Name: a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av den spanske MINECO regjeringen gir BFU2014-58686-P (LAN) og SAF-2017-84708-R (DJB). LAN ble støttet av en nasjonal MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 og Plan GenT award (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), og FMN av en regional ValI + D studentship av Valencian Generalitat ACIF/2016/020. RP vil gjerne anerkjenne prof. Ewa K. Paluch for finansiering. Vi takker Dr. Alicia Martínez-Romero (CIPF Cytometry service) for hjelp med IN Cell Analyzer-plattformen.

Alle dyreforsøk ble tidligere godkjent av CIPFs etikkkomité. Mus ble plassert i et patogenfritt anlegg ved Centro de Investigación Príncipe Felipe (Valencia, Spania), registrert som en eksperimentell dyreoppdretter, bruker og forsyningssenter (reg. nr. ES 46 250 0001 002) i henhold til gjeldende europeiske og spanske dyrevelferdsforskrifter (RD 53/2013).
1. Vevhøsting og prøvepreparat
MERK: Denne protokollen beskriver hvordan du fryser vev uten tidligere fikseri...

<ol>
	<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+in+liver+tissue.">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+polyploidy:+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide?.">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?.</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Restricts+Hepatocyte+Proliferation+and+Liver+Regeneration+in+Mice.">The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice.</a> Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploid+Hepatocytes+Facilitate+Adaptation+and+Regeneration+to+Chronic+Liver+Injury.">Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury.</a> The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver.">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li><li>Chao, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clock+regulates+hepatic+polyploidy+by+modulating+Mkp1-Erk1/2+signaling+pathway.">Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway.</a> Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).</li><li>Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin/Akt+pathway+controls+a+specific+cell+division+program+that+leads+to+generation+of+binucleated+tetraploid+liver+cells+in+rodents.">The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).</li><li>Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+polyploidization+and+its+association+with+pathophysiological+processes.">Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (5), e2805 (2017).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Toyoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+to+hepatocyte+ploidy+and+binuclearity+profiles+during+human+chronic+viral+hepatitis.">Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis.</a> Gut. 54 (2), 297-302 (2005).</li><li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+and+Unconventional+Cell+Division+of+Hepatocytes+Underlie+Liver+Regeneration.">Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration.</a> Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. , (2019).</li><li>Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+determining+ploidy+distributions+in+liver+tissue+by+stereological+analysis+of+nuclear+size+calibrated+by+flow+cytometric+DNA+analysis.">A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis.</a> Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).</li><li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Cell+Polyploidization:+A+Pivotal+Role+for+Binuclear+Hepatocytes.">Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li><li>Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+mouse+hepatocyte+ploidy+-+I.+Preparative+and+mathematical+protocol.">Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol.</a> Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).</li><li>Manzano-N&#250;&#241;ez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury.">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214 (2015).</li><li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+of+normal+mouse+liver:+A+histological,+quantitative+immunocytochemical,+and+fine+structural+analysis.">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li><li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells.">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li><li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hepatocyte+ploidy+levels+with+body+size+and+growth+rate+in+mammals.">Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals.</a> Genome. 44 (3), 350-360 (2001).</li><li>Tanami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+zonation+of+liver+polyploidy.">Dynamic zonation of liver polyploidy.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).</li><li>Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+and+liver+proliferation.">Polyploidy and liver proliferation.</a> Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).</li><li>Uhl&#233;n, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-based+map+of+the+human+proteome.">Tissue-based map of the human proteome.</a> Science. 347 (6220), 1260419 (2015).</li></ol>

En høy-innhold, høy gjennomstrømning tilnærming for analyse av vev remodeling og estimering av hepatocytkjerne nukleær ploidy i murine leveren er beskrevet. Når en kjent med prosedyren, kan en bruker behandle, bildeog analysere flere prøver i en 3-5 dagers periode, og generere store testbare datasett som gir en detaljert signatur av leverhelse. Gitt enkelheten i prøveforberedelsesmetoden, sammen med det store antallet celler og vevsområde analysert (i gjennomsnitt 14 mm2/ prøve), resultatene er robus...

Hepatocytter i pattedyrleveren kan gjennomgå stoppet cytokinese for å produsere tonukleære celler, og DNA-endoreplikasjon for å produsere polyploidkjerner som inneholder opptil 16N DNA-innhold. Samlet cellulær og kjernefysisk ploidy økning under postnatal utvikling, aldring og som svar på ulike cellulære påkjenninger1. Prosessen med polyplaitoisering er dynamisk og reversibel2, selv om den nøyaktige biologiske funksjonen forblir uklar3. Økt plaoidi er forbundet med redusert proliferativ kapasitet4, genetisk mangfold2, tilpasning til kronisk skade5 og kreftbeskyttelse6. Hepatocytt ploidy endringer oppstår som følge av endret døgnrytme7, og avvenning8. Spesielt er den ploidy profilen til leveren endret av skade og sykdom9, og overbevisende bevis tyder på at spesifikke ploidy endringer, for eksempel økt ≥ 8N kjerner eller tap av 2N hepatocytter, gir nyttige signaturer for sporing av ikke-alkoholholdigfettleversykdom (NAFLD) progresjon3,10, eller differensialvirkningen av virusinfeksjoner11.
Generelt er leverskade og regenerering forbundet med økt hepatocytcellestørrelse og kjernefysisk område12, sammen med redusert antall hepatocytter, spesielt de med 2N DNA-innhold10,11. Parenchymal skade i leveren er også ofte ledsaget av utvidelse av ikke-parenchymal celler (NPCer), inkludert stromal myofibroblaster, inflammatoriske celler og bipotente leverstamceller. Høy gjennomstrømningsmetoder som gir en kvantitativ cytologisk profil av parenchymal cellenummer og kjernefysisk plaoidi, samtidig som de tar hensyn til endringer i NPCer, har derfor betydelig potensial som forskning og kliniske verktøy for å spore leverens respons under skade og sykdom. Overbevisende nylig in situ analyse av ploidy spectra i menneskelige prøver av hepatocellulært karsinom viser også at kjernefysisk ploidy er dramatisk økt i svulster og er spesielt forsterket i mer aggressive tumor undertyper med redusert differensiering og tap av TP5313. Derfor er det en sterk mulighet for at metodiske fremskritt i kvantitativ vurdering av kjernefysisk ploidi vil bidra til fremtidig prognostisk profilering av leverkreft.
I denne protokollen er en fleksibel høygjennomstrømningsmetodikk for komparativ analyse av muselevervevseksjoner beskrevet, som gir detaljert cytometrisk profilering av hepatocytttall, NPC-responsen og en internt kalibrert metode for å estimere nukleær ploidi (Figur 1). Hepatocytter skiller seg fra NPCer ved hepatocytt kjernefaktor 4 alfa (HNF4α) immunmerking, før karakterisering av kjernefysisk størrelse og kjernefysisk morfotri. "Minimalt DNA-innhold" er estimert for alle sirkulære kjernefysiske masker ved å integrere gjennomsnittlig Hoechst 33342 intensitet (en proxy for DNA-tetthet) med interpolert tredimensjonalt (3D) kjernefysisk volum. Hepatocytt minimalt DNA-innhold kalibreres deretter ved hjelp av NPCer for å generere en kjernefysisk ploidy profil.
Bildeinnhenting, kjernefysisk segmentering og bildeanalyse utføres ved hjelp av bildebehandling med høyt innhold, slik at store områder av todimensjonale (2D) leverseksjoner som inneholder titusenvis av celler, kan screenes. Et spesialskrevet program er gitt for automatisert etterbehandling av høyinnholdsbildeanalysedata for å produsere en prøveomfattende ploidy profil for alle sirkulære hepatocytkjerner. Dette utføres ved hjelp av gratis å laste ned programvare for å beregne kjernefysisk ploidy basert på stereologisk bildeanalyse (SIA)10,11,14,15. SIA-metoden har tidligere blitt validert av flow cytometri som en nøyaktig, om enn arbeidskrevende metode for å estimere hepatocytkjerne kjernefysisk ploidi i leveren14, forutsatt sirkulær kjernefysisk morfologi og et monotont forhold mellom kjernefysisk størrelse og DNA-innhold. I denne protokollen måles begge kjernefysiske parametere ved vurdering av kjernefysisk morfotri og Hoechst 33342-merking. Beregning av "minimalt DNA-innhold" for hver kjernefysiskmaske etterfølges av kalibrering av hepatocytt kjernefysisk ploidi ved hjelp av NPCer, som har et kjent 2-4N DNA-innhold og derfor tjener som en nyttig internkontroll.
Sammenlignet med konvensjonelle flyt cytometri metoder16 tilnærmingen beskrevet gjør hepatocytt kjernefysisk ploidy å bli vurdert in situ og krever ikke tilgang til friskt vev eller disaggregering metoder som kan skjevhet utfall og være vanskelig å standardisere. Som med alle SIA-baserte tilnærminger, er kjernefysiske ploidy underklasser > 2N underrepresentert av 2D-prøvetaking på grunn av snitting av større kjerner utenfor ekvatorialplanet. Den vevsbrede ploidy profilen beskriver også minimum DNA-innhold for alle sirkulære hepatocytt kjernefysiske masker, og diskriminerer ikke direkte mellom mononukleære hepatocytter og to ukukleære celler som har to diskrete ("ikke-rørende") kjerner av samme ploidi. Imidlertid gir enkelheten i denne protokollen betydelig rom for at den kan tilpasses for å ta hensyn til flere parametere som internukleær avstand eller celleperimeteranalyse, som ville lette identifisering av tonukleære celler som gir en mer detaljert vurdering av cellulær ploidi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)</td>
			<td>TestDiet</td>
			<td>1810704</td>
			<td>Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM1850 UV</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>CM1850 UV</td>
			<td>Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statistical software for graphing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IN Cell Analyzer 1000</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td>
			<td></td>
			<td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>630-2864</td>
			<td>Size of 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Speadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Tissue Tek</td>
			<td>Pascual y Furi&#243;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>141451.121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen for immunostaining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>5mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine Microscope Slides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-79380</td>
			<td>Dilution 1:250 (alternative)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6556</td>
			<td>Dilution 1:200 (antibody used in the study)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice

Når leveren er skadet, reduseres hepatocyttallet, mens cellestørrelse, kjernefysisk størrelse og ploidy øker. Utvidelsen av ikke-parenchymale celler som cholangiocytter, myofibroblaster, stamfar er og inflammatoriske celler indikerer også kronisk leverskade, vevsremodellering og sykdomsprogresjon. I denne protokollen beskriver vi en enkel høygjennomstrømningstilnærming for beregning av endringer i leverens cellulære sammensetning som er forbundet med skade, kronisk sykdom og kreft. Vi viser hvordan informasjon hentet fra todimensjonale (2D) vevseksjoner kan brukes til å kvantifisere og kalibrere hepatocytkjerne kjernefysisk ploidy i en prøve og gjøre det mulig for brukeren å finne spesifikke ploidy undergrupper i leveren in situ. Vår metode krever tilgang til fast/frosset levermateriale, grunnleggende immuncytokjemireagenser og en hvilken som helst standard høyinnholdsbildeplattform. Det fungerer som et kraftig alternativ til standard flow cytometri teknikker, som krever forstyrrelse av nysamlet vev, tap av romlig informasjon og potensiell disaggregasjon bias.

Denne metoden har blitt brukt til å måle virkningen av kolestatisk skade på den voksne museleveren ved å mate dyr i 0-21 dager med et hepatotoksisk kosthold som inneholder 0,1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidin (DDC)17. Kronisk DDC fôring resulterer i hepatocellulær skade økt ploidi og periportal utvidelse av NPCer. Brukeren bør være oppmerksom på at musbelastning og aldersavhengige forskjeller kan eksistere i kjernefysisk sokkel og at alle analyse...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

Vi presenterer en robust, kostnadseffektiv og fleksibel metode for måling av endringer i hepatocyttall og kjernefysisk plafode innenfor faste/kryobevarte vevsprøver som ikke krever flytcytometri. Vår tilnærming gir en kraftig prøve-wide signatur av leveren cytologi ideell for å spore utviklingen av leverskade og sykdom.

En høy-gjennomstrømning i Situ metode for estimering av hepatocytt kjernefysisk ploidy i mus

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Denne metoden gjør det mulig for brukeren å generere en profil av hepatocyte kjernefysisk DNA-innhold fra 2D vev seksjoner for studiet av leverutvikling, regenerering, og kronisk sykdom. Denne automatiserte høy gjennomstrømming tilnærming kan brukes på alle 2D levervev seksjoner, gir en internt kalibrert avlesning av kjernefysisk ploidy for alle enkle sirkulære hepatocyte kjerner. Endringer i hepatocyte kjernefysisk ploidy er forbundet med aldring, kronisk leversykdom, og kreft.Denne teknikken gir et enkelt middel til å profilere kjernefysisk ploidy i faste eller kryoreserverte leverprøver. In situ ploidy profilering metoder har betydelig potensial som forskning og kliniske verktøy for å spore leversykdom progresjon som de ikke krever vev desegregering eller tilgang til ferskt materiale. Etter høsting av murine levervevsprøven, legg inn leveren lobule i en optimal skjæretemperatur medium fylt kryomold og umiddelbart plassere formen på tørris for å sikre rask frysing.For å få skiver av den frosne leverflippprøven, del prøven på en seks mikrometertykkelse, og plasser et merket polyamidbelagt lysbilde over hver prøve i fem sekunder for å la hver prøve holde seg til lysbildet. Når alle skivene er samlet inn, la prøvene likevekt i tre til fem minutter ved romtemperatur før immunolabeling. På slutten av likevekten, fest vevsseksjonene i en røykhette med en milliliter 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved romtemperatur.På slutten av fikseringen, skyll lysbildene med tre tre minutters vasker i PBS med mild agitasjon. Etter siste vask, tørk området rundt hver vevseksjon og bruk en hydrofob penn til å tegne en sirkel rundt hver prøve. For å gjennomsyre prøvene, behandle seksjonene med et 0,5% ikke-ionisk overflateaktivt middel i PBS i 15 minutter ved romtemperatur.På slutten av inkubasjonen vask prøvene i tre minutter i PBS to ganger med mild agitasjon som demonstrert før du blokkerer den ikke-spesifikke bindingen med en filtrert løsning på 1% storfe serumalbumen, 5% hesteserum og 0,2% ikke-ionisk overflateaktivt middel i PBS i minst en time ved romtemperatur. Deretter inkubere lysbildene med HHF4-alfa antistoffet fortynnet i blokkerende buffer over natten ved fire grader Celsius i et fuktig fargingskammer beskyttet mot lys. Neste morgen, vask lysbildene fire ganger i PBS med mild agitasjon før inkubasjon med et passende fluorescenskonjugert sekundært antistoff og Hoechst fortynnet i filtrert 1% storfe serum albumen og 0,2% ikke-ionisk overflateaktivt middel i PBS i to timer ved romtemperatur i et fuktig fargekammer beskyttet mot lys.På slutten av inkubasjonen vasker du lysbildene fire ganger som demonstrert, etterfulgt av to tre minutters vasker i dobbelt destillert vann med mild agitasjon. Etter siste vask monterer du prøvene med to dråper fluorescensmonteringsmedium på en dekkslips og legger forsiktig trykk etter behov for å eliminere eventuelle bobler. Kontroller deretter lysbildene ved hjelp av et konvensjonelt fluorescensmikroskop for å sikre god fiksering og immunolabeling.For fluorescens bilde oppkjøp, sett parametrene på en høyinnhold bildeplattform for å skaffe fluorescens bilder ved hjelp av riktig eksitasjon for fluoroforer som brukes. Deretter skanner du prøver for å skaffe tilstrekkelige bilder for å oppnå fullstendig dekning av vevsdelen. På slutten av skanningen justerer du de kjernefysiske segmenteringsparametrene for programvaren for å sikre at kjernene er optimalt segregert og endrer terskelintensiteten for å sikre optimal gating av HNF4-alfa positive hepatocytter og HNF4-alfa negative ikke-parenchymale celler.For kjernefysisk kvantifisering, sett atomområdet i firkantede mikrometer basert på Hoechst-fargingen, den viktigste kjernefysiske Hoechst-intensiteten, atomutnvikkingsfaktoren, den gjennomsnittlige kjernefysiske rundhetsindeksen, HNF4-alfa-statusen og kjernefysiskE X, Y-koordinater basert på tyngdepunktet. For å utføre en hepatocyte kjernefysisk ploidy analyse, først laste ned og installere ploidy kvantifisering analyseprogram. I MATLAB navigerer du til App-fanen på verktøystripen og klikker installer app.Åpne Ploidy Application ML App Install-programmet. Det vises en melding for å bekrefte den vellykkede installasjonen. I hver dataanalysefil, inkludere et ark beanget, Cell Measures, som inneholder alle dataene som kreves for ploidy analyse angitt i kolonner som angitt.For hver eksperimentelle tilstand, gi et kontrolldatasett som skal brukes til å beregne internkontrollen for to til fire N kjernefysisk ploidy kalibrering. For biologiske replikeringer lagrer du hvert regneark i sin egen mappe og gir mappeprefiksene trinnvis navn. Deretter starter du Ploidy-programmet.Ploidy-programmets grafiske brukergrensesnitt vises. Klikk knappen Bane til kontrolldata for å navigere til mappen der kontrolldataene replikeres, befinner seg. Denne databanen vises da i grensesnittet.Skriv inn navnet som skal gis til utdatafilene, i Mappeprefiks. Klikk Knappen Bane til andre data, og naviger til mappen der komparative data replikeres. Denne databanen vises da i grensesnittet.Klikk deretter Kjør. Når analysen er fullført, leser statuslinjen Analyse fullført. Etter immunolabeling er det viktig å sjekke alle lysbildene ved konvensjonell fluorescensmikroskopi for å bekrefte at en god kvalitet fiksering og farging er oppnådd.Smøring eller uskarphet av Hoechst-fargestoffet kan indikere utilstrekkelig fiksering eller prøvenedbrytning før fiksering. Kjernefysisk segregering og HNF4-alfa terskelparametere bør optimaliseres nøye før automatisk bildeanalyse for å reflektere det visuelle mønsteret til immunstaining observert av fluorescensmikroskopi. Etter bildeanalyse bør dataene gjenspeile det økende antallet ikke-parenchymale celler og de små, men signifikante, reduksjonen i HNF4-alfa positive kjerner i leveren med DDC-skade.I friske kontrolllever viser ca. 63 % av HNF4-alfapositive kjerner en enkel sirkulær morphometry. Sammenligning av den relative kjernefysiske knep mellom kontroll og DDC behandlede grupper bør gjenspeile et betydelig tap av 2C og 4C hepatocyte kjerner med skade sammen med økt antall større enn 8C celler. Den relative posisjonsinformasjonen for hver knepundergruppe kan avhøres ved å hente 2D-plasseringen av bestemte hepatocytter-undergrupper i bildeanalyseprogramvaren med høyt innhold.Immunolabeling med flere antistoffer, som Ki-67, kan utføres for å vurdere cellereplikasjon og hepatocytter kjernefysisk morphometry data kan videre avhøres for å kompliment ploidy analyse. Den vevsomfattende ploidyprofilen som genereres av denne metoden, beskriver minimum DNA-innholdet for alle sirkulære hepatocyttkjerner, men diskriminerer ikke mellom mononukleære celler og binukleære hepatocytter. Metoden kan potensielt tilpasses for parametere som celleomkrets, for å lette identifisering av binukleærceller og gi en ekstra avlesning av cellulær ploidy.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

En enkel metode for Mouse Lung Intubasjon

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering av Østrogen-regulerte MicroRNAs i brystkreftceller

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Carotisar infusjoner for farmakokinetiske og farmakodynamiske Analyse av Taxaner i Mus

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Høy gjennomstrømning Karakterisering av voksne stamceller Konstruert for levering av terapeutiske faktorer for nervecellene strategier

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

En forbedret fremgangsmåte for Rapid intubering av trakea hos mus

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Creation of Abdominal Adhesions in Mice

Opprettelse av mage Adheranser i Mus

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

En metode for å kvantifisere Upper Limb Performance i dagliglivet Bruke Akselerometre

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Estimering av Nephron nummer i hele nyrene ved hjelp av acid maserasjon Method

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...