Name: a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי הממשלה הספרדית MINECO מענקים BFU2014-58686-P (LAN) ו-2017-84708-R (DJB). LAN נתמך על ידי האגודה הלאומית מינאקו רמון את החבר RYC-2012-11700 ומתכננת פרס (Comunitat ולנסיה, CDEI-05/20-C), ו-FMN על ידי האזור ValI ו-D שמאל של ולנסיה/2016/020. RP מעוניין להכיר בפרופ ' Ewa ק. פלך למימון. אנו מודים לדוקטור אלישיה מרטיז-רומרו (שירות השירות הסיילאנסה) לקבלת עזרה בפלטפורמת מנתח התאים.

כל ניסויי החיות אושרו בעבר על ידי ועדת האתיקה של האו. עכברים שוכנו במתקן נטול הפתוגן במרכז החקירה של פרינסיפה פליפה (ולנסיה, ספרד), רשום בתור בעל חיים ניסיוני מגדל, משתמש, ואספקה (reg. no. ES 46 250 0001 002) תחת התנאים הנוכחיים של הרווחה האירופית והספרדית בעלי חיים (RD 53/2013).
1. קצירת רקמות וה...

<ol>
	<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+in+liver+tissue.">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+polyploidy:+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide?.">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?.</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Restricts+Hepatocyte+Proliferation+and+Liver+Regeneration+in+Mice.">The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice.</a> Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploid+Hepatocytes+Facilitate+Adaptation+and+Regeneration+to+Chronic+Liver+Injury.">Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury.</a> The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver.">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li><li>Chao, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clock+regulates+hepatic+polyploidy+by+modulating+Mkp1-Erk1/2+signaling+pathway.">Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway.</a> Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).</li><li>Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin/Akt+pathway+controls+a+specific+cell+division+program+that+leads+to+generation+of+binucleated+tetraploid+liver+cells+in+rodents.">The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).</li><li>Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+polyploidization+and+its+association+with+pathophysiological+processes.">Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (5), e2805 (2017).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Toyoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+to+hepatocyte+ploidy+and+binuclearity+profiles+during+human+chronic+viral+hepatitis.">Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis.</a> Gut. 54 (2), 297-302 (2005).</li><li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+and+Unconventional+Cell+Division+of+Hepatocytes+Underlie+Liver+Regeneration.">Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration.</a> Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. , (2019).</li><li>Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+determining+ploidy+distributions+in+liver+tissue+by+stereological+analysis+of+nuclear+size+calibrated+by+flow+cytometric+DNA+analysis.">A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis.</a> Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).</li><li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Cell+Polyploidization:+A+Pivotal+Role+for+Binuclear+Hepatocytes.">Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li><li>Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+mouse+hepatocyte+ploidy+-+I.+Preparative+and+mathematical+protocol.">Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol.</a> Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).</li><li>Manzano-N&#250;&#241;ez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury.">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214 (2015).</li><li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+of+normal+mouse+liver:+A+histological,+quantitative+immunocytochemical,+and+fine+structural+analysis.">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li><li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells.">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li><li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hepatocyte+ploidy+levels+with+body+size+and+growth+rate+in+mammals.">Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals.</a> Genome. 44 (3), 350-360 (2001).</li><li>Tanami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+zonation+of+liver+polyploidy.">Dynamic zonation of liver polyploidy.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).</li><li>Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+and+liver+proliferation.">Polyploidy and liver proliferation.</a> Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).</li><li>Uhl&#233;n, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-based+map+of+the+human+proteome.">Tissue-based map of the human proteome.</a> Science. 347 (6220), 1260419 (2015).</li></ol>

מתואר בגישה גבוהה ובתפוקה גבוהה לניתוח שיפוץ רקמות והערכת הערכה גרעינית של הפטוציט בכבד מורטין. ברגע שהוא מכיר את הנוהל, משתמש יכול לעבד, לצלם ולנתח דגימות מרובות ב-3-5 ימים של תקופה, יצירת ערכות נתונים של ברת גדול המספקים חתימה מפורטת של בריאות הכבד. בהינתן הפשטות של שיטת ההכנה לדוגמה, יחד ע...

הפטציטים בכבד היונקים יכולים לעבור נתקע ציטוקינזה כדי לייצר תאים binuclear, ו-DNA endoreplication לייצר גרעיני פוליפואיד המכילים עד 16N ה-DNA תוכן. הגדלת הפלואידיות התאית והגרעינית במהלך פיתוח הפוסט-לידה, הזדקנות ותגובה ללחצים סלולריים מגוונים1. תהליך הפוליפולואידיזציה הוא דינמי והפיך2, למרות שתפקידה הביולוגי המדויק אינו ברור3. מוגברת פלויידי הוא קשור עם קיבולת ההתרבות מופחתת4, מגוון גנטי2, הסתגלות לפציעה כרונית5 הגנה מפני סרטן6. השינוי הפטוציט הפלואידי מתרחש כתוצאה מקצב מעגלי משתנה7, והגמילהמשמונה. בעיקר, הפרופיל הפלואידי של הכבד משתנה על ידי פציעה ומחלה9, וראיות משכנעות מציע כי שינויים מסוימים פלואידיות, כגון הגדלת ≥ 8n גרעינים או אובדן של 2n hepatocytes, לספק חתימות שימושיות עבור מעקב אחר מחלת כבד שומני לא אלכוהוליים (nafld11) התקדמות3,10, או ה
במונחים כלליים, פגיעה בכבד והתחדשות קשורים עם גודל תא hepatocyte מוגבר שטח גרעיני12, יחד עם מספר כולל מופחת של hepatocyte, במיוחד אלה עם 2n תוכן DNA10,11. הפציעה בכבד מלווה גם לעתים קרובות על ידי התרחבות של תאים שאינם מתוך הכתוניים (NPCs), כולל סטרומה מיוסטרותקיעות, תאים דלקתיים ותאים מחולל בכבד biפוטנטי. שיטות תפוקה גבוהה המספקות פרופיל ציטולוגי כמותי של מספר תא מדומה ופלויידי גרעיני, ואילו גם חשבונאות לשינויים NPCs, ולכן יש פוטנציאל ניכר כמו מחקר כלים קליניים כדי לעקוב אחר תגובת הכבד במהלך הפציעה והמחלה. משכנעת לאחרונה בניתוח באתרו של הפלויידי ספקטרום בדגימות האדם של קרצינומה hepatocellular גם להדגים כי הפיידי הגרעינית הוא גדל באופן דרמטי בתוך גידולים והוא מוגבר במיוחד תת הגידול אגרסיבי יותר עם בידול מופחת ואובדן של TP5313. מכאן, קיימת אפשרות חזקה שהתקדמות מתודולוגיים בהערכה כמותית של הפלואידיות הגרעינית תסייע ביצירת פרופיל התחזיות העתידיות של סרטן הכבד.
בפרוטוקול זה, מתודולוגיה גמישה בתפוקה גבוהה עבור ניתוח השוואתי של מקטעי רקמת הכבד של העכבר מתוארים, אשר מספק פרופיל cy, מפורט של מספרי hepatocyte, התגובה NPC ושיטה מכויל פנימי להערכת הגרעין פלויידי (איור 1). הפטציטים נבדלים מ NPCs על ידי הגורם הגרעיני hepatocytes 4 אלפא (HNF4α) אימונויניום, לפני אפיון של גודל גרעיני וממורמטריה גרעינית. "תוכן ה-DNA מינימלי" מוערך עבור כל מסכות גרעיניות מעגלית על ידי שילוב ממוצע Hoechst 33342 עוצמה (proxy עבור צפיפות DNA) עם הנפח תלת מימדי (3D) הגרעיני. הפטציט תוכן די-אן-איי מינימלי מכויל לאחר מכן באמצעות NPCs כדי ליצור פרופיל של פלויידי גרעיני.
רכישת תמונה, פילוח גרעיני וניתוח תמונה מבוצעים באמצעות הדמיה בעלת תוכן גבוה, המאפשר אזורים גדולים של דו מימדי (2D) מקטעי כבד המכילים עשרות אלפי תאים להיות מוקרן. תוכנית מותאמת אישית מסופקת לצורך עיבוד אוטומטי של נתוני ניתוח תמונה באיכות גבוהה כדי להפיק פרופיל פלואידי רחב לדגימה לכל גרעין הפטוציט המעגלי. פעולה זו מבוצעת באמצעות חינם כדי להוריד את התוכנה כדי לחשב את הנשק הגרעיני מבוסס על ניתוח התמונה סטריאוולוגית (SIA)10,11,14,15. מתודולוגיית ה-SIA אומתה בעבר על ידי הזרמת cy, כשיטה מדויקת, אם כי מפרך, שיטה להערכת הפרופציט גרעינית בכבד14, בהנחה מורפולוגיה גרעינית מעגלית מערכת יחסים בין הגודל הגרעיני ותוכן ה-DNA. בפרוטוקול זה, שני הפרמטרים הגרעיניים נמדדים על ידי הערכה של מורמטריה גרעינית ו הופסט תוויות 33342. החישוב של "תוכן ה-DNA מינימלי" עבור כל מסכה גרעינית מלווה בכיול של hepatocyte הגרעין הגרעיני באמצעות NPCs, אשר יש הידוע 2 על התוכן DNA ולכן לשמש שליטה פנימית שימושי.
לעומת הזרם הקונבנציונלי cy, שיטות שירות16 הגישה המתוארת מאפשרת hepatocyte הגרעין הגרעיני כדי להיות מוערך באתרו ואינו דורש גישה לרקמה טרייה או שיטות מצבור שיכולים הטיה תוצאות ולהיות קשה לתקנן. כמו בכל הגישות המבוססות על SIA, מחלקות ההגנה הגרעינית > 2N מיוצגים באמצעות דגימת 2N בשל החשיפה של גרעין גדול מחוץ למישור המשוונית. הפרופיל ברקמות הפלואידיות מתאר גם את תוכן ה-DNA המינימלי לכל מסכות הגרעין העגולות, ואינו מפלה ישירות בין תאי הפטציטים והתאים הבינאוריים בעלי שני הגרעינים הנפרדים ("לא נוגעים") של אותו פלויידי. עם זאת, את הפשטות של פרוטוקול זה מאפשר היקף ניכר עבור אותו להיות מותאם לחשבון עבור פרמטרים נוספים כגון מרווח בין גרעיני או ניתוח היקפי התא, זה יקל על זיהוי של תאים binuclear מתן הערכה מפורטת יותר של הסלולר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)</td>
			<td>TestDiet</td>
			<td>1810704</td>
			<td>Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM1850 UV</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>CM1850 UV</td>
			<td>Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statistical software for graphing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IN Cell Analyzer 1000</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td>
			<td></td>
			<td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>630-2864</td>
			<td>Size of 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Speadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Tissue Tek</td>
			<td>Pascual y Furi&#243;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>141451.121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen for immunostaining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>5mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine Microscope Slides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-79380</td>
			<td>Dilution 1:250 (alternative)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6556</td>
			<td>Dilution 1:200 (antibody used in the study)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice

כאשר הכבד נפצע, מספרי הפטוציט מפחיתים, בעוד שגודל התאים, גודל הגרעין והעלייה בפלויידי. התרחבות של תאים שאינם מסוג מדומה, כגון המרה, מיופיברוציטים, ושלתי ותאים דלקתיים גם מצביעים על נזק כבד כרוני, שיפוץ רקמות והתקדמות המחלה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים גישה פשוטה תפוקה גבוהה לחישוב שינויים בהרכב הסלולר של הכבד הקשורים לפציעה, מחלה כרונית וסרטן. אנו מראים כיצד מידע שהופק מסעיפים דו ממדיים (2D) רקמות ניתן להשתמש כדי לכמת ולכייל hepatocyte הגרעין הגרעיני בתוך מדגם ולאפשר למשתמש לאתר תת ערכות מסוימות פלואידיות בתוך הכבד באתרו. השיטה שלנו דורשת גישה לחומר כבד קבוע/קפוא, ריאגנטים חיסונית בסיסי וכלי כל פלטפורמת הדמיה גבוהה. היא משמשת חלופה רבת עוצמה לטכניקות הזרימה הסטנדרטיות של cy, אשר דורשות הפרעה של רקמה שנאספה לפני כן, אובדן מידע מרחבי והטיה פוטנציאלית לפירוק.

שיטה זו שימש כדי למדוד את ההשפעה של פציעה בכיס התינוק על הכבד של העכבר המבוגר על ידי האכלה בעלי חיים עבור 0-21 ימים עם דיאטה hepatotoxic המכיל 0.1% 3, 5-diethoxycarbonyl-1, 4-דיהידרוטסטוסטרון (DDC)17. תוצאות כרוניות DDC האכלה בפציעה hepatocellular גדל פלויידי והרחבת הפורטל של NPCs. המשתמש צריך ...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

אנו מציגים שיטה חזקה, חסכונית, וגמיש למדידת שינויים במספר hepatocyte ובכלי הנשק הגרעיני בתוך קבוע/הקפאה דגימות רקמות שאינו דורש זרימה cy, try. הגישה שלנו מספקת חתימה רבת עוצמה לדוגמה של ציטולוגיה בכבד עבור מעקב אחר ההתקדמות של פגיעה בכבד ומחלות.

תפוקה גבוהה בשיטת באתרו להערכת הפטציט הגרעיני בעכברים

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור פרופיל של תוכן DNA גרעיני hepatocyte ממקטעי רקמה דו-מימדית לחקר התפתחות הכבד, התחדשות ומחלות כרוניות. גישה אוטומטית זו של תפוקה גבוהה יכולה להיות מיושמת על כל חלקי רקמת הכבד הדו-מימדית, ומספקת קריאה פנימית מכוילת של תכסיס גרעיני לכל גרעיני ההפטוציט המעגליים הפשוטים. שינויים בתכסיס הגרעיני hepatocyte קשורים הזדקנות, מחלת כבד כרונית, וסרטן.טכניקה זו מספקת אמצעי פשוט פרופיל תכסיס גרעיני בדגימות כבד קבועות או cryopreserved. בשיטות פרופיל תכסיס situ יש פוטנציאל ניכר כמו מחקר וכלים קליניים למעקב אחר התקדמות מחלת הכבד כפי שהם אינם דורשים desegregation רקמות או גישה לחומר טרי. לאחר קצירת דגימת רקמת הכבד המורין, להטמיע את אוניית הכבד לתוך טמפרטורת חיתוך אופטימלית בינוני מלא cryomold ומיד למקם את התבנית על קרח יבש כדי להבטיח הקפאה מהירה.כדי להשיג פרוסות של דגימת אונות הכבד הקפואה, חלקו את הדגימה בעובי של שישה מיקרומטר, והניחו מגלשה מצופה פוליאמיד מסומנת מעל כל דגימה למשך חמש שניות כדי לאפשר לכל דגימה להידבק לשקופית. כאשר כל הפרוסות נאספו, לאפשר את הדגימות כדי לצייד במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר לפני immunolabeling. בסוף שיווי המשקל, לתקן את חלקי הרקמה במכסה המנוע אדים עם מיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף קיבעון, לשטוף את השקופיות עם שלוש שלוש דקות שוטף PBS עם תסיסה עדינה. לאחר הכביסה האחרונה, ייבשו את האזור סביב כל קטע רקמה ולהשתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגול סביב כל דגימה. כדי לחלחל את הדגימות, לטפל בחלקים עם 0.5% לא יוני פעילי שטח PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות במשך שלוש דקות ב PBS פעמיים עם תסיסה עדינה כפי שהוכח לפני חסימת כריכה לא ספציפית עם פתרון מסונן של 1%bovine סרום אלבומן, 5% סרום סוס, ו 0.2% לא יוני פעילי שטח ב- PBS לפחות שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הדגירה את השקופיות עם נוגדן HHF4-אלפא מדולל במאגר חסימה לילה בארבע מעלות צלזיוס בתא תכהום לח מוגן מפני אור. למחרת בבוקר, לשטוף את המגלשות ארבע פעמים PBS עם תסיסה עדינה לפני הדגירה עם פלואורסצנטיות מתאימה נדנוגדן משני Hoechst מדולל בסרום מסונן 1% bovine albumen ו 0.2% לא יוני פעילי שטח ב PBS במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתא כתמים לח מוגן מפני אור.בסוף הדגירה, לשטוף את המגלשות ארבע פעמים כפי שהודגם, ואחריו שתי שלוש דקות שוטף במים מזוקקים כפולים עם תסיסה עדינה. לאחר הכביסה האחרונה, הר את הדגימות עם שתי טיפות של פלואורסצנטיות הרכבה בינונית על כיסוי ולהחיל לחץ עדין לפי הצורך כדי לחסל את כל הבועות. לאחר מכן, בדוק את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי כדי להבטיח קיבעון טוב immunolabeling.לרכישת תמונות פלואורסצנטיות, הגדר את הפרמטרים בפלטפורמת הדמיית תוכן גבוהה כדי לרכוש תמונות פלואורסצנטיות באמצעות העירור המתאים עבור הפלואורופורים המשמשים. לאחר מכן לסרוק דגימות כדי להשיג תמונות מספיקות כדי לקבל כיסוי מלא של סעיף הרקמה. בסוף הסריקה, להתאים את הפרמטרים פילוח גרעיני של התוכנה כדי להבטיח כי הגרעינים מופרדים באופן אופטימלי ולשנות את עוצמת הסף כדי להבטיח gating אופטימלי של hepatocytes חיובי HNF4-אלפא ותאים שליליים HNF4-אלפא שאינם פרנצ'ימליים.לכימות גרעיני, הגדר את האזור הגרעיני במיקרומטרים מרובעים המבוססים על הכתמת הויכסט, עוצמת Hoechst הגרעינית העיקרית, גורם התארכות גרעינית, מדד העגול הגרעיני הממוצע, מעמד HNF4-אלפא, וקואורדינטות X, Y הגרעיניות המבוססות על מרכז הכובד. כדי לבצע ניתוח תכסיס גרעיני hepatocyte, תחילה להוריד ולהתקין את תוכנית ניתוח כימות תכסיס. ב- MATLAB, נווט אל הכרטיסיה אפליקציה של רצועת הכלים ולחץ על התקן יישום.פתח את התוכנית התקנת יישומים של ML של יישום Ploidy. תופיע הודעה שתאשר את ההתקנה המוצלחת. בכל קובץ ניתוח נתונים, כלול גיליון בשם Cell Measures, המכיל את כל הנתונים הדרושים לניתוח התחבולות שנקבע בעמודות כמצוין.עבור כל מצב ניסיוני, ספק ערכת נתונים לבקרה שתשמש לחישוב הבקרה הפנימית עבור כיול תכסיס גרעיני של 2 עד 4 N. עבור שכפולים ביולוגיים, אחסן כל גיליון אלקטרוני בתיקיה משלו, ו מתן שם לתיקדומות התיקיה באופן הדרגתי. לאחר מכן, הפעל את היישום Ploidy.ממשק המשתמש הגרפי הגרפי של יישום Ploidy יופיע. לחץ על לחצן נתיב לפקד נתונים כדי לנווט לתיקיה שבה שוכנים שכפולי נתוני הפקד. נתיב נתונים זה יופיע לאחר מכן בממשק.בקידומת תיקיה, הקלד את השם שיש לתת לקבצי הפלט. לחץ על לחצן נתיב לנתונים אחרים ונווט אל התיקיה שבה שוכנים שכפולי הנתונים ההשוואתיים. נתיב נתונים זה יופיע לאחר מכן בממשק.לאחר מכן לחץ על הפעל. לאחר השלמת הניתוח, שורת המצב תקרא ניתוח הושלם. לאחר immunolabeling, חשוב לבדוק את כל השקופיות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי קונבנציונלי כדי לאשר כי קיבעון באיכות טובה וכתמים הושגה.מריחה או טשטוש של צבע Hoechst יכול להצביע על קיבעון לקוי או השפלה מדגם לפני הקיבעון. הפרדה גרעינית ופרמטרי סף HNF4-alpha יש לייעל בזהירות לפני ניתוח תמונה אוטומטי כדי לשקף באופן נרחב את התבנית החזותית של immunostaining שנצפה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. לאחר ניתוח תמונה, הנתונים צריכים לשקף את המספרים ההולכים וגדלים של תאים שאינם על-טבעיים ואת הקטנים, אך משמעותיים, ירידה במספרי הגרעינים החיוביים HNF4-alpha בתוך הכבד עם פגיעה DDC.בכבדי בקרה בריאים, כ-63% מהגרעין החיובי HNF4-alpha מפגינים מורפומטריה מעגלית פשוטה. השוואה של התכסיס הגרעיני היחסי בין קבוצות שליטה וDDC מטופלים צריך לשקף אובדן משמעותי של 2C ו 4C hepatocyte גרעינים עם פציעה יחד עם מספר גדל של תאים יותר מ 8C. ניתן לחקור את המידע המיקום היחסי עבור כל קבוצת משנה של תכסיסים על-ידי אחזור המיקום הדו-מימדי של קבוצות משנה מסוימות של hepatocyte בתוכנה לניתוח תמונות תוכן גבוהה.Immunolabeling עם נוגדנים נוספים, כגון Ki-67, ניתן לבצע כדי להעריך שכפול תאים ונתונים מורפומטריה גרעינית hepatocyte ניתן לחקור עוד יותר כדי להחמיא ניתוח תכסיס. פרופיל התכסיסים הרחב שנוצר בשיטה זו מתאר את תוכן הדנ"א המינימלי עבור כל גרעיני ההפטוציטים המעגליים, אך אינו מפלה בין תאים מונונוקאריים לבין hepatocytes binuclear. השיטה עשויה להיות מותאמת לחשבון עבור פרמטרים כגון היקף התא, כדי להקל על זיהוי תאים binuclear ולספק קריאה נוספת של תכסיס הסלולר.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

מדריך פשוט בורג שיטה ללימודי xenograft תוך גולגולתי של עכברים

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

שיטה פשוטה של ​​אינטובציה ריאות המאוסות

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

חליטות עורק הראשי לpharmacokinetic וpharmacodynamic ניתוח של taxanes בעכברים

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

שיטה משופרת עבור אינטובציה מהירה של קנה הנשימה של עכברים

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Creation of Abdominal Adhesions in Mice

יצירת הידבקויות בטן עכברים

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

שיטה לכימות ביצוע גפיים עליונים ב Daily Life בעזרת מדי תאוצה

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

הערכה של מספר נפרורון בכליה שלמה באמצעות שיטת השימוש באסיד

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...