Name: a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00
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这项工作由西班牙MINECO政府赠款BFU2014-58686-P（LAN）和SAF-2017-84708-R（DJB）资助。LAN得到全国MINECO Ramón和Cajal奖学金RYC-2012-11700和计划GenT奖（瓦伦西亚大学，CDEI-05/20-C）和FMN的支持，由瓦伦西亚将军ACIF/2016/020的区域ValI+D学生。RP要感谢EwaK.Paluch教授的资助。我们感谢艾丽西亚·马丁内斯-罗梅罗博士（CIPF细胞测量服务）对IN细胞分析仪平台的帮助。

所有动物实验以前都得到CIPF道德委员会的批准。老鼠被安置在费利佩中心（西班牙瓦伦西亚）的无病原体设施中，注册为实验动物饲养者、用户和供应中心（注册号。根据现行适用的欧洲和西班牙动物福利条例（RD 53/2013），ES 46 250 0001 002）。
1. 组织收获和样品制备
注：此协议描述了如何在不事先固定或冷冻保存的情况下冻结组织。对于以前固定/冷冻保?...

<ol>
	<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+in+liver+tissue.">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+polyploidy:+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide?.">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?.</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li><li>Wilkinson, P. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploid+Hepatocytes+Facilitate+Adaptation+and+Regeneration+to+Chronic+Liver+Injury.">Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury.</a> The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver.">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li><li>Chao, H. 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Preparative and mathematical protocol.</a> Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).</li><li>Manzano-N&#250;&#241;ez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury.">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214 (2015).</li><li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+of+normal+mouse+liver:+A+histological,+quantitative+immunocytochemical,+and+fine+structural+analysis.">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li><li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells.">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li><li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. 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介绍了一种高含量、高通量的方法，用于分析毛毛肝中肝细胞核细胞核球的组织重塑和估计。熟悉该过程后，用户可以在 3-5 天内处理、成像和分析多个样本，生成大型可测试数据集，从而提供肝脏健康的详细签名。鉴于样品制备方法的简单性，以及分析的大量细胞和组织区域（平均14 mm2/样本），结果非常可靠，具有很高的可重复性。图像捕获和分析的自动化还可以消除这些重要步骤中?...

哺乳动物肝脏中的肝细胞可以经历停滞的细胞因子细胞生成双核细胞，DNA内复制产生多倍体核，含量高达16N的DNA含量。产后发育、衰老和应对各种细胞压力时，细胞和核障碍总体增加1。多倍化过程是动态的和可逆的2，尽管它的精确生物功能仍不清楚。增加的普洛伊与增殖能力降低4、遗传多样性2、适应慢性损伤5和癌症保护6有关。肝细胞性改变发生由于昼夜节律改变7，并律下8。最值得注意的是，肝脏的脂肪轮廓因损伤和疾病9而改变，令人信服的证据表明，特定的蛋白核变化，如增加+8N核或2N肝细胞的丧失，为跟踪非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）进展3，10，10或病毒感染的差分影响11提供了有用的签名。3
一般来说，肝损伤和再生与肝细胞细胞大小和核面积增加有关，同时肝细胞总数减少，特别是那些具有2NDNA含量10，11,11的肝细胞。肝脏中的帕伦奇马尔损伤也经常伴有非泛状细胞（NPCs）的扩增，包括基质肌纤维细胞、炎症细胞和二能肝祖细胞。高通量方法，提供肝细胞数和核球的定量细胞学概况，同时也考虑到NPC的变化，因此具有相当大的潜力，作为研究和临床工具，以跟踪肝脏在损伤和疾病期间的反应。最近对肝细胞癌人体样本中的普西迪光谱进行实地分析也表明，核球在肿瘤内急剧增加，在更具攻击性的肿瘤亚型中特别扩增，减少分化和TP53 13的损耗。因此，在核策略定量评估方面的方法学进步很可能有助于今后对肝癌的预后分析。
本协议介绍了一种灵活的高通量方法，用于对小鼠肝组织部分进行比较分析，它提供了肝细胞数的详细细胞分析、NPC响应和用于估计核高倍的内部校准方法（图1）。肝细胞在核尺寸和核测量表之前，通过肝细胞核因子4α（HNF4+）免疫标签与NPC区别开来。"最小DNA含量"通过将平均Hoechst 33342强度（DNA密度的代理）与插值的三维（3D）核体积集成，估计为所有圆形核掩膜"最低DNA含量"。然后，使用NPC校准肝细胞最小DNA含量，以生成核球状轮廓。
使用高含量成像进行图像采集、核分割和图像分析，使包含数万个细胞的大面积二维（2D）肝部分进行筛选。提供一个定制程序，用于自动处理高含量图像分析数据，以生成所有圆形肝细胞核的样本范围的ploidy轮廓。这是使用免费下载软件，计算基于立体图像分析（SIA）10，11，14，15的核策略。10,11,14,15SIA方法以前曾被流细胞测定证实为一种准确（尽管费力）的方法，用于估计肝脏14中的肝细胞核糖核，假设循环核形态和核大小与DNA含量之间的单调关系。在本议定书中，这两个核参数都是通过核测量和Hoechst 33342标签的评估来衡量的。计算每个核掩膜的"最小DNA含量"后，使用NPC校准肝细胞核糖核糖，这些NPC具有已知的2-4NDNA含量，因此作为有用的内部控制。
与传统的流细胞测量方法16相比，所述方法使肝细胞核球菌能够就地评估，并且不需要获得新的组织或分解方法，这些方法可能会偏袒结果，难以标准化。与所有基于 SIA 的方法一样，由于赤道平面外较大核的切片，2D 采样对核策略子类 >2N 的代表性不足。全组织蛋白体剖面还描述了所有圆形肝细胞核掩码的最低DNA含量，并且不直接区分单核肝细胞和具有同一双核核核的两个离散（"不接触"）核。然而，这项议定书的简单性使得可以相当的余地加以调整，以考虑到核间隔或细胞周界分析等其他参数，这将有助于识别双核细胞，从而更详细地评估细胞结构。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)</td>
			<td>TestDiet</td>
			<td>1810704</td>
			<td>Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM1850 UV</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>CM1850 UV</td>
			<td>Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statistical software for graphing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IN Cell Analyzer 1000</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td>
			<td></td>
			<td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>630-2864</td>
			<td>Size of 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Speadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Tissue Tek</td>
			<td>Pascual y Furi&#243;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>141451.121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen for immunostaining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>5mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine Microscope Slides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-79380</td>
			<td>Dilution 1:250 (alternative)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6556</td>
			<td>Dilution 1:200 (antibody used in the study)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice

当肝脏受伤时，肝细胞数量减少，而细胞大小、核大小和脂肪增加。非乳腺细胞的膨胀，如胆囊细胞、肌瘤细胞、祖细胞和炎症细胞也表明慢性肝损伤、组织重塑和疾病进展。在此协议中，我们描述了一种简单的高通量方法，用于计算与损伤、慢性疾病和癌症相关的肝脏细胞组成的变化。我们展示了如何利用从二维（2D）组织部分提取的信息来量化和校准样品内的肝细胞核球，并使用户能够在原位定位肝脏内的特定多西子。我们的方法需要获得固定/冷冻肝材料、基本免疫细胞化学试剂和任何标准的高含量成像平台。它是标准流细胞学技术的有力替代品，需要破坏新收集的组织、空间信息丢失和潜在的分解偏差。

该方法已用于测量胆静损伤对成年小鼠肝脏的影响，通过喂养动物0-21天与肝毒性饮食含有0.1%3，5-二氧碳基-1，4-二氢胶碱（DDC）17。慢性DDC喂养导致肝细胞损伤增加，NPC的皮球和外皮扩张。用户应注意，在核策略中可能存在小鼠应变和年龄依赖性差异，所有分析均使用12-16周的成年雌性C57BL/6小鼠进行。
在HNF4+?...

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A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

我们提出了一种稳健、经济、灵活的方法，用于测量固定/冷冻组织样本中肝细胞数和核球菌的变化，而不需要流动细胞测量。我们的方法提供了肝细胞学的强大样本范围特征，非常适合跟踪肝损伤和疾病的进展。

小鼠肝细胞核球状估计的高通量原位方法

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

此方法使用户能够从 2D 组织部分生成肝细胞核 DNA 含量的配置文件，用于肝脏发育、再生和慢性疾病的研究。这种自动化的高通量方法可应用于所有 2D 肝组织部分，为所有简单的圆形肝细胞核提供内部校准的核倍数读出。肝细胞核倍体的变化与衰老、慢性肝病和癌症有关。该技术提供了一种简单的方法，在固定或低温保存的肝脏标本中分析核倍体。原位倍体分析方法作为跟踪肝病进展的研究和临床工具具有相当大的潜力，因为它们不需要组织去隔离或获得新鲜材料。收获穆林肝组织样品后，将肝叶嵌入最佳切削温度介质中填充低温，并立即将霉菌放在干冰上，确保快速冷冻。要获得冷冻肝叶样品的切片，请将样品切成六微米厚，在每个样品上放置一个标有聚酰胺涂层的幻灯片，在每个样品上放置五秒钟，让每个样品粘在幻灯片上。收集所有切片后，让样品在室温下平衡三到五分钟，然后进行免疫标记。在平衡结束时，将组织部分固定到烟罩中，在PBS中用1毫升4%的半成醛在室温下固定10分钟。在固定结束时，用三分钟在PBS中清洗的幻灯片，轻轻搅拌。上次洗涤后，干燥每个组织部分周围的区域，并使用疏水笔在每个样品周围画一个圆圈。要渗透样品，在室温下用0.5%非离子表面活性剂在PBS中处理15分钟。在孵育结束时，在PBS中用温和的搅拌两次洗涤样品三分钟，如所证明的，在室温下用1%牛血清白蛋白、5%马血清和0.2%非离子表面活性剂的过滤溶液阻断非特异性结合，至少一小时。接下来，在潮湿染色室中，用HHF4-alpha抗体在四摄氏度的阻消缓冲液中孵育幻灯片，防止光线。第二天早上，用适当的荧光结合二次抗体在PBS中轻轻搅拌，用过滤后的1%牛血清白蛋白和0.2%的PBS中非离子表面活性剂中稀释，在室温下在不受光线影响下，洗涤两小时。在孵化结束时，按照演示，将滑梯洗四次，然后用轻柔的搅拌在双蒸馏水中洗两次三分钟。上次洗涤后，将样品与两滴荧光安装介质安装在盖玻片上，并必要时施加温和压力以消除任何气泡。然后，使用传统的荧光显微镜检查幻灯片，以确保良好的固定和免疫标记。对于荧光图像采集，在高含量成像平台上设置参数，使用适当的荧光信号采集荧光图像。然后扫描样本以获得足够的图像，以获得组织部分的完整覆盖。在扫描结束时，调整软件的核分段参数，以确保核以最佳方式分离并修改阈值强度，以确保 HNF4-alpha 阳性肝细胞和 HNF4-α 阴性非细胞的最佳浇注。在核量化方面，根据霍赫斯特染色、主要核霍赫斯特强度、核伸长系数、平均核圆度指数、HNF4-alpha状态和基于重心的核X、Y坐标，以平方千分尺设置核区域。要进行肝细胞核倍体分析，首先下载并安装倍体定量分析程序。在 MATLAB 中，导航到工具栏的应用选项卡，然后单击"安装应用"。打开 Ploidy 应用程序 ML 应用程序安装程序。将显示一条消息以确认安装成功。在每个数据分析文件中，包括一个称为"细胞度量"的工作表，其中包含列中所示的 ploidy 分析所需的所有数据。对于每个实验条件，提供一个控制数据集，用于计算 2 到 4 N 核倍数校准的内部控制。对于生物复制，将每个电子表格存储在其自己的文件夹中，以增量方式命名文件夹前缀。接下来，启动 Ploidy 应用程序。将出现 Ploidy 应用程序图形用户界面。单击"控制数据路径"按钮可导航到控件数据复制所在的文件夹。然后，此数据路径将显示在接口中。在"文件夹前缀"中，键入要为输出文件提供的名称。单击"其他数据的路径"按钮并导航到比较数据复制所在的文件夹。然后，此数据路径将显示在接口中。然后单击"运行"。分析完成后，状态栏将读取"分析完成"。免疫标记后，通过常规荧光显微镜检查所有幻灯片，以确认已获得良好的质量固定和染色。Hoechst 染料的涂抹或模糊可能表明固定前固定不足或样品降解。在进行自动图像分析之前，应仔细优化核分离和HNF4-alpha阈值参数，以广泛反映荧光显微镜观察到的免疫保持的视觉模式。在图像分析之后，数据应反映非同质细胞数量的增加，以及肝中具有DDC损伤的HNF4-alpha阳性核数的少量但显著减少。在健康控制肝脏中，大约63%的HNF4-alpha阳性核表现出简单的圆形形态测定。对控制组和DDC治疗组的相对核倍体进行比较，应反映2C和4C肝细胞核的显著损失以及损伤以及大于8C细胞数量的增加。通过检索高含量图像分析软件中特定肝细胞子集的二维位置，可以询问每个倍体子组的相对位置信息。可进行具有其他抗体（如 Ki-67）的免疫标记，以评估细胞复制，还可以进一步询问肝细胞核形态测定数据，以补充倍体分析。此方法生成的组织范围倍体特征描述了所有圆形肝细胞核的最小 DNA 含量，但不区分单核细胞和双核肝细胞。该方法有可能被调整为考虑细胞周长等参数，以方便双核细胞的识别，并提供细胞倍数的额外读出。

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High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

对专为递送治疗因素的神经保护策略成人干细胞高通量表征

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

在小鼠气管插管快速的改进方法

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Creation of Abdominal Adhesions in Mice

小鼠腹腔粘连的创建

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

一种使用加速度计量化上肢表现在日常生活的方法

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

酸化浸渍法评价全肾肾素数

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...