Name: a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af den spanske MINECO regering tilskud BFU2014-58686-P (LAN) og SAF-2017-84708-R (DJB). LAN blev støttet af en national MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 og Plan GenT-pris (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) og FMN af et regionalt ValI+D studenterkontor ved Valencias Generalitat ACIF/2016/020. RP vil gerne anerkende prof. Ewa K. Paluch for finansiering. Vi takker Dr. Alicia Martínez-Romero (CIPF Cytometri service) for hjælp med IN Cell Analyzer platform.

Alle dyreforsøg blev tidligere godkendt af CIPF's etiske komité. Mus blev anbragt i et patogenfrit anlæg på Centro de Investigación Príncipe Felipe (Valencia, Spanien), registreret som forsøgsdyrsopdrætter, bruger og forsyningscenter (reg. nr. ES 46 250 0001 002) i henhold til gældende europæiske og spanske dyrevelfærdsbestemmelser (53.2013 rd/2013).
1. Vævshøst og forberedelse af prøver
BEMÆRK: Denne protokol beskriver, hvordan man fryser væv uden for...

<ol>
	<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+in+liver+tissue.">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+polyploidy:+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide?.">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?.</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Restricts+Hepatocyte+Proliferation+and+Liver+Regeneration+in+Mice.">The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice.</a> Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploid+Hepatocytes+Facilitate+Adaptation+and+Regeneration+to+Chronic+Liver+Injury.">Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury.</a> The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver.">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li><li>Chao, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clock+regulates+hepatic+polyploidy+by+modulating+Mkp1-Erk1/2+signaling+pathway.">Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway.</a> Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).</li><li>Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin/Akt+pathway+controls+a+specific+cell+division+program+that+leads+to+generation+of+binucleated+tetraploid+liver+cells+in+rodents.">The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).</li><li>Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+polyploidization+and+its+association+with+pathophysiological+processes.">Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (5), e2805 (2017).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Toyoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+to+hepatocyte+ploidy+and+binuclearity+profiles+during+human+chronic+viral+hepatitis.">Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis.</a> Gut. 54 (2), 297-302 (2005).</li><li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+and+Unconventional+Cell+Division+of+Hepatocytes+Underlie+Liver+Regeneration.">Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration.</a> Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. , (2019).</li><li>Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+determining+ploidy+distributions+in+liver+tissue+by+stereological+analysis+of+nuclear+size+calibrated+by+flow+cytometric+DNA+analysis.">A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis.</a> Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).</li><li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Cell+Polyploidization:+A+Pivotal+Role+for+Binuclear+Hepatocytes.">Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li><li>Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+mouse+hepatocyte+ploidy+-+I.+Preparative+and+mathematical+protocol.">Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol.</a> Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).</li><li>Manzano-N&#250;&#241;ez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury.">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214 (2015).</li><li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+of+normal+mouse+liver:+A+histological,+quantitative+immunocytochemical,+and+fine+structural+analysis.">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li><li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells.">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li><li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hepatocyte+ploidy+levels+with+body+size+and+growth+rate+in+mammals.">Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals.</a> Genome. 44 (3), 350-360 (2001).</li><li>Tanami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+zonation+of+liver+polyploidy.">Dynamic zonation of liver polyploidy.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).</li><li>Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+and+liver+proliferation.">Polyploidy and liver proliferation.</a> Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).</li><li>Uhl&#233;n, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-based+map+of+the+human+proteome.">Tissue-based map of the human proteome.</a> Science. 347 (6220), 1260419 (2015).</li></ol>

En tilgang med højt indhold og høj gennemløb til analyse af vævsremodellering og estimering af hepatocytnukleart ploidi i murineleveren er beskrevet. Når en bruger er fortrolig med proceduren, kan han behandle, afhøre og analysere flere prøver inden for en periode på 3-5 dage og generere store testbare datasæt, der giver en detaljeret underskrift af leverens tilstand. I betragtning af enkeltheden i prøvepræparatmetoden er resultaterne sammen med det store antal celler og vævsområdet analyseret (i gennemsnit ...

Hepatocytter i pattedyrleveren kan gennemgå blokeret cytokinese til fremstilling af binukleare celler og DNA-endoreplication til fremstilling af polyploidkerner, der indeholder op til 16N DNA-indhold. Samlet cellulære og nukleare trick stigning under postnatal udvikling, aldring og som reaktion på forskellige cellulære belastninger1. Polyploidiseringsprocessen er dynamisk og reversibel2, selv om dens præcise biologiske funktion fortsat er uklar3. Øget ploidy er forbundet med nedsat spredningskapacitet4, genetisk mangfoldighed2, tilpasning til kronisk skade5 og kræftbeskyttelse6. Hepatocyte ploidy ændringer opstår som følge af ændret døgnrytme7, og fravænning8. Mest bemærkelsesværdigt, den ploidy profil af leveren er ændret ved skade og sygdom9, og overbevisende beviser tyder på, at specifikke kneb ændringer, såsom øget ≥8N kerner eller tab af 2N hepatocytter, give nyttige underskrifter til sporing af ikke-alkoholiske fedtlever sygdom (NAFLD) progression3,10, eller den differentierede virkning af virusinfektioner11.
Generelt er leverskader og regenerering forbundet med øget hepatocytcellestørrelse og nukleart område12, sammen med et reduceret samlet antal hepatocytter, især dem med 2N-DNA-indhold10,11. Parenkymal skade i leveren er også ofte ledsaget af udvidelse af ikke-parenkymale celler (NPC'ere), herunder stromale myofibroblaster, inflammatoriske celler og bipotente leverstamceller. Metoder med høj overførselsmængde, der giver en kvantitativ cytologisk profil af parenkymale celletal og nukleart kneb, samtidig med at der er taget højde for ændringer i NPC'er, har derfor et betydeligt potentiale som forskning og kliniske værktøjer til at spore leverens respons under skade og sygdom. Overbevisende seneste in situ analyse af ploidy spektre i humane prøver af hepatocellulært karcinom viser også, at nukleart trick er dramatisk øget inden for tumorer og er specifikt forstærket i mere aggressive tumor undertyper med reduceret differentiering og tab af TP5313. Derfor er der en stærk mulighed for, at metodiske fremskridt i kvantitativ vurdering af nukleart arbejde vil hjælpe med fremtidige prognostiske profilering af leverkræft.
I denne protokol beskrives en fleksibel metode med høj gennemløb til sammenlignende analyse af sektioner af muselevervæv, som giver detaljeret cytometrisk profilering af hepatocytnumre, NPC-respons og en internt kalibreret metode til vurdering af nukleart ploidy (figur 1). Hepatocytter adskiller sig fra NPC'ere ved hepatocyt nuklear faktor 4 alpha (HNF4α) immunmærkning, før karakterisering af nuklear størrelse og nuklear morfometri. "Minimalt DNA-indhold" estimeres for alle cirkulære nukleare masker ved at integrere middelværdien Hoechst 33342 intensitet (en proxy for DNA-tæthed) med interpoleret tredimensionel (3D) nuklear volumen. Hepatocyt minimal DNA-indhold kalibreres derefter ved hjælp af NPC'ere til at generere en nuklear ploidy profil.
Billederhvervelse, nuklear segmentering og billedanalyse udføres ved hjælp af billedbehandling med højt indhold, hvilket gør det muligt at screene store områder med todimensionale (2D) leversektioner, der indeholder titusindvis af celler. En skræddersyet program er fastsat for automatiseret efterbehandling af højt indhold billedanalyse data til at producere en prøve-dækkende ploidy profil for alle cirkulære hepatocyt kerner. Dette udføres ved hjælp af gratis at downloade software til at beregne nukleare kneb baseret på stereologisk billedanalyse (SIA)10,11,14,15. SIA-metoden er tidligere blevet valideret af flowcytometri som en nøjagtig, om end besværlig, metode til vurdering af hepatocyt nukleart trick i leveren14, under forudsætning af cirkulær nuklear morfologi og en monoton sammenhæng mellem nuklear størrelse og DNA-indhold. I denne protokol måles begge nukleare parametre ved vurdering af nuklear morfometri og Hoechst 33342-mærkning. Beregning af "minimalt DNA-indhold" for hver atommaske efterfølges af kalibrering af hepatocytnukleart ploidy ved hjælp af NPC'ere, som har et kendt 2−4N DNA-indhold og derfor tjener som en nyttig intern kontrol.
Sammenlignet med konventionelle flow cytometri metoder16 den beskrevne fremgangsmåde gør det muligt hepatocyt nukleare ploidy, der skal vurderes in situ og kræver ikke adgang til frisk væv eller disaggregation metoder, der kan bias resultater og være vanskeligt at standardisere. Som med alle SIA-baserede tilgange er kerneploidi-underklasserne >2N underrepræsenteret ved 2D-prøvetagning på grund af skæring af større kerner uden for ækvatorialplanet. Den vævsdækkende ploidy-profil beskriver også minimums-DNA-indholdet for alle cirkulære hepatocytnukleare masker og diskriminerer ikke direkte mellem mononukleare hepatocytter og binukleare celler, der har to diskrete ("ikke-rørende") kerner af samme ploidi. Denne protokols enkelhed giver imidlertid mulighed for at tilpasse den til yderligere parametre såsom internuklear afstand eller celleperimeteranalyse, som vil gøre det lettere at identificere tonukleare celler, hvilket giver en mere detaljeret vurdering af celleploidi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)</td>
			<td>TestDiet</td>
			<td>1810704</td>
			<td>Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM1850 UV</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>CM1850 UV</td>
			<td>Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statistical software for graphing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IN Cell Analyzer 1000</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td>
			<td></td>
			<td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>630-2864</td>
			<td>Size of 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Speadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Tissue Tek</td>
			<td>Pascual y Furi&#243;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>141451.121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen for immunostaining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>5mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine Microscope Slides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-79380</td>
			<td>Dilution 1:250 (alternative)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6556</td>
			<td>Dilution 1:200 (antibody used in the study)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice

Når leveren er skadet, hepatocyt numre falde, mens cellestørrelse, nuklear størrelse og ploidy stigning. Udvidelsen af ikke-parenkymale celler såsom cholangiocytter, myofibroblaster, sformidler og inflammatoriske celler indikerer også kroniske leverskader, vævsremodellering og sygdomsprogression. I denne protokol, Vi beskriver en simpel høj-throughput tilgang til beregning af ændringer i den cellulære sammensætning af leveren, der er forbundet med skade, kronisk sygdom og kræft. Vi viser, hvordan oplysninger udvundet fra to-dimensionelle (2D) væv sektioner kan bruges til at kvantificere og kalibrere hepatocyt nukleare ploidy i en prøve og gøre det muligt for brugeren at finde specifikke ploidy delmængder i leveren in situ. Vores metode kræver adgang til fast / frosset levermateriale, grundlæggende immuncytokemi reagenser og enhver standard højt indhold imaging platform. Det fungerer som et effektivt alternativ til standard flow cytometri teknikker, som kræver afbrydelse af frisk indsamlet væv, tab af rumlig information og potentielle disaggregering bias.

Denne metode er blevet anvendt til at måle virkningen af kolestatisk skade på den voksne muselever ved at fodre dyr i 0−21 dage med en hepatoksisk kost indeholdende 0,1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidin (DDC)17. Kronisk DDC fodring resulterer i hepatocellulære skade øget ploidy og periportal udvidelse af NPC'ere. Brugeren skal være opmærksom på, at der kan være musestamme og aldersafhængige forskelle i nukleart arbejde, og at alle analyser er udf...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

Vi præsenterer en robust, omkostningseffektiv og fleksibel metode til måling af ændringer i hepatocytnummer og nukleart trick i faste/kryoreserverede vævsprøver, der ikke kræver flowcytometri. Vores tilgang giver en kraftfuld prøve-dækkende underskrift af levercytologi ideel til sporing af udviklingen af leverskader og sygdom.

En høj-throughput In Situ metode til vurdering af Hepatocyt Nuklearploidy i mus

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Denne metode gør det muligt for brugeren at generere en profil af hepatocyte nukleare DNA-indhold fra 2D væv sektioner til undersøgelse af leveren udvikling, regenerering, og kronisk sygdom. Denne automatiserede høj gennemløb tilgang kan anvendes på alle 2D levervæv sektioner, hvilket giver en internt kalibreret udlæsning af nukleare ploidy for alle enkle cirkulære hepatocyte kerner. Ændringer i hepatocyte nukleare ploidy er forbundet med aldring, kronisk leversygdom, og kræft.Denne teknik giver et simpelt middel til at profilere nukleare ploidy i faste eller kryobevarede leverprøver. In situ ploidy profilering metoder har et betydeligt potentiale som forskning og kliniske værktøjer til sporing af leversygdom progression, da de ikke kræver væv desegregering eller adgang til nyt materiale. Efter høst af murine levervæv prøve, integrere leveren lobule i en optimal skæring temperatur medium fyldt kryolom og straks placere formen på tøris for at sikre hurtig frysning.For at opnå skiver af den frosne lever lobule prøve, afsnit prøven på en seks mikrometer tykkelse, placere en mærket polyamid belagt dias over hver prøve i fem sekunder for at lade hver prøve holde sig til diaset. Når alle skiverne er indsamlet, skal prøverne kunne yrtre i tre til fem minutter ved stuetemperatur før immunmærkning. Ved afslutningen af ækvilibreringen fastgør vævsafsnittene i en røghætte med en milliliter 4%paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.Ved slutningen af fikseringen skylles objektglassene med tre tre minutters vask i PBS med let omrøring. Efter den sidste vask tørres området omkring hver vævssektion, og der anvendes en hydrofob pen til at tegne en cirkel rundt om hver prøve. For at gennemtrænge prøverne behandles sektionerne med et 0,5% ikke-ionisk overfladeaktivt stof i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur.Ved inkubationens afslutning vaskes prøverne i tre minutter i PBS to gange med forsigtig omrøring som påvist, før den ikke-specifikke binding blokeres med en filtreret opløsning på 1 % kvægserumalbumen, 5 % hesteserum og 0,2 % ikke-ionisk overfladeaktivt stof i PBS i mindst en time ved stuetemperatur. Dernæst inkubere dias med HHF4-alpha antistof fortyndet i blokering buffer natten over ved fire grader Celsius i et fugtigt farvning kammer beskyttet mod lys. Næste morgen vaskes objektglassene fire gange i PBS med blid omrøring før inkubation med et passende fluorescenskonjugeret sekundært antistof og Hoechst fortyndet i filtreret 1% kvæg serumalbumen og 0,2 % ikke-ionisk overfladeaktivt stof i PBS i to timer ved stuetemperatur i et fugtigt farvningskammer, der er beskyttet mod lys.Ved inkubationens afslutning vaskes objektglassene fire gange, således som det er påvist, efterfulgt af to tre minutters vask i dobbelt destilleret vand med let omrøring. Efter den sidste vask monteres prøverne med to dråber fluorescensmonteringsmedium på en dækslet og tryk forsigtigt på efter behov for at fjerne eventuelle bobler. Kontroller derefter rutsjebanerne ved hjælp af et konventionelt fluorescensmikroskop for at sikre god fiksering og immunmærkning.For fluorescens billede erhvervelse, indstille parametrene på et højt indhold billeddannelse platform til at erhverve fluorescens billeder ved hjælp af passende excitation for fluorophores anvendes. Scan derefter prøver for at få tilstrækkelige billeder til at opnå fuldstændig dækning af vævssektionen. Ved scanningens afslutning justeres softwarens nukleare segmenteringsparametre for at sikre, at kernerne er optimalt adskilt, og tærskelintensiteten ændres for at sikre optimal gating af HNF4-alfa-positive hepatocytter og HNF4-alpha negative ikke-parenkymale celler.For nuklear kvantificering, indstille det nukleare område i firkantede mikrometer baseret på Hoechst farvning, de vigtigste nukleare Hoechst intensitet, den nukleare forlængelse faktor, den gennemsnitlige nukleare rundhed indeks, HNF4-alpha status, og den nukleare X, Y koordinerer baseret på tyngdepunktet. For at udføre en hepatocyte nukleare ploidy analyse, først downloade og installere ploidy kvantificering analyseprogram. I MATLAB skal du navigere til fanen App på værktøjsstrimlen og klikke på Installer app.Åbn programmet Ploidy Application ML App Install. Der vises en meddelelse, der bekræfter den vellykkede installation. I hver dataanalysefil skal du medtage et ark med betegnelsen Celleforanstaltninger, der indeholder alle de data, der er nødvendige for den ploidyanalyse, der er angivet i kolonner som angivet.For hver forsøgstilstand skal der tilvejebringes et kontroldatasæt, der skal anvendes til at beregne den interne kontrol for to til fire N-kalibrering af nukleart ploidy. I forbindelse med biologiske replikere skal du gemme hvert regneark i sin egen mappe og navngive mappepræfikserne trinvist. Dernæst lancere Ploidy ansøgning.Den grafiske brugergrænseflade i det grafiske brug af Det Ploidy-program vises. Klik på knappen Sti til Kontrol af data for at navigere til den mappe, som datarelikterne til kontrolelementet findes i. Denne datasti vises derefter i grænsefladen.Skriv det navn, der skal gives til outputfilerne, i mappepræfikset. Klik på knappen Sti til andre data, og naviger til den mappe, hvor de komparative datarelikker findes. Denne datasti vises derefter i grænsefladen.Klik derefter på Kør. Når analysen er fuldført, læses Analyse færdig. Efter immunmærkning er det vigtigt at kontrollere alle objektglassene ved konventionel fluorescensmikroskopi for at bekræfte, at der er opnået en fiksering og farvning af god kvalitet.Udtværing eller sløring af Farvestoffet Hoechst kan indikere utilstrækkelig fiksering eller prøvenedbrydning før fiksering. Nuklear adskillelse og HNF4-alpha tærskelparametre bør optimeres omhyggeligt før automatisk billedanalyse for bredt at afspejle det visuelle mønster af immunstaining observeret ved fluorescensmikroskopi. Efter billedanalyse bør dataene afspejle det stigende antal ikke-parenkymale celler og de små, men signifikante, reduktion i HNF4-alpha positive kernetal i leveren med DDC-skade.I sunde kontrollever udviser ca. 63% af HNF4-alfa positive kerner en simpel cirkulær morfometry. En sammenligning af den relative nukleare ploidy mellem kontrolgrupper og DDC-behandlede grupper bør afspejle et betydeligt tab på 2C og 4C hepatocytkerner med skade sammen med et øget antal celler på over 8 C. De relative positionsoplysninger for hver ploidy undergruppe kan afhøres ved at hente 2D-placeringen af bestemte hepatocyt-delmængder i analysesoftwaren med højt indhold.Immunmærkning med yderligere antistoffer, såsom Ki-67, kan udføres for at vurdere cellereplikering og hepatocyt nukleare morfometry data kan yderligere afhøres for at komplimentere ploidy analyse. Den vævsdækkende ploidyprofil, der genereres ved denne metode, beskriver minimums-DNA-indholdet for alle cirkulære hepatocytekerner, men diskriminerer ikke mellem mononukleare celler og binuclear hepatocytter. Metoden kan potentielt tilpasses for at tage højde for parametre som celleomkreds, for at lette identifikationen af binuclear celler og give en ekstra udlæsning af cellulære ploidy.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

En simpel metode til Mouse Lung Intubation

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering af østrogen-regulerede MicroRNA i brystkræftceller

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halspulsåren infusioner farmakokinetisk og farmakodynamisk analyse af Taxaner i mus

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Højt gennemløb Karakterisering af voksne stamceller udviklet til levering af terapeutiske faktorer for Neurobeskyttende Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

En forbedret fremgangsmåde til hurtig intubation af trachea i mus

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Creation of Abdominal Adhesions in Mice

Oprettelse af Abdominal adhæsioner i mus

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

En metode til kvantificering Upper Limb Performance i min hverdag anvender accelerometre

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Estimering af Neron nummer i hele nyrerne ved hjælp af Acid maceration metode

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...