Name: a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

Эта работа была профинансирована испанским правительством MINECO гранты BFU2014-58686-P (LAN) и SAF-2017-84708-R (DJB). LAN была поддержана национальным MINECO Рамон у Cajal стипендий RYC-2012-11700 и план GenT награду (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), и FMN регионального ValI-D студентов Валенсии Generalitat ACIF/2016/020. РП хотела бы отметить профессора Эву К. Палух за финансирование. Мы благодарим д-ра Алисию Мартинес-Ромеро (CIPF Cytometry service) за помощь в платформе IN Cell Analyzer.

Все эксперименты на животных были ранее одобрены комитетом по этике CIPF. Мыши были размещены в центре, свободном от патогенов, в Центре по борьбе с патогенами Пренсипе Фелипе (Валенсия, Испания), зарегистрированных в качестве экспериментального животновода, пользователя и центра снабже?...

<ol>
	<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+in+liver+tissue.">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+polyploidy:+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide?.">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?.</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Restricts+Hepatocyte+Proliferation+and+Liver+Regeneration+in+Mice.">The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice.</a> Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploid+Hepatocytes+Facilitate+Adaptation+and+Regeneration+to+Chronic+Liver+Injury.">Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury.</a> The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver.">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li><li>Chao, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clock+regulates+hepatic+polyploidy+by+modulating+Mkp1-Erk1/2+signaling+pathway.">Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway.</a> Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).</li><li>Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin/Akt+pathway+controls+a+specific+cell+division+program+that+leads+to+generation+of+binucleated+tetraploid+liver+cells+in+rodents.">The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).</li><li>Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+polyploidization+and+its+association+with+pathophysiological+processes.">Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (5), e2805 (2017).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Toyoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+to+hepatocyte+ploidy+and+binuclearity+profiles+during+human+chronic+viral+hepatitis.">Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis.</a> Gut. 54 (2), 297-302 (2005).</li><li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+and+Unconventional+Cell+Division+of+Hepatocytes+Underlie+Liver+Regeneration.">Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration.</a> Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. , (2019).</li><li>Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+determining+ploidy+distributions+in+liver+tissue+by+stereological+analysis+of+nuclear+size+calibrated+by+flow+cytometric+DNA+analysis.">A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis.</a> Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).</li><li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Cell+Polyploidization:+A+Pivotal+Role+for+Binuclear+Hepatocytes.">Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li><li>Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+mouse+hepatocyte+ploidy+-+I.+Preparative+and+mathematical+protocol.">Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol.</a> Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).</li><li>Manzano-N&#250;&#241;ez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury.">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214 (2015).</li><li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+of+normal+mouse+liver:+A+histological,+quantitative+immunocytochemical,+and+fine+structural+analysis.">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li><li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells.">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li><li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hepatocyte+ploidy+levels+with+body+size+and+growth+rate+in+mammals.">Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals.</a> Genome. 44 (3), 350-360 (2001).</li><li>Tanami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+zonation+of+liver+polyploidy.">Dynamic zonation of liver polyploidy.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).</li><li>Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+and+liver+proliferation.">Polyploidy and liver proliferation.</a> Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).</li><li>Uhl&#233;n, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-based+map+of+the+human+proteome.">Tissue-based map of the human proteome.</a> Science. 347 (6220), 1260419 (2015).</li></ol>

Описан высокопосевной, высокопроизводительный подход к анализу ремоделирования тканей и оценке гепатоцитов ядерной флоиди в печени мурин. После того, как пользователь ознакомился с процедурой, пользователь может обрабатывать, изображения и анализировать несколько образцов в течени?...

Гепатоциты в печени млекопитающих могут пройти застопорился цитокинез для производства двухядерных клеток, и ДНК эндорепликации для производства полиплоидных ядер, содержащих до 16N содержание ДНК. Общее количество клеточных и ядерных ploidy увеличивается во время послеродового развития, старения и в ответ на различные клеточные стрессы1. Процесс полиплоидизации динамичный иобратимый 2,хотя его точная биологическая функция остаетсянеясной 3. Повышенная ploidy связана с уменьшенной пролиферативной емкостью4,генетическим разнообразием2,адаптацией к хронической травме5 и защитой от рака6. Гепатоцит ploidy изменения происходят в результате изменения циркадного ритма7, и отляги8. Наиболее примечательно, ploidy профиль печени изменяется травмы и болезни9, и убедительные доказательства свидетельствуют о том, что конкретные изменения ploidy, такие как увеличение 8N ядер или потери 2N гепатоцитов, обеспечивают полезные подписи для отслеживания безалкогольных жировых заболеваний печени (NAFLD) прогрессии3,10, или дифференциального воздействия вирусных инфекций11.
В общих чертах, повреждение печени и регенерации связаны с увеличением размера клеток гепатоцитов и ядерной области12, вместе с сокращением общего числа гепатоцитов, особенно те, с содержанием ДНК 2N10,11. Паранхимальная травма печени также часто сопровождается расширением непаранхимальных клеток (НПК), включая стромальные миофибробласты, воспалительные клетки и бипотентные клетки-прародители печени. Высокопроизводительные методы, которые обеспечивают количественный цитологический профиль parenchymal номер клетки и ядерной ploidy, в то время как также учета изменений в NPCs, поэтому имеют значительный потенциал в качестве научных исследований и клинических инструментов для отслеживания реакции печени во время травмы и болезни. Принуждение последние на месте анализ ploidy спектра в человеческих образцах гепатоцеллюлярной карциномы также показывают, что ядерная плоида резко увеличивается в опухолях и специально усиливается в более агрессивных подтипов опухоли с уменьшенной дифференциацией и потерей TP5313. Таким образом, существует высокая вероятность того, что методологические достижения в количественной оценке ядерной плоиди помогут в будущем прогностическом профилировании рака печени.
В этом протоколе описана гибкая методика высокой пропускной связи для сравнительного анализа секций тканей печени мыши, которая обеспечивает детальное цитометрическое профилирование числа гепатоцитов, ответ NPC и внутренне откалиброванный метод оценки ядерной флоидии(рисунок 1). Гепатоциты отличаются от НПК иммуномаркировкой гепатоцитов 4 альфа (HNF4) до характеристики ядерного размера и ядерной морфометрии. "Минимальное содержание ДНК" оценивается для всех круговых ядерных масок путем интеграции средней интенсивности Hoechst 33342 (прокси для плотности ДНК) с интерполированным трехмерным (3D) ядерным объемом. Гепатоцитминимальное содержание ДНК затем откалибровано с помощью NPC для создания ядерного профиля ploidy.
Приобретение изображений, ядерная сегментация и анализ изображений выполняются с использованием изображений с высоким содержанием, что позволяет обсуливать большие участки двумерных (2D) секций печени, содержащих десятки тысяч клеток. Предусмотрена специально написанная программа для автоматической пост-обработки данных анализа изображений высокого содержания для получения профиля флоиди для всех круговых ядер гепатоцитов. Это выполняется с помощью бесплатного скачать программное обеспечение для расчета ядерной ploidy на основе стерилологического анализа изображений (SIA)10,11,14,15. Методология SIA была ранее подтверждена цитометрией потока как точный, хотя и трудоемкий, метод для оценки гепатоцитов ядерной флоиди и в печени14, предполагая круговую ядерную морфологию и монотоническую связь между ядерным размером и содержанием ДНК. В этом протоколе оба ядерных параметра измеряются путем оценки ядерной морфометрии и маркировки Hoechst 33342. Расчет «минимального содержания ДНК» для каждой ядерной маски сопровождается калибровкой гепатоцитной ядерной флоиды с использованием NPC, которые имеют известное содержание ДНК 2х4N и поэтому служат полезным внутренним контролем.
По сравнению с обычными методами цитометрии потока16 описанный подход позволяет оценивать ядерную флуиду гепатоцитов на месте и не требует доступа к свежим тканям или методам дезагрегирования, которые могут предусмотреть результаты и быть трудно стандартизированными. Как и во всех подходах, основанных на SIA, подклассы ядерных ploidy sgt;2N недопредставлены 2D-выборкой из-за секции больших ядер за пределами экваториальной плоскости. Профиль флоиди по всей ткани также описывает минимальное содержание ДНК для всех круглых гепатоцитов ядерных масок и не проводит прямой различать моноядерные гепатоциты и двухядерные клетки, которые имеют два дискретных ("не прикосновения") ядра одной и той же флоиди. Однако простота этого протокола позволяет адаптировать его к дополнительным параметрам, таким как межядерное расстояние или анализ периметра ячейки, что облегчит идентификацию двухядерных ячеек, обеспечивающих более детальную оценку клеточной плоиды.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)</td>
			<td>TestDiet</td>
			<td>1810704</td>
			<td>Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM1850 UV</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>CM1850 UV</td>
			<td>Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statistical software for graphing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IN Cell Analyzer 1000</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td>
			<td></td>
			<td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>630-2864</td>
			<td>Size of 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Speadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Tissue Tek</td>
			<td>Pascual y Furi&#243;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>141451.121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen for immunostaining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>5mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine Microscope Slides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-79380</td>
			<td>Dilution 1:250 (alternative)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6556</td>
			<td>Dilution 1:200 (antibody used in the study)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice

Когда печень повреждена, число гепатоцитов уменьшается, в то время как размер клеток, ядерный размер и ploidy увеличиваются. Расширение непаренхимальных клеток, таких как холангиоциты, миофибробласты, прародители и воспалительные клетки, также указывает на хроническое повреждение печени, ремоделирование тканей и прогрессирование болезни. В этом протоколе мы описываем простой высокопроизводительный подход к расчету изменений в клеточеском составе печени, связанных с травмами, хроническими заболеваниями и раком. Мы показываем, как информация, извлеченная из двухмерных (2D) разделов ткани может быть использована для количественной оценки и калибровки гепатоцитов ядерной ploidy в образце и позволяют пользователю найти конкретные подмножества ploidy в печени на месте. Наш метод требует доступа к фиксированной/ замороженной печени материал, основные иммуноцитохимии реагентов и любой стандартной высокой содержаниеизображения платформы. Он служит мощной альтернативой стандартным методам цитометрии потока, которые требуют нарушения свежесобранных тканей, потери пространственной информации и потенциальной предвзятости дезагрегирования.

Этот метод был использован для измерения воздействия холестатической травмы на печень взрослой мыши, кормя животных в течение 0-21 дней с гепатотоксическим питанием, содержащим 0,1% 3,5-диэтитоксикарбонил-1,4-дигидроколлайдин (DDC)17. Хроническое кормление DDC при...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

Мы представляем надежный, экономичный и гибкий метод измерения изменений в количестве гепатоцитов и ядерной флоиди в фиксированных/криоконсервированных образцах тканей, которые не требуют цитометрии потока. Наш подход обеспечивает мощную выборку всей подписи цитологии печени идеально подходит для отслеживания прогрессирования травмы печени и болезни.

Высокой пропускной способ в Ситу Метод оценки гепатоцитов ядерной плоиди у мышей

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Этот метод позволяет пользователю генерировать профиль содержания ядерной ДНК гепатоцитов из разделов 2D тканей для изучения развития печени, регенерации и хронических заболеваний. Этот автоматизированный подход высокой пропускной способности может быть применен ко всем 2D разделам тканей печени, обеспечивая внутренне откалиброванное считывание ядерной плоидии для всех простых круглых ядер гепатоцитов. Изменения в ядерном плоидии гепатоцитов связаны со старением, хроническими заболеваниями печени и раком.Этот метод обеспечивает простое средство для профиля ядерной плоидии в фиксированных или криоконсервированных образцов печени. Методы профилирования на месте имеют значительный потенциал в качестве научно-исследовательских и клинических инструментов для отслеживания прогрессирования заболеваний печени, поскольку они не требуют десегрегации тканей или доступа к свежему материалу. После сбора образца ткани печени мурина, вставлять лобулы печени в оптимальной среде резки температуры заполнены криомольда и сразу же поместить плесень на сухой лед, чтобы обеспечить быстрое замораживание.Чтобы получить кусочки образца замороженной лобулы печени, раздел образца на шесть микрометров толщиной, размещение помечены полиамида покрытием слайд над каждым образцом в течение пяти секунд, чтобы каждый образец придерживаться слайда. Когда все ломтики были собраны, позвольте образцам уравночные в течение трех-пяти минут при комнатной температуре до иммунолабеля. В конце эквилибрации зафиксировать секции тканей в дымовой капот с одним миллилитром 4%paraformaldehyde в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.В конце фиксации, промыть слайды с тремя тремя минутами моет в PBS с нежным волнением. После последней стирки высушите область вокруг каждого участка ткани и используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать круг вокруг каждого образца. Чтобы пронизать образцы, обработать разделы с 0,5% неионных сурфактант в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре.В конце инкубации, мыть образцы в течение трех минут в PBS два раза с нежным возбуждением, как попродемонстрировано, прежде чем блокировать неспецифические связывания с фильтрованным раствором 1%бычьей сыворотки альбумена, 5%horse сыворотки, и 0,2% неионных сурфактант в PBS, по крайней мере один час при комнатной температуре. Далее, инкубировать слайды с HHF4-альфа антитела разбавленной в блокировании буфера ночь на четыре градуса по Цельсию во влажной камере окрашивания защищены от света. На следующее утро, мыть слайды четыре раза в PBS с нежным возбуждением перед инкубацией с соответствующей флуоресценции конъюгированных вторичных антител и Hoechst разбавленных в фильтрованных 1%бычьей сыворотки альбумин и 0,2%non-ionic сурфактант в PBS в течение двух часов при комнатной температуре во влажной камере окрашивания защищены от света.В конце инкубации, мыть слайды четыре раза, как попродемонстрировано, а затем две три минуты моет в двойной дистиллированной воды с нежным волнением. После последней стирки, смонтировать образцы с двумя каплями флуоресценции монтажа среды на крышку и применять мягкое давление по мере необходимости, чтобы устранить любые пузырьки. Затем проверьте слайды с помощью обычного микроскопа флуоресценции, чтобы обеспечить хорошую фиксацию и иммунолабелирование.Для приобретения флуоресценции изображения установите параметры на платформе изображений высокого содержания для получения изображений флуоресценции с использованием соответствующего возбуждения для используемых флюорофоров. Затем сканируйте образцы, чтобы получить достаточное количество изображений, чтобы получить полное покрытие секции ткани. В конце сканирования отрегулируйте параметры ядерной сегментации программного обеспечения, чтобы обеспечить оптимальную сегрегацию ядер и модифицировать пороговую интенсивность для обеспечения оптимального отбеливания HNF4-альфа-положительных гепатоцитов и HNF4-альфа отрицательных некаренхимальных клеток.Для ядерной количественной оценки установите ядерную область в квадратных микрометрах на основе окрашивания Хохста, основной интенсивности ядерного Хёхста, ядерного фактора удлинивания, среднего индекса ядерной округлости, статуса HNF4-альфа и ядерных координат X, Y, основанных на центре тяжести. Для выполнения анализа ядерной плоидии гепатоцитов сначала загрузите и установите программу количественного анализа плоиди. В MATLAB перейдите на вкладку App полосы инструмента и нажмите Установите приложение.Откройте программу Установки приложений Ploidy ML. Сообщение будет отображаться, чтобы подтвердить успешную установку. В каждом файле анализа данных, включают лист, указанный, Сотовые меры, содержащие все данные, необходимые для анализа ploidy, установленных в столбцах, как указано.Для каждого экспериментального состояния предоставьте набор данных управления, который будет использоваться для расчета внутреннего контроля для калибровки двух-четырех N ядерных плоидов. Для биологических репликаций храните каждую электронную таблицу в своей папке, постепенно называя префиксы папки. Далее запустите приложение Ploidy.Появится графический пользовательский интерфейс приложения Ploidy. Нажмите кнопку Путь к управлению данными, чтобы перейти к папке, в которой находятся данные управления. Затем этот путь данных появится в интерфейсе.В Folder Prefix ввемите имя, которое будет дано файлу вывода. Нажмите кнопку «Путь к другим данным» и перейдите к папке, в которой находятся сравнительные репликации данных. Затем этот путь данных появится в интерфейсе.Затем нажмите Run. Когда анализ будет завершен, бар «Статус» будет читать анализ завершен. После иммунолабеля важно проверить все слайды с помощью обычной микроскопии флуоресценции, чтобы подтвердить, что была получена фиксация и окрашивание хорошего качества.Размазывание или размытие красителя Hoechst может указывать на неадекватную фиксацию или деградацию образца до фиксации. Ядерная сегрегация и параметры порога HNF4-альфа должны быть тщательно оптимизированы до автоматического анализа изображений, чтобы широко отражать визуальную структуру иммуностимулятора, наблюдаемого с помощью флуоресцентной микроскопии. После анализа изображений, данные должны отражать растущее число не-паренхимальных клеток и небольшое, но значительное, уменьшение числа HNF4-альфа-положительных ядер в печени с травмой DDC.В здоровой печени контроля, примерно 63% HNF4-альфа положительные ядра обладают простой круговой морфометрии. Сравнение относительной ядерной плоидии между контрольными и обработанными группами DDC должно отражать значительную потерю 2C и 4C ядер гепатоцитов с повреждением вместе с увеличением числа клеток более 8C. Относительная позиционная информация для каждой подгруппы ploidy может быть допрошена путем извлечения 2D-места определенных подмножеству гепатоцитов в программном обеспечении для анализа изображений с высоким содержанием.Иммунолабеля с дополнительными антителами, такими как Ki-67, может быть выполнена для оценки репликации клеток и гепатоцитов ядерной морфометрии данные могут быть дополнительно допрошены, чтобы хвалить анализ плоидии. Ткани всей ploidy профиль, порожденный этим методом описывает минимальное содержание ДНК для всех круговых ядер гепатоцитов, но не делает различий между моноядерными клетками и бинуклеарных гепатоцитов. Метод потенциально может быть адаптирован для учета таких параметров, как периметр клеток, для облегчения идентификации бинуклеарных клеток и обеспечения дополнительного считывания клеточной плоидии.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Простой метод Винт Руководство по Внутричерепное ксенотрансплантата Исследования на мышах

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

Простой метод мышь интубации легких

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Профилирование Эстроген-регулируемых микроРНК в клетках рака молочной железы

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Сонной артерии Настои для Фармакокинетические и фармакодинамические анализ Таксаны в мышах

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Высокая пропускная способность Характеристика взрослых стволовых клеток разработан для доставки терапевтических факторов для Нейропротекторное стратегий

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Усовершенствованный метод Rapid интубации трахеи у мышей

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Creation of Abdominal Adhesions in Mice

Создание спаек в брюшной полости у мышей

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

Метод Количественная верхней конечности производительности в повседневной жизни при помощи акселерометров

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Оценка числа нефрона в целом почки использованием кислоты метод мацерации

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...