Name: a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de Spaanse MINECO-regering subsidies BFU2014-58686-P (LAN) en SAF-2017-84708-R (DJB). LAN werd ondersteund door een nationale MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 en Plan GenT award (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) en FMN door een regionaal ValI+D studentenschip van de Valenciaanse Generalitat ACIF/2016/020. RP wil prof. Ewa K. Paluch erkennen voor financiering. We danken Dr. Alicia Martínez-Romero (CIPF Cytometry service) voor hulp met het IN Cell Analyzer platform.

Alle dierproeven werden eerder goedgekeurd door de ethische commissie van cipf. Muizen werden gehuisvest in een ziektevrije faciliteit in het Centro de Investigación Príncipe Felipe (Valencia, Spanje), geregistreerd als proefdierfokker, gebruiker en bevoorradingscentrum (reg. nr. ES 46 250 0001 002) in het kader van de geldende Europese en Spaanse dierenwelzijnsvoorschriften (RD 53/2013).
1. Weefseloogst en monsterbereiding
OPMERKING: Dit protocol beschrijft hoe wee...

<ol>
	<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+in+liver+tissue.">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+polyploidy:+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide?.">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?.</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Restricts+Hepatocyte+Proliferation+and+Liver+Regeneration+in+Mice.">The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice.</a> Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploid+Hepatocytes+Facilitate+Adaptation+and+Regeneration+to+Chronic+Liver+Injury.">Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury.</a> The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver.">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li><li>Chao, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clock+regulates+hepatic+polyploidy+by+modulating+Mkp1-Erk1/2+signaling+pathway.">Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway.</a> Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).</li><li>Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin/Akt+pathway+controls+a+specific+cell+division+program+that+leads+to+generation+of+binucleated+tetraploid+liver+cells+in+rodents.">The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).</li><li>Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+polyploidization+and+its+association+with+pathophysiological+processes.">Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (5), e2805 (2017).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Toyoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+to+hepatocyte+ploidy+and+binuclearity+profiles+during+human+chronic+viral+hepatitis.">Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis.</a> Gut. 54 (2), 297-302 (2005).</li><li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+and+Unconventional+Cell+Division+of+Hepatocytes+Underlie+Liver+Regeneration.">Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration.</a> Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. , (2019).</li><li>Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+determining+ploidy+distributions+in+liver+tissue+by+stereological+analysis+of+nuclear+size+calibrated+by+flow+cytometric+DNA+analysis.">A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis.</a> Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).</li><li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Cell+Polyploidization:+A+Pivotal+Role+for+Binuclear+Hepatocytes.">Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li><li>Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+mouse+hepatocyte+ploidy+-+I.+Preparative+and+mathematical+protocol.">Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol.</a> Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).</li><li>Manzano-N&#250;&#241;ez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury.">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214 (2015).</li><li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+of+normal+mouse+liver:+A+histological,+quantitative+immunocytochemical,+and+fine+structural+analysis.">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li><li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells.">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li><li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hepatocyte+ploidy+levels+with+body+size+and+growth+rate+in+mammals.">Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals.</a> Genome. 44 (3), 350-360 (2001).</li><li>Tanami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+zonation+of+liver+polyploidy.">Dynamic zonation of liver polyploidy.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).</li><li>Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+and+liver+proliferation.">Polyploidy and liver proliferation.</a> Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).</li><li>Uhl&#233;n, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-based+map+of+the+human+proteome.">Tissue-based map of the human proteome.</a> Science. 347 (6220), 1260419 (2015).</li></ol>

Een high-content, high-throughput benadering voor de analyse van weefsel remodelleren en schatting van hepatocyte nucleaire ploidy in de murine lever wordt beschreven. Eenmaal bekend met de procedure, kan een gebruiker meerdere monsters verwerken, bekijken en analyseren in een periode van 3−5 dagen, waardoor grote testbare gegevenssets worden genereren die een gedetailleerde handtekening van de levergezondheid bieden. Gezien de eenvoud van de monsterbereidingsmethode, samen met de grote aantallen cellen en weefselgebie...

Hepatocyten in de zoogdierlever kunnen vastgelopen cytokinese ondergaan om binucleaire cellen te produceren, en DNA-endoreplicatie om polyploïde kernen te produceren die maximaal 16N DNA-inhoud bevatten. Totale cellulaire en nucleaire ploidy toename tijdens postnatale ontwikkeling, veroudering en in reactie op diverse cellulaire spanningen1. Het proces van polyploidisatie is dynamisch en omkeerbaar2, hoewel de precieze biologische functie onduidelijk blijft3. Verhoogde ploidy wordt geassocieerd met verminderde proliferative capaciteit4,genetische diversiteit2,aanpassing aan chronische schade5 en bescherming tegen kanker6. Hepatocyte ploidy veranderingen optreden als gevolg van veranderde circadiane ritme7, en spenen8. Het meest in het bijzonder wordt het ploidy-profiel van de lever gewijzigd door letsel en ziekte9, en overtuigend bewijs suggereert dat specifieke ploidieveranderingen, zoals verhoogde ≥8N-kernen of verlies van 2N hepatocyten, nuttige handtekeningen bieden voor het bijhouden van niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) progressie3,10, of het differentiële effect van virale infecties11.
In het algemeen worden leverletsel en regeneratie geassocieerd met verhoogde hepatocytecelgrootte en nucleair gebied12, samen met een verminderd totaal aantal hepatocyten, met name die met 2N DNA-gehalte10,11. Parenchymale letsel in de lever gaat ook vaak gepaard met uitbreiding van niet-parenchymale cellen (NPC's), waaronder stromal myofibroblasten, ontstekingscellen en bipotente leververerstoffen. Methoden met een hoge doorvoer die een kwantitatief cytologisch profiel van parenchymale celnummer en nucleaire ploidie bieden, terwijl ze ook rekening houden met veranderingen in NPC's, hebben daarom een aanzienlijk potentieel als onderzoek en klinische instrumenten om de respons van de lever tijdens letsel en ziekte te volgen. Overtuigende recente in situ analyse van ploidy spectra in menselijke monsters van hepatocellulair carcinoma tonen ook aan dat nucleaire ploidie is dramatisch verhoogd binnen tumoren en is specifiek versterkt in meer agressieve tumor subtypes met verminderde differentiatie en verlies van TP5313. Daarom is er een grote kans dat methodologische vooruitgang in de kwantitatieve beoordeling van nucleaire ploidy zal helpen bij de toekomst prognostische profilering van leverkanker.
In dit protocol wordt een flexibele high-throughput methodologie beschreven voor de vergelijkende analyse van muisleverweefselsecties, die gedetailleerde cytometrische profilering van hepatocytengetallen, de NPC-respons en een intern gekalibreerde methode voor het schatten van nucleaire ploidie (figuur 1) biedt. Hepatocyten onderscheiden zich van NPC's door hepatocyte nucleaire factor 4 alpha (HNF4α) immunolabelling, voorafgaand aan de karakterisering van nucleaire grootte en nucleaire morfometrie. "Minimaal DNA-gehalte" wordt geschat voor alle circulaire nucleaire maskers door de integratie van gemiddelde Hoechst 33342 intensiteit (een proxy voor DNA-dichtheid) met geïnterpoleerd driedimensionaal (3D) nucleair volume. Hepatocyte minimale DNA-inhoud wordt vervolgens gekalibreerd met behulp van NPC's om een nucleaire ploidy profiel te genereren.
Beeldverwerving, nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden uitgevoerd met behulp van high-content imaging, waardoor grote gebieden van tweedimensionale (2D) leversecties met tienduizenden cellen kunnen worden gescreend. Een op maat geschreven programma is voorzien voor geautomatiseerde nabewerking van high-content beeldanalyse gegevens om een steekproef-breed ploidy profiel voor alle cirkelvormige hepatocyte kernen te produceren. Dit wordt uitgevoerd met behulp van gratis om software te downloaden om nucleaire ploidy te berekenen op basis van stereologische beeldanalyse (SIA)10,11,14,15. De SIA-methodologie is eerder gevalideerd door flow cytometrie als een nauwkeurige, zij het moeizame, methode voor het schatten van hepatocyte nucleaire ploidy in de lever14, uitgaande van circulaire nucleaire morfologie en een monotoon relatie tussen nucleaire grootte en DNA-inhoud. In dit protocol worden beide nucleaire parameters gemeten door beoordeling van nucleaire morfometrie en Hoechst 33342-etikettering. De berekening van het "minimale DNA-gehalte" voor elk kernmasker wordt gevolgd door kalibratie van hepatocyte nucleaire ploidy met NPC's, die een bekend 2-4N DNA-gehalte hebben en daarom dienen als een nuttige interne controle.
In vergelijking met conventionele stroomcytometrie methoden16 de beschreven aanpak maakt hepatocyte nucleaire ploidy te worden beoordeeld in situ en vereist geen toegang tot vers weefsel of disaggregatie methoden die kunnen bias resultaten en moeilijk te standaardiseren. Zoals met alle sia-gebaseerde benaderingen, nucleaire ploidy subklassen >2N zijn ondervertegenwoordigd door 2D-bemonstering als gevolg van de doorsnede van grotere kernen buiten het equatoriale vlak. Het weefselbrede ploidy-profiel beschrijft ook het minimale DNA-gehalte voor alle cirkelvormige hepatocytenucleaire maskers, en maakt geen direct onderscheid tussen mononucleaire hepatocyten en binucleaire cellen die twee discrete ("niet-aanrakende" kernen van dezelfde ploidie hebben. De eenvoud van dit protocol biedt echter aanzienlijke mogelijkheden om het aan te passen aan aanvullende parameters, zoals internucleaire afstand of celperimeteranalyse, die de identificatie van binucleaire cellen zouden vergemakkelijken, waardoor een meer gedetailleerde beoordeling van cellulaire ploidie mogelijk is.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)</td>
			<td>TestDiet</td>
			<td>1810704</td>
			<td>Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM1850 UV</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>CM1850 UV</td>
			<td>Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statistical software for graphing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IN Cell Analyzer 1000</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td>
			<td></td>
			<td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>630-2864</td>
			<td>Size of 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Speadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Tissue Tek</td>
			<td>Pascual y Furi&#243;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>141451.121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen for immunostaining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>5mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine Microscope Slides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-79380</td>
			<td>Dilution 1:250 (alternative)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6556</td>
			<td>Dilution 1:200 (antibody used in the study)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice

Wanneer de lever gewond is, hepatocyte nummers afnemen, terwijl de cel grootte, nucleaire grootte en ploidy toenemen. De uitbreiding van niet-parenchymale cellen zoals cholangiocyten, myofibroblasten, voorlopers en ontstekingscellen duidt ook op chronische leverschade, weefselremodellering en ziekteprogressie. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige high-throughput benadering voor het berekenen van veranderingen in de cellulaire samenstelling van de lever die worden geassocieerd met letsel, chronische ziekte en kanker. We laten zien hoe informatie uit tweedimensionale (2D) weefselsecties kan worden gebruikt om hepatocyte nucleaire ploidy in een monster te kwantificeren en te kalibreren en de gebruiker in staat te stellen specifieke ploidy-subsets in de lever in situ te lokaliseren. Onze methode vereist toegang tot vast/bevroren levermateriaal, basisimmunocytochemiereagentia en elk standaard high-content imaging platform. Het dient als een krachtig alternatief voor standaard stroomcytometrie technieken, die verstoring van vers verzameld weefsel, verlies van ruimtelijke informatie en potentiële disaggregatie bias vereisen.

Deze methode is gebruikt om het effect van cholestatic letsel op de volwassen muislever te meten door dieren 0−21 dagen te voeren met een hepatototoxisch dieet dat 0,1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC)17bevat. Chronische DDC voeding resulteert in hepatocellulaire letsel toegenomen ploidy en periportal uitbreiding van NPC's. De gebruiker dient zich ervan bewust te zijn dat muisstam en leeftijdsafhankelijke verschillen kunnen bestaan in nucleaire plo...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

We presenteren een robuuste, kosteneffectieve en flexibele methode voor het meten van veranderingen in hepatocyte nummer en nucleaire ploidy binnen vaste / cryopreserved weefsel monsters die geen flow cytometrie vereist. Onze aanpak biedt een krachtige monster-brede handtekening van de lever cytologie ideaal voor het bijhouden van de progressie van leverletsel en ziekte.

Een High-Throughput In Situ Methode voor schatting van Hepatocyte Nucleaire Ploidy in muizen

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Deze methode stelt de gebruiker in staat om een profiel van hepatocyte nucleaire DNA-inhoud te genereren uit 2D-weefselsecties voor de studie van leverontwikkeling, regeneratie en chronische ziekte. Deze geautomatiseerde hoge doorvoerbenadering kan worden toegepast op alle 2D-leverweefselsecties, waardoor een intern gekalibreerde uitlezing van nucleaire trucs voor alle eenvoudige cirkelvormige hepatocyte kernen wordt geboden. Veranderingen in hepatocyte nucleaire ploidy worden geassocieerd met veroudering, chronische leverziekte, en kanker.Deze techniek biedt een eenvoudig middel om nucleaire truc in vaste of cryopreserved leverexemplaren te profileren. In situ ploidy profilering methoden hebben een aanzienlijk potentieel als onderzoek en klinische instrumenten voor het bijhouden van de progressie van leverziekten als ze niet vereisen weefsel desegregatie of toegang tot vers materiaal. Na het oogsten van de murine leverweefsel monster, insluiten de lever lobule in een optimale snijtemperatuur medium gevuld cryomold en onmiddellijk plaats de mal op droog ijs om een snelle bevriezing te garanderen.Om plakjes van het bevroren leverlobbulemonster te verkrijgen, doorsnijdt u het monster op een dikte van zes micrometer en plaatst u gedurende vijf seconden een gelabelde gecoat polyamide-gecoate dia over elk monster om elk monster aan de dia te laten plakken. Wanneer alle plakjes zijn verzameld, laat u de monsters drie tot vijf minuten in evenwicht brengen bij kamertemperatuur voordat immunotikseikend wordt. Bevestig aan het einde van het evenwicht de weefselsecties in een rookkap met één milliliter van 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Aan het einde van de fixatie, spoel de dia's met drie drie minuten wast in PBS met zachte agitatie. Na de laatste wasbeurt, droog het gebied rond elke weefselsectie en gebruik een hydrofobe pen om een cirkel rond elk monster te trekken. Om de monsters te doorgronden, behandel de secties met een 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, was de monsters gedurende drie minuten in PBS twee maal met zachte agitatie zoals aangetoond voordat de niet-specifieke binding wordt geblokkeerd met een gefilterde oplossing van 1%runderserumalbumen, 5%paardenserum en 0,2% niet-ionische oppervlaktevloeistof in PBS gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur. Vervolgens, incubeer de dia's met de HHF4-alpha antilichaam verdund in het blokkeren van buffer 's nachts op vier graden Celsius in een vochtige kleurkamer beschermd tegen licht. De volgende ochtend, was de dia's vier keer in PBS met zachte agitatie voor incubatie met een geschikte fluorescentie geconjugeerd secundair antilichaam en Hoechst verdund in gefilterd 1%runder serum albumen en 0,2% niet-ionische oppervlakteactieve stof in PBS gedurende twee uur bij kamertemperatuur in een vochtige kleurkamer beschermd tegen licht.Aan het einde van de incubatie, was de glijbanen vier keer zoals aangetoond, gevolgd door twee drie minuten wast in dubbel gedestilleerd water met zachte agitatie. Na de laatste wasbeurt, monteer de monsters met twee druppels fluorescentie montagemedium op een coverslip en breng zachte druk toe als dat nodig is om eventuele bellen te elimineren. Controleer vervolgens de dia's met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop om een goede fixatie en immunolabeling te garanderen.Voor fluorescentie beeld verwerving, stel de parameters op een hoog gehalte imaging platform om fluorescentie beelden te verwerven met behulp van de juiste excitatie voor de gebruikte fluoroforen. Scan vervolgens monsters om voldoende beelden te verkrijgen om volledige dekking van de weefselsectie te verkrijgen. Pas aan het einde van de scan de parameters van de nucleaire segmentatie van de software aan om ervoor te zorgen dat de kernen optimaal gescheiden zijn en wijzig de drempelintensiteit om een optimale gating van de HNF4-alpha-positieve hepatocyten en HNF4-alfa negatieve niet-parenchymale cellen te garanderen.Voor nucleaire kwantificering, stel het nucleaire gebied in vierkante micrometers op basis van de Hoechst kleuring, de belangrijkste nucleaire Hoechst intensiteit, de nucleaire verlenging factor, de gemiddelde nucleaire rondheid index, de HNF4-alpha-status, en de nucleaire X, Y coördinaten op basis van het zwaartepunt. Om een hepatocyte nucleaire ploidy analyse uit te voeren, eerst downloaden en installeren van de ploidy quantification analyse programma. Navigeer in MATLAB naar het tabblad App van de gereedschapsstrip en klik op App installeren.Open het Ploidy Application ML App Install-programma. Er verschijnt een bericht om de succesvolle installatie te bevestigen. Neem in elk gegevensanalysebestand een blad op dat celmaatjes wordt genoemd, met alle gegevens die nodig zijn voor de ploidy-analyse die in kolommen is vermeld, zoals aangegeven.Voor elke experimentele voorwaarde, bieden een controle dataset die zal worden gebruikt om de interne controle voor twee tot vier N nucleaire ploidy kalibratie te berekenen. Voor biologische replica's slaat u elke spreadsheet op in een eigen map en noemt u de mapvoorvoegsels stapsgewijs. Start vervolgens de Ploidy applicatie.De Ploidy applicatie grafische gebruikersinterface zal verschijnen. Klik op de knop Pad naar controlegegevens om naar de map te gaan waarin de besturingsgegevens zich bevinden. Dit gegevenspad wordt vervolgens weergegeven in de interface.Typ in Mapvoorvot de naam die aan de uitvoerbestanden moet worden gegeven. Klik op de knop Pad naar andere gegevens en navigeer naar de map waarin de vergelijkende gegevens zich bevinden. Dit gegevenspad wordt vervolgens weergegeven in de interface.Klik vervolgens op Uitvoeren. Wanneer de analyse is voltooid, wordt op de statusbalk Analyse voltooid gelezen. Na immunotikking is het belangrijk om alle dia's door conventionele fluorescentiemicroscopie te controleren om te bevestigen dat een fixatie en kleuring van goede kwaliteit is verkregen.Smeren of vervagen van de Hoechst kleurstof kan duiden op onvoldoende fixatie of monster afbraak voorafgaand aan fixatie. Parameters voor nucleaire segregatie en HNF4-alfadrempel moeten zorgvuldig worden geoptimaliseerd voordat automatische beeldanalyse wordt uitgevoerd om het visuele patroon van de immunostaining die door fluorescentiemicroscopie wordt waargenomen, ruim weer te geven. Na beeldanalyse moeten de gegevens het toenemende aantal niet-parenchymale cellen en de kleine, maar significante, vermindering van HNF4-alpha positieve kernen in de lever met DDC-letsel weerspiegelen.In gezonde controlelevers vertonen ongeveer 63% van de HNF4-alfa-positieve kernen een eenvoudige cirkelvormige morfometrie. Vergelijking van de relatieve nucleaire truc tussen controle en DDC behandelde groepen moet wijzen op een aanzienlijk verlies van 2C en 4C hepatocyte kernen met letsel samen met een toename van het aantal meer dan 8C cellen. De relatieve positionele informatie voor elke ploidy sub-groep kan worden ondervraagd door het ophalen van de 2D-locatie van bepaalde hepatocyte subsets binnen de hoge inhoud beeldanalyse software.Immunolabeling met extra antilichamen, zoals Ki-67, kan worden uitgevoerd om celreplicatie te beoordelen en hepatocyte nucleaire morfolytiegegevens kunnen verder worden ondervraagd om de pleidy-analyse te complimenteren. Het weefselbrede ploidyprofiel dat door deze methode wordt gegenereerd, beschrijft het minimale DNA-gehalte voor alle cirkelvormige hepatocyte kernen, maar maakt geen onderscheid tussen mononucleaire cellen en binucleaire hepatocyten. De methode kan mogelijk worden aangepast om rekening te houden met parameters zoals celperimeter, om de identificatie van binucleaire cellen te vergemakkelijken en een extra uitlezing van cellulaire truc te bieden.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

A Simple Guide Schroef Methode voor Intracraniële xenograft Studies in Muizen

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

Een eenvoudige methode van de Muis van Lung intubatie

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halsslagader Infusions voor farmacokinetische en farmacodynamische analyse van Taxanen in Muizen

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Hoge doorvoer analyse van volwassen stamcellen ontwikkeld voor toediening van therapeutische factoren voor Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Een verbeterde werkwijze voor snelle intubatie van de trachea in muizen

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Creation of Abdominal Adhesions in Mice

Oprichting van abdominale verklevingen in Muizen

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

Een methode voor het kwantificeren van de bovenste ledematen optreden in het dagelijks leven gebruik maakt van versnellingsmeters

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Schatting van het Nephron aantal in hele nieren met behulp van de zure methode

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...