Name: a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por las subvenciones del Gobierno español de MINECO BFU2014-58686-P (LAN) y SAF-2017-84708-R (DJB). LAN fue apoyada por una beca nacional MINECO Ramón y Cajal RYC-2012-11700 y el premio Plan GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), y FMN por una beca regional ValI+D de la Generalitat Valenciana ACIF/2016/020. RP desea reconocer a la Prof. Ewa K. Paluch por su financiación. Agradecemos a la Dra. Alicia Martínez-Romero (servicio de citometría CIPF) por su ayuda con la plataforma IN Cell Analyzer.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados previamente por el comité de ética del CIPF. Los ratones fueron alojados en una instalación libre de patógenos en el Centro de Investigación Príncipe Felipe (Valencia, España), registrado como criador, usuario y centro de suministro sin patógenos (reg. no. ES 46 250 0001 002) en virtud de la normativa europea y española vigente sobre bienestar animal (RD 53/2013).
1. Cosecha de tejidos y preparación de muestras
<p class="jove_con...

<ol>
	<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+in+liver+tissue.">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+polyploidy:+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide?.">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?.</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Restricts+Hepatocyte+Proliferation+and+Liver+Regeneration+in+Mice.">The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice.</a> Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploid+Hepatocytes+Facilitate+Adaptation+and+Regeneration+to+Chronic+Liver+Injury.">Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury.</a> The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver.">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li><li>Chao, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clock+regulates+hepatic+polyploidy+by+modulating+Mkp1-Erk1/2+signaling+pathway.">Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway.</a> Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).</li><li>Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin/Akt+pathway+controls+a+specific+cell+division+program+that+leads+to+generation+of+binucleated+tetraploid+liver+cells+in+rodents.">The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).</li><li>Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+polyploidization+and+its+association+with+pathophysiological+processes.">Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (5), e2805 (2017).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Toyoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+to+hepatocyte+ploidy+and+binuclearity+profiles+during+human+chronic+viral+hepatitis.">Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis.</a> Gut. 54 (2), 297-302 (2005).</li><li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+and+Unconventional+Cell+Division+of+Hepatocytes+Underlie+Liver+Regeneration.">Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration.</a> Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. , (2019).</li><li>Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+determining+ploidy+distributions+in+liver+tissue+by+stereological+analysis+of+nuclear+size+calibrated+by+flow+cytometric+DNA+analysis.">A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis.</a> Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).</li><li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Cell+Polyploidization:+A+Pivotal+Role+for+Binuclear+Hepatocytes.">Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li><li>Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+mouse+hepatocyte+ploidy+-+I.+Preparative+and+mathematical+protocol.">Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol.</a> Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).</li><li>Manzano-N&#250;&#241;ez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury.">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214 (2015).</li><li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+of+normal+mouse+liver:+A+histological,+quantitative+immunocytochemical,+and+fine+structural+analysis.">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li><li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells.">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li><li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hepatocyte+ploidy+levels+with+body+size+and+growth+rate+in+mammals.">Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals.</a> Genome. 44 (3), 350-360 (2001).</li><li>Tanami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+zonation+of+liver+polyploidy.">Dynamic zonation of liver polyploidy.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).</li><li>Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+and+liver+proliferation.">Polyploidy and liver proliferation.</a> Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).</li><li>Uhl&#233;n, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-based+map+of+the+human+proteome.">Tissue-based map of the human proteome.</a> Science. 347 (6220), 1260419 (2015).</li></ol>

Se describe un enfoque de alto contenido y alto rendimiento para el análisis de la remodelación de tejidos y la estimación de la ploideide nuclear de hepatocitos en el hígado murino. Una vez familiarizado con el procedimiento, un usuario puede procesar, crear imágenes y analizar varias muestras en un período de 3 a 5 días, generando grandes conjuntos de datos comprobables que proporcionan una firma detallada de la salud del hígado. Dada la simplicidad del método de preparación de la muestra, junto con el gran n...

Los hepatocitos en el hígado de los mamíferos pueden someterse a citoquinesis estancada para producir células binucleares, y endoreplicación de ADN para producir núcleos de poliploide que contienen hasta 16N de contenido de ADN. Aumento general de la ploideide celular y nuclear durante el desarrollo postnatal, envejecimiento y en respuesta a diversas tensiones celulares1. El proceso de poliploidización es dinámico y reversible2,aunque su función biológica precisa sigue sin estar clara3. El aumento de la ploideidey se asocia con una capacidad proliferativa reducida4,diversidad genética2,adaptación a la lesión crónica5 y protección contra el cáncer6. Las alteraciones de la estratadia de hepatocitos se producen como resultado de la alteración del ritmo circadiano7,y el destete8. En particular, el perfil de ploide del hígado se ve alterado por la lesión y la enfermedad9, y la evidencia convincente sugiere que cambios específicos de ploidey, tales como aumento de los núcleos 8N o pérdida de hepatocitos 2N, proporcionan firmas útiles para el seguimiento de la progresión delaenfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD)3,10, o el impacto diferencial de las infecciones virales11.
En términos generales, la lesión hepática y la regeneración se asocian con el aumento del tamaño de las células de hepatocitos y el área nuclear12,junto con el número total reducido de hepatocitos, en particular aquellos con contenido de ADN 2N10,11. La lesión parenquimal en el hígado también se acompaña con frecuencia de la expansión de células no parénquimales (NNJ), incluyendo miofibroblastos estromales, células inflamatorias y células progenitoras hepáticas bipotentes. Los métodos de alto rendimiento que proporcionan un perfil citológico cuantitativo del número de células parénquimas y la ploidía nuclear, al tiempo que tienen en cuenta los cambios en los PNJ, tienen por lo tanto un potencial considerable como herramientas clínicas y de investigación para rastrear la respuesta del hígado durante la lesión y la enfermedad. El análisis in situ reciente conmovedor de espectros ploidy en muestras humanas de carcinoma hepatocelular también demuestra que la ploidicia nuclear aumenta dramáticamente dentro de los tumores y se amplifica específicamente en subtipos tumorales más agresivos con diferenciación reducida y pérdida de TP5313. Por lo tanto, existe una fuerte posibilidad de que los avances metodológicos en la evaluación cuantitativa de la ploidía nuclear ayuden en la elaboración de perfiles de pronóstico futuros del cáncer de hígado.
En este protocolo, se describe una metodología flexible de alto rendimiento para el análisis comparativo de secciones de tejido hepático de ratón, que proporciona perfiles citométricos detallados de los números de hepatocitos, la respuesta NPC y un método calibrado internamente para estimar la ploidía nuclear(Figura 1). Los hepatocitos se distinguen de los NNP por el inmunoetiquetado alfa del factor nuclear de hepatocitos 4 (HNF4), antes de la caracterización del tamaño nuclear y la morfometría nuclear. Se estima el "contenido mínimo de ADN" para todas las máscaras nucleares circulares integrando la intensidad media de Hoechst 33342 (un proxy para la densidad de ADN) con volumen nuclear tridimensional interpolado (3D). El contenido mínimo de ADN de los hepatocitos se calibra utilizando PNJ para generar un perfil de ploidy nuclear.
La adquisición de imágenes, la segmentación nuclear y el análisis de imágenes se realizan utilizando imágenes de alto contenido, lo que permite examinar grandes áreas de secciones hepáticas bidimensionales (2D) que contienen decenas de miles de células. Se proporciona un programa escrito a medida para el procesamiento posterior automatizado de datos de análisis de imágenes de alto contenido para producir un perfil de ploidy en toda la muestra para todos los núcleos de hepatocitos circulares. Esto se realiza utilizando software de descarga gratuita para calcular la ploidicia nuclear basada en el análisis de imágenes estereológicas (SIA)10,11,14,15. La metodología SIA ha sido previamente validada por la citometría de flujo como un método preciso, aunque laborioso, para estimar la ploidía nuclear de hepatocitos en el hígado14,asumiendo la morfología nuclear circular y una relación monotónica entre el tamaño nuclear y el contenido de ADN. En este protocolo, ambos parámetros nucleares se miden mediante la evaluación de la morfometría nuclear y el etiquetado Hoechst 33342. El cálculo del "contenido mínimo de ADN" para cada máscara nuclear es seguido por la calibración de la ploideide nuclear de hepatocitos utilizando PNJ, que tienen un contenido de ADN de 2 x 4N conocido y, por lo tanto, sirven como un control interno útil.
En comparación con los métodos convencionales de citometría de flujo16, el enfoque descrito permite evaluar in situ la ploidía nuclear de hepatocitos y no requiere acceso a métodos de tejido fresco o desagregación que puedan sesgar los resultados y ser difíciles de estandarizar. Al igual que con todos los enfoques basados en SIA, las subclases de ploidey nuclear >2N están subrepresentadas por el muestreo 2D debido a la sección de núcleos más grandes fuera del plano ecuatorial. El perfil de ploidy de todo el tejido también describe el contenido mínimo de ADN para todas las máscaras nucleares de hepatocitos circulares, y no discrimina directamente entre los hepatocitos mononucleares y las células binucleares que tienen dos núcleos discretos ("sin tocar") de la misma estratapidia. Sin embargo, la simplicidad de este protocolo permite adaptar un margen considerable para que tenga en cuenta parámetros adicionales como el espaciado internuclear o el análisis perimetral celular, que facilitarían la identificación de células binucleares que proporcionen una evaluación más detallada de la ploideideidería celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)</td>
			<td>TestDiet</td>
			<td>1810704</td>
			<td>Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM1850 UV</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>CM1850 UV</td>
			<td>Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statistical software for graphing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IN Cell Analyzer 1000</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td>
			<td></td>
			<td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>630-2864</td>
			<td>Size of 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Speadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Tissue Tek</td>
			<td>Pascual y Furi&#243;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>141451.121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen for immunostaining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>5mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine Microscope Slides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-79380</td>
			<td>Dilution 1:250 (alternative)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6556</td>
			<td>Dilution 1:200 (antibody used in the study)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice

Cuando el hígado se lesiona, el número de hepatocitos disminuye, mientras que el tamaño de la célula, el tamaño nuclear y la estratada aumentan. La expansión de las células no parénquimales como los colangiocitos, los miofibroblastos, los progenitores y las células inflamatorias también indican daño hepático crónico, remodelación tisular y progresión de la enfermedad. En este protocolo, describimos un enfoque simple de alto rendimiento para calcular los cambios en la composición celular del hígado que están asociados con lesiones, enfermedades crónicas y cáncer. Mostramos cómo la información extraída de las secciones de tejido bidimensional (2D) se puede utilizar para cuantificar y calibrar la ploideide nuclear de hepatocitos dentro de una muestra y permitir al usuario localizar subconjuntos específicos de ploidicia dentro del hígado in situ. Nuestro método requiere acceso a material hepático fijo/congelado, reactivos básicos de inmunocitoquímica y cualquier plataforma de imágenes estándar de alto contenido. Sirve como una poderosa alternativa a las técnicas estándar de citometría de flujo, que requieren la interrupción del tejido recién recolectado, la pérdida de información espacial y el posible sesgo de desagregación.

Este método se ha utilizado para medir el impacto de la lesión colestásica en el hígado de ratón adulto mediante la alimentación de animales durante 0 a 21 días con una dieta hepatotóxica que contiene 0,1% 3,5-dietoxcarbonyl-1,4-dihidrocollidina (DDC)17. La alimentación crónica de DDC produce lesiones hepatocelulares que aumentan la ploimidia y la expansión periportal de los PNJ. El usuario debe ser consciente de que la tensión del ratón y las diferenc...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

Presentamos un método robusto, rentable y flexible para medir los cambios en el número de hepatocitos y la ploidía nuclear dentro de muestras de tejido fijo/crioconservado que no requieren citometría de flujo. Nuestro enfoque proporciona una poderosa firma de citología hepática en toda la muestra ideal para rastrear la progresión de las lesiones y enfermedades hepáticas.

Un método in situ de alto rendimiento para la estimación de la ploideide nuclear de hepatocitos en ratones

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Este método permite al usuario generar un perfil de contenido de ADN nuclear de hepatocitos a partir de secciones de tejido 2D para el estudio del desarrollo hepático, regeneración y enfermedad crónica. Este enfoque automatizado de alto rendimiento se puede aplicar a todas las secciones de tejido hepático 2D, proporcionando una lectura calibrada internamente de la ploidía nuclear para todos los núcleos circulares simples de hepatocitos. Los cambios en la ploidía nuclear de hepatocitos se asocian con el envejecimiento, enfermedad hepática crónica y cáncer.Esta técnica proporciona un medio simple para perfilar la ploidía nuclear en especímenes hepáticos fijos o crioconservados. Los métodos de perfilado de ploidy in situ tienen un potencial considerable como herramientas de investigación y clínicas para rastrear la progresión de la enfermedad hepática, ya que no requieren dessegregación de tejido ni acceso a material fresco. Después de cosechar la muestra de tejido hepático murino, incruste el lóbulo hepático en un medio de temperatura de corte óptimo lleno de criomodo e inmediatamente coloque el molde en hielo seco para asegurar una congelación rápida.Para obtener rebanadas de la muestra de lóbulo hepático congelado, se sectione la muestra con un grosor de seis micrómetros, colocando una diapositiva recubierta de poliamida etiquetada sobre cada muestra durante cinco segundos para dejar que cada muestra se pegue a la diapositiva. Cuando se hayan recogido todas las rodajas, deje que las muestras se equilibren durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente antes del inmunoetiquetado. Al final del equilibrio, fijar las secciones del tejido en una campana de humo con un mililitro de 4%paraformaldehído en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.Al final de la fijación, enjuague los portaobjetos con tres lavados de tres minutos en PBS con agitación suave. Después del último lavado, seque el área alrededor de cada sección de tejido y use una pluma hidrófoba para dibujar un círculo alrededor de cada muestra. Para permeabilizar las muestras, trate las secciones con un tensioactivo no iónico del 0,5% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.Al final de la incubación, lave las muestras durante tres minutos en PBS dos veces con agitación suave como se ha demostrado antes de bloquear la unión no específica con una solución filtrada de 1%albúmina sérica bovina, 5% de suero de caballo y 0,2% tensioactivo no iónico en PBS durante al menos una hora a temperatura ambiente. A continuación, incubar los portaobjetos con el anticuerpo HHF4-alfa diluido en tampón de bloqueo durante la noche a cuatro grados centígrados en una cámara de tinción húmeda protegida de la luz. A la mañana siguiente, lave los portaobjetos cuatro veces en PBS con agitación suave antes de la incubación con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia adecuado y Hoechst diluido en albúmina sérica 1%bovina filtrada y 0.2%surfactante no iónico en PBS durante dos horas a temperatura ambiente en una cámara de tinción húmeda protegida de la luz.Al final de la incubación, lave los portaobjetos cuatro veces como se ha demostrado, seguido de dos lavados de tres minutos en agua doble destilada con agitación suave. Después del último lavado, monte las muestras con dos gotas de medio de montaje de fluorescencia en un cubreobjetos y aplique una presión suave según sea necesario para eliminar cualquier burbuja. A continuación, compruebe las diapositivas con un microscopio de fluorescencia convencional para garantizar una buena fijación e inmunoetiquetado.Para la adquisición de imágenes de fluorescencia, establezca los parámetros en una plataforma de imágenes de alto contenido para adquirir imágenes de fluorescencia utilizando la excitación adecuada para los fluoróforos utilizados. A continuación, escanee muestras para adquirir imágenes suficientes para obtener una cobertura completa de la sección del tejido. Al final de la exploración, ajuste los parámetros de segmentación nuclear del software para asegurarse de que los núcleos están perfectamente segregados y modifique la intensidad del umbral para garantizar una gama óptima de los hepatocitos positivos HNF4-alfa y las células no parénquimales HNF4-alfa negativas.Para la cuantificación nuclear, establezca el área nuclear en micrómetros cuadrados sobre la base de la tinción Hoechst, la principal intensidad nuclear de Hoechst, el factor de alargamiento nuclear, el índice medio de redondez nuclear, el estado HNF4-alfa y las coordenadas nucleares X, Y basadas en el centro de gravedad. Para realizar un análisis de ploidía nuclear de hepatocitos, primero descargue e instale el programa de análisis de cuantificación de ploidy. En MATLAB, vaya a la pestaña Aplicación de la tira de herramientas y haga clic en Instalar aplicación.Abra el programa de instalación de la aplicación de ML de la aplicación Ploidy. Aparecerá un mensaje para confirmar la instalación correcta. En cada archivo de análisis de datos, incluya una hoja con el nombre de Medidas de celda, que contenga todos los datos necesarios para el análisis de ploidy establecidos en columnas como se indica.Para cada condición experimental, proporcione un conjunto de datos de control que se utilizará para calcular el control interno para dos a cuatro calibraciones de ploidey nuclear N. Para réplicas biológicas, almacene cada hoja de cálculo en su propia carpeta, nombrando los prefijos de carpeta de forma incremental. A continuación, inicie la aplicación Ploidy.Aparecerá la interfaz gráfica de usuario de la aplicación Ploidy. Haga clic en el botón Ruta de acceso a datos de control para navegar a la carpeta en la que residen las réplicas de datos de control. Esta ruta de datos aparecerá en la interfaz.En Prefijo de carpeta, escriba el nombre que se va a asignar a los archivos de salida. Haga clic en el botón Ruta a otros datos y vaya a la carpeta en la que residen las réplicas de datos comparativos. Esta ruta de datos aparecerá en la interfaz.A continuación, haga clic en Ejecutar. Una vez completado el análisis, la barra de estado leerá Análisis completado. Después del inmunoetiquetado, es importante comprobar todos los portaobjetos mediante microscopía de fluorescencia convencional para confirmar que se ha obtenido una fijación y tinción de buena calidad.El frotis o el desenfoque del tinte Hoechst puede indicar una fijación inadecuada o degradación de la muestra antes de la fijación. La segregación nuclear y los parámetros del umbral HNF4-alfa deben optimizarse cuidadosamente antes del análisis automático de imágenes para reflejar ampliamente el patrón visual de la inmunosumanidad observada por la microscopía de fluorescencia. Después del análisis de la imagen, los datos deben reflejar el creciente número de células no parénquimas y la pequeña, pero significativa, reducción en los números de núcleos positivos HNF4-alfa dentro del hígado con lesión DDC.En hígados de control sano, aproximadamente el 63% de los núcleos positivos HNF4-alfa exhiben una morfometría circular simple. La comparación de la ploidy nuclear relativa entre los grupos de control y los grupos tratados con DDC debe reflejar una pérdida significativa de núcleos de hepatocitos 2C y 4C con lesiones junto con un aumento del número de células superiores a 8C. La información posicional relativa de cada subgrupo de ploidy se puede interrogar recuperando la ubicación 2D de subconjuntos de hepatocitos particulares dentro del software de análisis de imágenes de alto contenido.El inmunoetiquetado con anticuerpos adicionales, como Ki-67, se puede realizar para evaluar la replicación celular y los datos de morfometría nuclear de hepatocitos se pueden interrogar aún más para complementar el análisis de la ploidey. El perfil de ploidy de todo el tejido generado por este método describe el contenido mínimo de ADN para todos los núcleos de hepatocitos circulares, pero no discrimina entre las células mononucleares y los hepatocitos binucleares. El método puede adaptarse potencialmente para tener en cuenta parámetros como el perímetro de la célula, para facilitar la identificación de las células binuclears y proporcionar una lectura adicional de la ploidy celular.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Una guía sencilla Método de tornillo para intracraneal Estudios xenoinjerto en ratones

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Investigación

Medicina

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

Un sencillo método de intubación ratón de pulmón

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Perfiles de microARN regulados por estrógeno en las células del cáncer de mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Infusiones de la arteria carótida para farmacocinéticas y farmacodinámicas Análisis de taxanos en ratones

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Alto rendimiento caracterización de células madre adultas de ingeniería para la entrega de los factores terapéuticos de estrategias neuroprotectoras

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Un método mejorado para la rápida intubación de la tráquea en ratones

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Creation of Abdominal Adhesions in Mice

Creación de abdominales adherencias en ratones

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

Un método para cuantificar Rendimiento de las extremidades superiores en la Vida Diaria El uso de acelerómetros

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Estimación del número de Nefrona en riñón entera utilizando el método de maceración ácida

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...