Name: a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der spanischen MINECO Regierung Zuschüsse BFU2014-58686-P (LAN) und SAF-2017-84708-R (DJB) finanziert. LAN wurde unterstützt durch ein nationales MINECO Ramon y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 und Plan GenT Award (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) und FMN von einem regionalen ValI+D Studentenschaft der Valencianischen Generalitat ACIF/2016/020. Das RP würdigt Prof. Ewa K. Paluch für die Finanzierung. Wir danken Dr. Alicia Martinez-Romero (CIPF Cytometry Service) für die Hilfe bei der IN Cell Analyzer Plattform.

Alle Tierversuche wurden zuvor von der CIPF-Ethikkommission genehmigt. Mäuse wurden in einer pathogenfreien Anlage im Centro de Investigacion Principe Felipe (Valencia, Spanien) untergebracht, registriert als Versuchstierzüchter, Anwender und Versorgungszentrum (reg. ES 46 250 0001 002) nach den geltenden europäischen und spanischen Tierschutzvorschriften (FU 53/2013).
1. Gewebeernte und Probenvorbereitung
HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt, wie Gewebe ohne vorhe...

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	<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+in+liver+tissue.">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+polyploidy:+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide?.">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?.</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li><li>Wilkinson, P. 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Preparative and mathematical protocol.</a> Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).</li><li>Manzano-N&#250;&#241;ez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury.">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214 (2015).</li><li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+of+normal+mouse+liver:+A+histological,+quantitative+immunocytochemical,+and+fine+structural+analysis.">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li><li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells.">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li><li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. 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Ein hochgehaltiger, hochdurchsatzhoher Ansatz für die Analyse der Gewebeumgestaltung und Schätzung der Hepatozyten-Atomploidie in der murinen Leber wird beschrieben. Sobald ein Benutzer mit dem Verfahren vertraut ist, kann er mehrere Proben in einem Zeitraum von 3 bis 5 Tagen verarbeiten, abbilden und analysieren, wodurch große testbare Datasets generiert werden, die eine detaillierte Signatur des Leberzustands bereitstellen. Angesichts der Einfachheit der Probenvorbereitungsmethode, zusammen mit der großen Anzahl de...

Hepatozyten in der Säugetierleber können einer stockenden Zytokinese unterzogen werden, um binukleare Zellen zu produzieren, und DNA-Endoreplikation, um polyploide Kerne zu produzieren, die bis zu 16N DNA-Gehalt enthalten. Insgesamt zelluläre und nukleare Ploidie erhöhen während der postnatalen Entwicklung, Alterung und als Reaktion auf verschiedene zelluläre Belastungen1. Der Prozess der Polyploidisierung ist dynamisch und reversibel2, obwohl seine genaue biologische Funktion unklar bleibt3. Erhöhte Ploidie ist verbunden mit reduzierter Proliferativfähigkeit4, genetische Vielfalt2, Anpassung an chronische Verletzungen5 und Krebsschutz6. Hepatozytenploidie Veränderungen treten als Folge von veränderten zirkadianen Rhythmus7, und Entwöhnung8. Vor allem wird das Ploidy-Profil der Leber durch Verletzung und Krankheitverändert 9, und überzeugende Beweise deuten darauf hin, dass spezifische Ploidy-Änderungen, wie erhöhte 8N-Kerne oder Verlust von 2N Hepatozyten, nützliche Signaturen für die Verfolgung der nicht-alkoholischen Fettleber -Progression (NAFLD) Progression3,10oder die differentialen Auswirkungen von Virusinfektionen11.
Im Allgemeinen sind Leberverletzung und Regeneration mit erhöhter Hepatozytenzellgröße und Kernfläche12verbunden, zusammen mit einer reduzierten Gesamtzahl von Hepatozyten, insbesondere solchen mit 2N-DNA-Gehalt10,11. Parenchymale Verletzungen in der Leber gehen häufig auch mit einer Ausdehnung nicht-parenchymaler Zellen (NPCs) einher, einschließlich stromaler Myofibroblasten, Entzünderzellen und bipotenten Lebervorläuferzellen. Hochdurchsatzmethoden, die ein quantitatives zytologisches Profil der parenchymalen Zellzahl und der Kernploidie liefern und gleichzeitig Veränderungen der NPCs berücksichtigen, haben daher ein beträchtliches Potenzial als Forschungs- und klinische Instrumente, um das Reaktionsverhalten der Leber während von Verletzungen und Krankheiten zu verfolgen. Überzeugende jüngste In-situ-Analysen von Ploidy-Spektren in menschlichen Proben des hepatozellulären Karzinoms zeigen auch, dass die Kernploidie innerhalb von Tumoren dramatisch erhöht ist und speziell in aggressiveren Tumorsubtypen mit reduzierter Differenzierung und Verlust von TP5313verstärkt wird. Daher besteht die große Möglichkeit, dass methodische Fortschritte bei der quantitativen Bewertung der Kernploidie bei der zukünftigen prognostischen Profilierung von Leberkrebs helfen werden.
In diesem Protokoll wird eine flexible Hochdurchsatzmethodik für die vergleichende Analyse von Lebergewebeabschnitten von Mäusen beschrieben, die eine detaillierte zytometrische Profilierung von Hepatozytenzahlen, die NPC-Antwort und eine intern kalibrierte Methode zur Schätzung der Kernploidie bietet (Abbildung 1). Hepatozyten unterscheiden sich von NPCs durch Hepatozyten-Atomfaktor 4 alpha (HNF4) Immunlabelling, vor der Charakterisierung der nuklearen Größe und der nuklearen Morphometrie. Der "Minimale DNA-Gehalt" wird für alle kreisförmigen Kernmasken geschätzt, indem die mittlere Hoechst 33342-Intensität (ein Proxy für DNA-Dichte) mit interpoliertem dreidimensionalem (3D) Kernvolumen integriert wird. Hepatozyten minimaler DNA-Gehalt wird dann mit NPCs kalibriert, um ein nukleares Ploidy-Profil zu erzeugen.
Die Bildaufnahme, die nukleare Segmentierung und die Bildanalyse werden mittels hochauflösender Bildgebung durchgeführt, sodass große Bereiche zweidimensionaler (2D) Leberabschnitte mit Zehntausenden von Zellen gescreent werden können. Für die automatisierte Nachbearbeitung von Bildanalysedaten mit hohem Inhalt wird ein kundenspezifisches Programm bereitgestellt, um ein stichprobenweites Ploidy-Profil für alle kreisförmigen Hepatozytenkerne zu erstellen. Dies wird mit kostenlosen Software zum Herunterladen von Software durchgeführt, um kerntechnische Ploidie basierend auf stereologischer Bildanalyse (SIA)10,11,14,15zu berechnen. Die SIA-Methodik wurde zuvor durch Diedurchflusszytometrie als eine genaue, wenn auch mühsame Methode zur Schätzung der Hepatozyten-Kernploidie in der Leber14validiert, wobei die zirkuläre Kernmorphologie und eine monotone Beziehung zwischen nuklearer Größe und DNA-Gehalt vorausgesetzt werden. In diesem Protokoll werden beide nuklearen Parameter durch Diebewertung der nuklearen Morphometrie und der Hoechst 33342-Kennzeichnung gemessen. Auf die Berechnung des "minimalen DNA-Gehalts" für jede Kernmaske folgt die Kalibrierung der Hepatozyten-Kernploidie mit NPCs, die einen bekannten 2-4N-DNA-Gehalt aufweisen und daher als nützliche interne Kontrolle dienen.
Im Vergleich zu herkömmlichen Durchflusszytometriemethoden16 ermöglicht der beschriebene Ansatz die Bewertung der Hepatozyten-Kernploidie vor Ort und erfordert keinen Zugang zu frischem Gewebe oder Disaggregationsmethoden, die die Ergebnisse verzerrt und schwer zu standardisieren sind. Wie bei allen SIA-basierten Ansätzen sind die Kernploidie-Unterklassen >2N durch 2D-Probenahme aufgrund der Schnittung größerer Kerne außerhalb der äquatorialen Ebene unterrepräsentiert. Das gewebeweite Ploidy-Profil beschreibt auch den minimalen DNA-Gehalt für alle kreisförmigen Hepatozyten-Kernmasken und unterscheidet nicht direkt zwischen mononukleären Hepatozyten und binukleären Zellen, die zwei diskrete ("nicht berührende") Kerne derselben Ploidie haben. Die Einfachheit dieses Protokolls lässt jedoch einen beträchtlichen Spielraum für eine Anpassung an zusätzliche Parameter wie den internuklearen Abstand oder die Zellperimeteranalyse, die die Identifizierung binuklearer Zellen erleichtern würde, was eine detailliertere Bewertung der zellulären Ploidie ermöglichen würde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)</td>
			<td>TestDiet</td>
			<td>1810704</td>
			<td>Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM1850 UV</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>CM1850 UV</td>
			<td>Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statistical software for graphing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IN Cell Analyzer 1000</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td>
			<td></td>
			<td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>630-2864</td>
			<td>Size of 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Speadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Tissue Tek</td>
			<td>Pascual y Furi&#243;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>141451.121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen for immunostaining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>5mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine Microscope Slides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-79380</td>
			<td>Dilution 1:250 (alternative)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6556</td>
			<td>Dilution 1:200 (antibody used in the study)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice

Wenn die Leber verletzt ist, hepatozyten Zahlen abnehmen, während Zellgröße, Kerngröße und Ploidy zu erhöhen. Die Ausdehnung von nicht-parenchymalen Zellen wie Cholangiozyten, Myofibroblasten, Vorläufern und Entzündungszellen weist auch auf chronische Leberschäden, Gewebeumbau und Krankheitsprogression hin. In diesem Protokoll beschreiben wir einen einfachen Ansatz mit hohem Durchsatz zur Berechnung von Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung der Leber, die mit Verletzungen, chronischen Krankheiten und Krebs verbunden sind. Wir zeigen, wie Informationen aus zweidimensionalen (2D) Gewebeabschnitten verwendet werden können, um hepatozyte Kernploidie innerhalb einer Probe zu quantifizieren und zu kalibrieren und es dem Benutzer zu ermöglichen, bestimmte Ploidie-Teilmengen innerhalb der Leber in situ zu lokalisieren. Unsere Methode erfordert Zugang zu festem/gefrorenem Lebermaterial, grundlegenden immunzytochemischen Reagenzien und jeder Standardplattform für bildende Bildgebungsmittel mit hohem Inhalt. Es dient als leistungsstarke Alternative zu Standard-Flow-Zytometrie-Techniken, die Eine Unterbrechung des frisch gesammelten Gewebes, Verlust räumlicher Informationen und potenzielle Disaggregationsverzerrung erfordern.

Diese Methode wurde verwendet, um die Auswirkungen von cholestatischen Verletzungen auf die erwachsene Mausleber zu messen, indem Tiere für 0-21 Tage mit einer hepatotoxischen Diät gefüttert wurden, die 0,1% 3,5-Diethoxycarbonyl-1,4-Dihydrocollidin (DDC)17enthält. Chronische DDC-Fütterung führt zu hepatozellulären Verletzungen erhöhte Ploidie und Periportal Expansion von NPCs. Der Benutzer sollte sich bewusst sein, dass Mausstamm und altersabhängige Unters...

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A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

Wir präsentieren eine robuste, kostengünstige und flexible Methode zur Messung von Veränderungen der Hepatozytenzahl und der Kernploidie in festen/kryokonservierten Gewebeproben, die keine Durchflusszytometrie erfordern. Unser Ansatz bietet eine leistungsstarke probenweite Signatur der Leberzytologie, ideal für die Verfolgung des Fortschreitens von Leberverletzungen und Krankheiten.

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, ein Profil von Hepatozyten-Kern-DNA-Gehalt aus 2D-Gewebe-Sektionen für die Untersuchung der Leberentwicklung, Regeneration, und chronische Krankheiten zu generieren. Dieser automatisierte Hochdurchsatzansatz kann auf alle 2D-Lebergewebeabschnitte angewendet werden, die eine intern kalibrierte Auslesung der Kernploidie für alle einfachen kreisförmigen Hepatozytenkerne bieten. Veränderungen in der Hepatozyten-Kernploidie sind mit Alterung, chronischeleber Erkrankungen und Krebs verbunden.Diese Technik bietet eine einfache Möglichkeit, die Kernploidie in festen oder kryokonservierten Leberproben zu profilieren. In situ ploidy Profiling-Methoden haben erhebliches Potenzial als Forschung und klinische Werkzeuge zur Verfolgung der Lebererkrankung Progression, da sie keine Gewebe-Desegregation oder Zugang zu frischem Material erfordern. Nach der Ernte der murinen Lebergewebeprobe, betten Sie die Leber-Lobule in eine optimale Schneidtemperatur mittelgefüllt Kryomold und sofort legen Sie die Form auf Trockeneis, um ein schnelles Einfrieren zu gewährleisten.Um Scheiben der gefrorenen Leberlupenprobe zu erhalten, schneiden Sie die Probe mit einer Dicke von sechs Mikrometern ab und legen Sie einen beschrifteten polyamidbeschichteten Schlitten für fünf Sekunden über jede Probe, um jede Probe auf dem Dia kleben zu lassen. Wenn alle Scheiben gesammelt wurden, lassen Sie die Proben drei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur vor der Immunetikettierung ausdemieren. Am Ende des Gleichgewichts die Gewebeabschnitte in einer Dunstabzugshaube mit einem Milliliter 4%Paraformaldehyd in PBS 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren.Am Ende der Fixierung spülen Sie die Dias mit drei dreiminütigen Wärten in PBS mit sanfter Rührung ab. Nach der letzten Wäsche den Bereich um jeden Gewebeabschnitt trocknen und einen hydrophoben Stift verwenden, um einen Kreis um jede Probe zu ziehen. Um die Proben zu permeabilisieren, behandeln Sie die Abschnitte mit einem 0,5% nichtionischen Tensid in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur.Am Ende der Inkubation die Proben für drei Minuten in PBS zweimal mit sanfter Rührung waschen, wie gezeigt, bevor Sie die unspezifische Bindung mit einer gefilterten Lösung von 1%rinderserumalbumen, 5%Pferdeserum und 0,2% nicht-ionischem Tensid in PBS für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur blockieren. Als nächstes inkubieren Sie die Dias mit dem HHF4-alpha-Antikörper, der über Nacht bei vier Grad Celsius in einer feuchten, lichtgeschützten Färbekammer im Sperrpuffer verdünnt wird. Am nächsten Morgen die Dias viermal in PBS mit sanfter Rührung vor der Inkubation mit einem geeigneten fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörper waschen und Hoechst in gefiltertem 1%rinderserumalbumen und 0,2% nicht-ionischem Tensid in PBS für zwei Stunden bei Raumtemperatur in einer feuchten, lichtgeschützten Färbekammer verdünnt.Am Ende der Inkubation die Dias viermal waschen, wie gezeigt, gefolgt von zwei dreiminütigen Wäschen in doppelt destilliertem Wasser mit sanfter Rührung. Nach der letzten Wäsche die Proben mit zwei Tropfen Fluoreszenz-Montagemedium auf einem Deckelschlupf montieren und bei Bedarf sanften Druck ausüben, um Blasen zu beseitigen. Überprüfen Sie dann die Dias mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop, um eine gute Fixierung und Immunkennzeichnung zu gewährleisten.Legen Sie für die Fluoreszenzbildaufnahme die Parameter auf einer Bildgebungsplattform mit hohem Inhalt fest, um Fluoreszenzbilder unter Verwendung der geeigneten Anregung für die verwendeten Fluorophore zu erfassen. Scannen Sie dann Proben, um genügend Bilder zu erhalten, um eine vollständige Abdeckung des Gewebeabschnitts zu erhalten. Passen Sie am Ende des Scans die nuklearen Segmentierungsparameter der Software an, um sicherzustellen, dass die Kerne optimal getrennt sind, und ändern Sie die Schwellenintensität, um eine optimale Gating der HNF4-alpha-positiven Hepatozyten und HNF4-alpha-negativen nicht-parenchymalen Zellen zu gewährleisten.Für die nukleare Quantifizierung, setzen Sie den Kernbereich in quadratische Mikrometer basierend auf der Hoechst Färbung, die wichtigste nukleare Hoechst-Intensität, den nuklearen Dehnungsfaktor, den mittleren nuklearen Rundungsindex, den HNF4-alpha-Status und die nuklearen X- Y-Koordinaten basierend auf dem Schwerpunkt. Um eine Hepatozyten-Kernploidie-Analyse durchzuführen, laden Sie zuerst das Ploidy-Quantifizierungsanalyseprogramm herunter und installieren Sie es. Navigieren Sie in MATLAB zur Registerkarte App des Toolstrips, und klicken Sie auf App installieren.Öffnen Sie das Ploidy Application ML App Install-Programm. Es wird eine Meldung angezeigt, um die erfolgreiche Installation zu bestätigen. Fügen Sie in jede Datenanalysedatei ein Blatt mit dem Namen "Zellmessungen" ein, das alle für die Ploidy-Analyse erforderlichen Daten enthält, die in den angegebenen Spalten angegeben sind.Stellen Sie für jede Versuchsbedingung einen Kontrolldatensatz bereit, der zur Berechnung der internen Steuerung für die Kalibrierung der Kernploidie von zwei bis vier N verwendet wird. Speichern Sie bei biologischen Replikationen jede Kalkulationstabelle in einem eigenen Ordner, indem Sie die Ordnerpräfixe inkrementell benennen. Als Nächstes starten Sie die Ploidy-Anwendung.Die grafische Benutzeroberfläche der Anwendung Ploidy wird angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Pfad zum Steuern von Daten, um zu dem Ordner zu navigieren, in dem sich die Steuerelementdaten replizieren. Dieser Datenpfad wird dann in der Schnittstelle angezeigt.Geben Sie im Ordnerpräfix den Namen ein, der den Ausgabedateien gegeben werden soll. Klicken Sie auf die Schaltfläche Pfad zu anderen Daten, und navigieren Sie zu dem Ordner, in dem sich die Vergleichsdaten replizieren. Dieser Datenpfad wird dann in der Schnittstelle angezeigt.Klicken Sie dann auf Ausführen. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, liest die Statusleiste Analysis Complete. Nach der Immunkennzeichnung ist es wichtig, alle Dias durch herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie zu überprüfen, um zu bestätigen, dass eine gute Qualität der Fixierung und Färbung erhalten wurde.Das Abwischen oder Verwischen des Hoechst-Farbstoffs kann auf eine unzureichende Fixierung oder Probendegradation vor der Fixierung hindeuten. Die nukleare Segregation und die HNF4-alpha-Schwellenwertparameter sollten vor der automatischen Bildanalyse sorgfältig optimiert werden, um das visuelle Muster der Immunfärbung, das durch die Fluoreszenzmikroskopie beobachtet wird, weitgehend widerzuspiegeln. Nach der Bildanalyse sollten die Daten die steigende Anzahl nicht-parenchymaler Zellen und die kleine, aber signifikante Verringerung der HNF4-alpha-positiven Kernkerne in der Leber mit DDC-Verletzung widerspiegeln.In gesunden Kontrolllebern weisen ca. 63% der HNF4-alpha-positiven Kerne eine einfache kreisförmige Morphometrie auf. Der Vergleich der relativen Kernploidie zwischen Kontroll- und DDC-behandelten Gruppen sollte einen signifikanten Verlust von 2C- und 4C-Hepatozytenkernen mit Verletzungen sowie eine erhöhte Anzahl von mehr als 8C-Zellen widerspiegeln. Die relativen Positionsinformationen für jede Ploidy-Untergruppe können durch Abrufen der 2D-Position bestimmter Hepatozyten-Teilmengen innerhalb der Bildanalysesoftware mit hohem Inhalt abgefragt werden.Die Immunkennzeichnung mit zusätzlichen Antikörpern, wie Ki-67, kann durchgeführt werden, um die Zellreplikation zu bewerten, und die Daten der Hepatozyten-Kernmorphometrie können weiter abgefragt werden, um die Ploidie-Analyse zu ergänzen. Das durch diese Methode erzeugte gewebeweite Ploidy-Profil beschreibt den minimalen DNA-Gehalt für alle kreisförmigen Hepatozytenkerne, unterscheidet aber nicht zwischen mononukleären Zellen und binukleären Hepatozyten. Die Methode kann potenziell an Parameter wie Zellperimeter angepasst werden, um die Identifizierung binuklearer Zellen zu erleichtern und eine zusätzliche Auslesung der zellulären Ploidie bereitzustellen.

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