Name: a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo Governo de Mineco espanhol concede bfu2014-58686-P (LAN) e SAF-2017-84708-R (DJB). A LAN foi apoiada pelo prêmio nacional MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 e plan GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) e FMN por uma estudantil regional ValI+D da Generalitat ACIF/2016/020. Rp gostaria de reconhecer o Prof. Ewa K. Paluch para financiamento. Agradecemos à Dra. Alicia Martínez-Romero (serviço citometria da CIPF) pela ajuda com a plataforma IN Cell Analyzer.

Todos os experimentos com animais foram previamente aprovados pelo comitê de ética do CIPF. Os camundongos foram alojados em uma instalação sem patógenos no Centro de Investigação Príncipe Felipe (Valência, Espanha), registrado como um criador de animais experimental, usuário e centro de abastecimento (reg. no. ES 46 250 0001 002) nos regulamentos de bem-estar animal europeus e espanhóis vigentes (RD 53/2013).
1. Colheita de tecidos e preparação da amostra
<p class="jove_content...

<ol>
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Preparative and mathematical protocol.</a> Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).</li><li>Manzano-N&#250;&#241;ez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury.">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214 (2015).</li><li>Baratta, J. 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Uma abordagem de alto teor e alto throughput para a análise da remodelagem de tecidos e estimativa da ploidiiiiiie nuclear hepatocito no fígado de murina é descrita. Uma vez familiarizado com o procedimento, o usuário pode processar, imagem e analisar várias amostras em um período de 3 a 5 dias, gerando grandes conjuntos de dados técíveis que fornecem uma assinatura detalhada da saúde hepática. Dada a simplicidade do método de preparação da amostra, juntamente com o grande número de células e área tecidua...

Hepatócitos no fígado de mamíferos podem sofrer citocinese paralisada para produzir células binucleares, e endoreplicação de DNA para produzir núcleos poliplóides contendo até 16N conteúdo de DNA. Aumento geral da ploididy celular e nuclear durante o desenvolvimento pós-natal, envelhecimento e em resposta a diversos estresses celulares1. O processo de poliploidização é dinâmico e reversível2,embora sua função biológica precisa ainda não esteja clara3. O aumento da ploidia está associado à redução da capacidade proliferativa4, diversidade genética2, adaptação à lesão crônica5 e proteção contra o câncer6. Alterações de ploidy hepatocito ocorrem como resultado de um ritmo circadiano alterado7, e desmame8. Mais notavelmente, o perfil ploidiano do fígado é alterado por lesão e doença9, e evidências convincentes sugerem que alterações específicas de ploidia, como o aumento de núcleos ≥8N ou perda de hepatócitos 2N, fornecem assinaturas úteis para o rastreamento da progressão da doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD)3,10, ou o impacto diferencial das infecções virais11.
Em termos gerais, a lesão hepática e a regeneração estão associadas ao aumento do tamanho das células hepatocitos e da área nuclear12,juntamente com o número global reduzido de hepatócitos, particularmente aqueles com teor de DNA 2N10,11. A lesão parenquimal no fígado também é frequentemente acompanhada pela expansão de células não parenquiais (NPCs), incluindo miofibroblastos estrômicos, células inflamatórias e células progenitoras hepáticas bipotentes. Métodos de alto throughput que fornecem um perfil citológico quantitativo de número de células parênquias e ploidia nuclear, ao mesmo tempo em que contabilizam mudanças nos NPCs, portanto, têm um potencial considerável como pesquisas e ferramentas clínicas para acompanhar a resposta do fígado durante lesões e doenças. Análises recentes convincentes in situ de espectroplóide em amostras humanas de carcinoma hepatocelular também demonstram que a ploidia nuclear é dramaticamente aumentada dentro dos tumores e é especificamente amplificada em subtipos tumorais mais agressivos com diferenciação reduzida e perda de TP5313. Assim, há uma forte possibilidade de que os avanços metodológicos na avaliação quantitativa da ploididia nuclear ajudem no futuro perfil prognóstico do câncer de fígado.
Neste protocolo, descreve-se uma metodologia flexível de alto desempenho para a análise comparativa das seções de tecido hepático do camundongo, que fornece perfis citométricos detalhados de números de hepatócitos, a resposta do NPC e um método previamente calibrado internamente para estimar ploidy nuclear (Figura 1). Os hepatócitos são distinguidos dos NPCs pela imunorotulagem do fator nuclear 4 alfa (HNF4α), antes da caracterização do tamanho nuclear e da morfometria nuclear. "Conteúdo mínimo de DNA" é estimado para todas as máscaras nucleares circulares, integrando a intensidade média de Hoechst 33342 (um proxy para a densidade de DNA) com volume nuclear tridimensional interpolado (3D). O conteúdo mínimo de DNA do hepatócito é então calibrado usando NPCs para gerar um perfil de ploidia nuclear.
Aquisição de imagens, segmentação nuclear e análise de imagens são realizadas por meio de imagens de alto conteúdo, permitindo que grandes áreas de seções hepáticas bidimensionais (2D) contendo dezenas de milhares de células sejam rastreadas. Um programa personalizado é fornecido para o pós-processamento automatizado de dados de análise de imagens de alto conteúdo para produzir um perfil ploidy em toda a amostra para todos os núcleos de hepatócitocircularcircular. Isto é realizado usando software gratuito para baixar software para calcular ploidia nuclear com base na análise de imagem estereológica (SIA)10,11,14,15. A metodologia SIA foi previamente validada pela citometria de fluxo como um método preciso, embora trabalhoso, para estimar ploidiy nuclear hepatocito no fígado14, assumindo morfologia nuclear circular e uma relação monótônica entre tamanho nuclear e conteúdo de DNA. Neste protocolo, ambos os parâmetros nucleares são medidos pela avaliação da mormetria nuclear e da rotulagem Hoechst 33342. O cálculo do "conteúdo mínimo de DNA" para cada máscara nuclear é seguido pela calibração da ploidia nuclear hepatocito usando NPCs, que têm um conteúdo conhecido de DNA 2-4N e, portanto, servem como um controle interno útil.
Em comparação com os métodos convencionais de citometria de fluxo16, a abordagem descrita permite que a ploidiiiiiide nuclear hepatocida seja avaliada in situ e não requer acesso a métodos de tecido fresco ou desagregação que podem influenciar os resultados e ser difíceis de padronizar. Como em todas as abordagens baseadas no SIA, as subclasses ploidiais nucleares >2N são sub-representadas pela amostragem 2D devido à secção de núcleos maiores fora do plano equatorial. O perfil ploidy em todo o tecido também descreve o conteúdo mínimo de DNA para todas as máscaras nucleares hepatocidas circulares, e não discrimina diretamente entre hepatocitos mononucleares e células binucleares que têm dois núcleos discretos ("não tocantes") da mesma ploidy. No entanto, a simplicidade deste protocolo permite um espaço considerável para que ele seja adaptado para responder por parâmetros adicionais, como espaçamento internuclear ou análise de perímetro celular, o que facilitaria a identificação de células binucleares, proporcionando uma avaliação mais detalhada da ploidiia celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)</td>
			<td>TestDiet</td>
			<td>1810704</td>
			<td>Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM1850 UV</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>CM1850 UV</td>
			<td>Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statistical software for graphing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IN Cell Analyzer 1000</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td>
			<td></td>
			<td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>630-2864</td>
			<td>Size of 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Speadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Tissue Tek</td>
			<td>Pascual y Furi&#243;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>141451.121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen for immunostaining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>5mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine Microscope Slides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-79380</td>
			<td>Dilution 1:250 (alternative)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6556</td>
			<td>Dilution 1:200 (antibody used in the study)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice

Quando o fígado está ferido, os números de hepatócitos diminuem, enquanto o tamanho da célula, o tamanho nuclear e a ploidy aumentam. A expansão de células não parenquiais como colangiocytes, miofibroblastos, progenitores e células inflamatórias também indicam danos crônicos no fígado, remodelação tecidual e progressão da doença. Neste protocolo, descrevemos uma abordagem simples de alto throughput para calcular mudanças na composição celular do fígado que estão associadas a lesões, doenças crônicas e câncer. Mostramos como as informações extraídas de seções de tecido bidimensional (2D) podem ser usadas para quantificar e calibrar ploidy nuclear hepatocito dentro de uma amostra e permitir que o usuário localize subconjuntos específicos de ploidy dentro do fígado in situ. Nosso método requer acesso a material hepático fixo/congelado, reagentes básicos de imunocitoquímica e qualquer plataforma de imagem padrão de alto conteúdo. Ele serve como uma poderosa alternativa às técnicas padrão de citometria de fluxo, que requerem interrupção do tecido recém-coletado, perda de informações espaciais e viés de desagregação potencial.

Este método tem sido utilizado para medir o impacto da lesão colestática no fígado de camundongos adultos, alimentando animais por 0-21 dias com uma dieta hepatotóxica contendo 0,1% 3,5-dietoxicarbonilo-1,4-dihidrocollidina (DDC)17. A alimentação crônica de DDC resulta em lesão hepatocelular aumento da ploidia e expansão periportal de NPCs. O usuário deve estar ciente de que a tensão do camundongo e as diferenças dependentes da idade podem existir na p...

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A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

Apresentamos um método robusto, econômico e flexível para medir mudanças no número de hepatócitos e ploidy nuclear em amostras de tecido fixo/criopreservado que não requerem citometria de fluxo. Nossa abordagem fornece uma poderosa assinatura amostral de citologia hepática ideal para rastrear a progressão de lesões hepáticas e doenças.

Um método de alta produtividade in situ para estimação da ploidiii y nuclear hepatocida em camundongos

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Este método permite que o usuário gere um perfil de teor de DNA nuclear hepatocito a partir de seções de tecido 2D para o estudo do desenvolvimento hepático, regeneração e doença crônica. Esta abordagem automatizada de alta produtividade pode ser aplicada a todas as seções de tecido hepático 2D, fornecendo uma leitura internamente calibrada da ploidia nuclear para todos os núcleos de hepatocitos circulares simples. Mudanças na ploidia nuclear hepatocita estão associadas ao envelhecimento, doença hepática crônica e câncer.Esta técnica fornece um meio simples de traçar ploidy nuclear em amostras de fígado fixas ou criopreservadas. Os métodos de criação de perfil no situ ploidy têm um potencial considerável como pesquisas e ferramentas clínicas para rastrear a progressão da doença hepática, pois não requerem desagregação tecidual ou acesso a material fresco. Depois de colher a amostra de tecido hepático murino, incorpore o lobule do fígado em um criomold de temperatura de corte ideal e coloque imediatamente o molde em gelo seco para garantir o congelamento rápido.Para obter fatias da amostra de lobule de fígado congelado, se sectionie a amostra com uma espessura de seis micrômetros, colocando um slide revestido de poliamida rotulado sobre cada amostra por cinco segundos para deixar cada amostra grudar no slide. Quando todas as fatias tiverem sido coletadas, permita que as amostras se equilibrem por três a cinco minutos à temperatura ambiente antes da imunolabelação. No final do equilíbrio, fixar as seções teciduais em um capô de fumaça com um mililitro de 4% de paraformaldeído em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente.No final da fixação, enxágue os slides com três lavagens de três minutos em PBS com agitação suave. Após a última lavagem, seque a área ao redor de cada seção de tecido e use uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo em torno de cada amostra. Para permeabilizar as amostras, trate as seções com um surfactante 0,5% não iônico na PBS por 15 minutos à temperatura ambiente.Ao final da incubação, lave as amostras por três minutos em PBS duas vezes com agitação suave como demonstrado antes de bloquear a ligação não específica com uma solução filtrada de 1%de gêrio bovino, soro de 5% de cavalo e surfactante não iônico de 0,2% na PBS por pelo menos uma hora a temperatura ambiente. Em seguida, incubar os slides com o anticorpo HHF4-alfa diluído no bloqueio de tampão durante a noite a quatro graus Celsius em uma câmara de coloração úmida protegida da luz. Na manhã seguinte, lave os slides quatro vezes na PBS com agitação suave antes da incubação com um anticorpo secundário conjugado fluorescência apropriado e Hoechst diluído em albumen de soro bovino filtrado de 1% e 0,2% surfactante não iônico na PBS por duas horas à temperatura ambiente em uma câmara de coloração úmida protegida da luz.No final da incubação, lave os slides quatro vezes como demonstrado, seguido por duas lavagens de três minutos em água dupla destilada com agitação suave. Após a última lavagem, monte as amostras com duas gotas de fluorescência em um deslizamento de cobertura e aplique pressão suave conforme necessário para eliminar quaisquer bolhas. Em seguida, verifique os slides usando um microscópio de fluorescência convencional para garantir uma boa fixação e imunolabelação.Para aquisição de imagens de fluorescência, defina os parâmetros em uma plataforma de imagem de alto conteúdo para adquirir imagens de fluorescência usando a excitação apropriada para os fluoroforos utilizados. Em seguida, digitalize amostras para adquirir imagens suficientes para obter cobertura completa da seção tecidual. No final da varredura, ajuste os parâmetros de segmentação nuclear do software para garantir que os núcleos sejam bem segregados e modifique a intensidade do limiar para garantir o gating ideal dos hepatócitos positivos HNF4-alfa e células não-parenchímicas HNF4-alfa.Para quantificação nuclear, coloque a área nuclear em micrômetros quadrados com base na coloração de Hoechst, a intensidade principal de Hoechst nuclear, o fator de alongamento nuclear, o índice médio de arredondamento nuclear, o status HNF4-alfa, e as coordenadas nucleares X, Y baseadas no centro de gravidade. Para realizar uma análise de ploidia nuclear hepatocita, primeiro baixe e instale o programa de análise de quantificação ploidy. No MATLAB, navegue até a guia App da faixa de ferramentas e clique em Instalar Aplicativo.Abra o programa de instalação de aplicativos ML do aplicativo Ploidy. Uma mensagem aparecerá para confirmar a instalação bem sucedida. Em cada arquivo de análise de dados, inclua uma folha denominada Medidas Celulares, contendo todos os dados necessários para a análise ploidy estabelecida em colunas conforme indicado.Para cada condição experimental, forneça um conjunto de dados de controle que será usado para calcular o controle interno para a calibração de ploidia nuclear de dois a quatro N. Para réplicas biológicas, armazene cada planilha em sua própria pasta, nomeando os prefixos da pasta incrementalmente. Em seguida, inicie o aplicativo Ploidy.A interface gráfica do usuário do aplicativo Ploidy aparecerá. Clique no botão Caminho para Controlar dados para navegar até a pasta na qual os dados de controle se replicam residem. Esse caminho de dados aparecerá na interface.No Prefixo de pasta, digite o nome a ser dado aos arquivos de saída. Clique no botão Caminho para Outros Dados e navegue até a pasta na qual os dados comparativos se replicam residem. Esse caminho de dados aparecerá na interface.Em seguida, clique em Executar. Quando a análise estiver concluída, a barra de status lerá a análise completa. Após a imunolabelação, é importante verificar todos os slides por microscopia de fluorescência convencional para confirmar que uma boa fixação de qualidade e coloração foi obtida.A mancha ou a desfoque do corante Hoechst podem indicar fixação inadequada ou degradação da amostra antes da fixação. Os parâmetros de segregação nuclear e limiar HNF4-alfa devem ser cuidadosamente otimizados antes da análise automática de imagens para refletir amplamente o padrão visual da imunostaining observada pela microscopia de fluorescência. Após a análise da imagem, os dados devem refletir o número crescente de células não parenchímicas e a pequena, mas significativa, redução dos números de núcleos positivos HNF4-alfa dentro do fígado com lesão DDC.Em fígados de controle saudável, aproximadamente 63% dos núcleos HNF4-alfa positivos exibem uma simples morfometria circular. A comparação da ploidia nuclear relativa entre os grupos tratados de controle e DDC deve refletir uma perda significativa dos núcleos hepatócitos 2C e 4C com lesões, juntamente com o aumento do número de células maiores que 8C. As informações posicionais relativas para cada subgrupo ploidy podem ser interrogadas recuperando a localização 2D de subconjuntos de hepatócitos específicos dentro do software de análise de imagem de alto conteúdo.A imunolabelagem com anticorpos adicionais, como o Ki-67, pode ser realizada para avaliar a replicação celular e os dados de morfometria nuclear hepatócito podem ser interrogados para complementar a análise de ploidy. O perfil de ploidia em todo o tecido gerado por este método descreve o conteúdo mínimo de DNA para todos os núcleos hepatócitos circulares, mas não discrimina entre células mononucleares e hepatócitos binucleares. O método pode potencialmente ser adaptado para explicar parâmetros como perímetro celular, para facilitar a identificação de células binucleares e fornecer uma leitura adicional da ploidia celular.

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