وهو بمثابة بديل قوي لتقنيات قياس الخلايا القياسية للتدفق ، والتي تتطلب تعطيل الأنسجة التي تم جمعها حديثًا ، وفقدان المعلومات المكانية والتحيز المحتمل للتصنيف.

وقد استخدمت هذه الطريقة لقياس تأثير الإصابة البَلْفة على كبد الفأر البالغ عن طريق تغذية الحيوانات لمدة 0-21 يوماً بنظام غذائي سام بالكبد يحتوي على 0.1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC)17. وقد زادت نتائج التغذية المزمنة DDC في الإصابة الكبدية البلية توسع biportal من NPCs. يجب أ?...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

نحن نقدم طريقة قوية وفعالة من حيث التكلفة ومرنة لقياس التغيرات في عدد الكبد وploidy النووية داخل عينات الأنسجة الثابتة / cryopreserved التي لا تتطلب قياس خلايا التدفق. نهجنا يوفر توقيع عينة قوية على نطاق واسع من علم خلايا الكبد مثالية لتتبع تطور إصابات الكبد والمرض.

طريقة عالية الإنتاجية في الموقع لتقدير البليدي النووي الكبدي في الفئران

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

هذه الطريقة تمكن المستخدم من توليد لمحة عن محتوى الحمض النووي الكبد من أقسام الأنسجة 2D لدراسة تطوير الكبد، والتجدد، والأمراض المزمنة. ويمكن تطبيق هذا النهج الإنتاجية العالية الآلي على جميع أقسام أنسجة الكبد 2D، وتوفير قراءات معايرة داخليا من ploidy النووية لجميع نويات الكبد الدائرية بسيطة. وترتبط التغيرات في ploidy النووية الكبدية مع الشيخوخة, أمراض الكبد المزمنة, والسرطان.هذه التقنية توفر وسيلة بسيطة لملف ploidy النووية في عينات الكبد ثابتة أو cryopreserved. في الموقع طرق التنميط ploidy لديها إمكانات كبيرة كالبحوث والأدوات السريرية لتتبع تطور أمراض الكبد لأنها لا تتطلب إزالة التصنيف العنصري الأنسجة أو الوصول إلى المواد الجديدة. بعد حصاد العينة أنسجة الكبد مورين, تضمين فصوص الكبد في درجة حرارة قطع الأمثل مملوءة المبردة وضع القالب على الفور على الجليد الجاف لضمان التجميد السريع.للحصول على شرائح من عينة الفصوص الكبد المجمدة، مقطع العينة بسمك ستة ميكرومتر، ووضع شريحة مطلية بالبولي أميد المغلفة على كل عينة لمدة خمس ثوان للسماح لكل عينة عصا الشريحة. عندما يتم جمع جميع الشرائح ، والسماح للعينات لتكلس لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل immunolabeling. في نهاية التوازن، وإصلاح أقسام الأنسجة في غطاء الدخان مع ملليلتر واحد من 4٪ شبهفورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.في نهاية التثبيت ، شطف الشرائح مع ثلاث يغسل ثلاث دقائق في برنامج تلفزيوني مع التحريض لطيف. بعد الغسيل الأخير، جفف المنطقة المحيطة بكل قسم من الأنسجة واستخدم قلمًا محمّلًا لرسم دائرة حول كل عينة. ل Permeabilize العينات، وعلاج المقاطع مع السطح 0.5٪ غير الأيونية في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة، وغسل العينات لمدة ثلاث دقائق في برنامج تلفزيوني مرتين مع التحريض لطيف كما هو موضح قبل منع الربط غير محددة مع محلول المصفاة من 1٪ البوم البقرية، 5٪ مصل الحصان، و 0.2٪ السطح غير الأيونيك في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة HHF4-ألفا المخففة في عازلة منع بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية في غرفة تلطيخ رطبة محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي ، وغسل الشرائح أربع مرات في برنامج تلفزيوني مع التحريض لطيف قبل الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي الفلوري المناسب وHoechst المخفف في تصفية 1 ٪ البوم البقرية و 0.2 ٪ غير الأيونيك السطحي في برنامج تلفزيوني لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في غرفة تلطيخ رطبة محمية من الضوء.في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح أربع مرات كما هو موضح، تليها اثنين من يغسل ثلاث دقائق في الماء المقطر مزدوجة مع الانفعالات لطيف. بعد الغسيل الأخير، قم بتركيب العينات مع قطرتين من الفلوريسنس المتصاعد المتوسط على غطاء، وطبق ضغط لطيف عند الضرورة للقضاء على أي فقاعات. ثم، تحقق من الشرائح باستخدام المجهر الفلوري التقليدي لضمان التثبيت الجيد والمناعة.للحصول على صورة الفلوريسنس، قم بتعيين المعلمات على منصة تصوير عالية المحتوى للحصول على صور الفلورسينس باستخدام الإثارة المناسبة للفلوروفوريس المستخدمة. ثم مسح العينات للحصول على صور كافية للحصول على تغطية كاملة من قسم الأنسجة. في نهاية المسح، ضبط المعلمات تجزئة النووية من البرنامج لضمان أن يتم عزل النوى على النحو الأمثل وتعديل كثافة عتبة لضمان البوابات الأمثل من خلايا الكبد الإيجابية HNF4-ألفا وHNF4-ألفا السلبية غير parenchymal الخلايا.بالنسبة للكمية النووية، تعيين المنطقة النووية في ميكرومتر مربع على أساس تلطيخ Hoechst، وكثافة هويشست النووية الرئيسية، وعامل استطالة النووية، ومؤشر التقريب النووي المتوسط، وحالة HNF4-alpha، وإحداثيات X النووية، Y على أساس مركز الثقل. لإجراء تحليل ploidy النووية hepatocyte، أولا تحميل وتثبيت برنامج تحليل الكم ploidy. في MATLAB، انتقل إلى علامة التبويب التطبيق من قطاع الأدوات وانقر فوق تثبيت التطبيق.افتح برنامج تثبيت تطبيق Ploidy ML. ستظهر رسالة لتأكيد التثبيت الناجح. في كل ملف تحليل البيانات، وتشمل ورقة يطلق عليها، قياسات الخلية، التي تحتوي على جميع البيانات المطلوبة لتحليل ploidy المنصوص عليها في الأعمدة كما هو مبين.بالنسبة لكل حالة تجريبية، قم بتوفير مجموعة بيانات تحكم سيتم استخدامها لحساب الرقابة الداخلية لمعايرة ploidy النووية من اثنين إلى أربعة N. للنسخ المتماثلة البيولوجية، قم بتخزين كل جدول بيانات في المجلد الخاص به، وتسمية بادئات المجلد بشكل متزايد. بعد ذلك، إطلاق تطبيق Ploidy.ستظهر واجهة المستخدم الرسومية للتطبيق Ploidy. انقر فوق الزر المسار إلى التحكم البيانات للانتقال إلى المجلد الذي توجد فيه النسخ المتماثل لبيانات عنصر التحكم. ثم يظهر مسار البيانات هذا في الواجهة.في بادئة المجلد، اكتب الاسم الذي سيتم إعطاؤه لملفات الإخراج. انقر فوق الزر مسار إلى بيانات أخرى وانتقل إلى المجلد الذي توجد فيه النسخ المتماثلة البيانات المقارنة. ثم يظهر مسار البيانات هذا في الواجهة.ثم انقر فوق تشغيل. عند اكتمال التحليل، سيقرأ شريط المعلومات تحليل "اكتمال". بعد التميّز المناعي، من المهم التحقق من جميع الشرائح بواسطة المجهر المفلوري التقليدي للتأكد من أنه تم الحصول على تثبيت وتلطيخ جيد.يمكن أن يشير تشويه أو طمس صبغة Hoechst إلى عدم كفاية التثبيت أو تحلل العينة قبل التثبيت. وينبغي تحسين بارامترات العزل النووي وبارامترات عتبة HNF4-alpha بعناية قبل التحليل التلقائي للصور بحيث تعكس على نطاق واسع النمط البصري للمناعة التي لوحظت عن طريق المجهر المفلور. بعد تحليل الصورة، ينبغي أن تعكس البيانات الأعداد المتزايدة من الخلايا غير البارينشية والحد الصغير، ولكن الكبير، في أرقام النوى الإيجابية HNF4-alpha داخل الكبد مع إصابة DDC.في الكبد التحكم الصحي, ما يقرب من 63٪ من النوى الإيجابية HNF4-ألفا يحمل morphometry دائري بسيط. وينبغي أن تعكس المقارنة بين اللواطي النووية النسبية بين مجموعات التحكم ومجموعات المعالجة المعالجة من DDC خسارة كبيرة في 2C و 4C من كريات الكبد مع الإصابة مع زيادة أعداد الخلايا الأكبر من 8C. يمكن استجواب المعلومات الموضعية النسبية لكل مجموعة فرعية من ploidy عن طريق استرداد الموقع 2D من مجموعات فرعية كبدية معينة ضمن برنامج تحليل الصور عالي المحتوى.يمكن إجراء التلقيح المناعي مع أجسام مضادة إضافية ، مثل Ki-67 ، لتقييم تكرار الخلية ويمكن استجواب بيانات القياس المورفين النووي الكبدي لمزيد من الاستجواب لتكملة التحليل ploidy. يصف ملف تعريف ploidy على نطاق الأنسجة التي تم إنشاؤها بواسطة هذه الطريقة الحد الأدنى من محتوى الحمض النووي لجميع نوات الكبد الدائرية ، ولكنه لا يميز بين الخلايا أحادية النوى والخلايا الكبدية binuclear. ويمكن أن تكون الطريقة قد تكييفها لحساب المعلمات مثل محيط الخلية، لتسهيل تحديد الخلايا الثنائية وتوفير قراءات إضافية من ploidy الخلوية.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

برغي دليل بسيط أسلوب للدراسات طعم أجنبي داخل الجمجمة في الفئران

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

طريقة بسيطة لتركيب الانبوبة الرئة ماوس

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

التنميط من MicroRNAs الاستروجين التنظيم في خلايا سرطان الثدي

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

الحقن الشريان السباتي لوأضافا الدوائية وتحليل Taxanes في الفئران

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

عالية الإنتاجية توصيف الخلايا الجذعية البالغة المهندسة لتسليم العوامل العلاجية لاستراتيجيات اعصاب

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

افضل طريقة لرابيد تنبيب القصبة الهوائية في الفئران

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Creation of Abdominal Adhesions in Mice

إنشاء البطن التصاقات في الفئران

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A طريقة لقياس أداء الطرف العلوي في الحياة اليومية عن طريق التسارع

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

تقدير عدد النيفرون في الكلي الكامل باستخدام طريقه النقع الحمضي

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...