Name: a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

Detta arbete finansierades av den spanska MINECO regeringens bidrag BFU2014-58686-P (LAN) och SAF-2017-84708-R (DJB). LAN stöddes av en nationell MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 och Plan GenT award (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) och FMN av ett regionalt ValI+D studentskap i Valencias Generalitat ACIF/2016/020. RP vill tacka professor Ewa K. Paluch för finansiering. Vi tackar Dr Alicia Martínez-Romero (CIPF Cytometri tjänst) för hjälp med IN Cell Analyzer plattform.

Alla djurförsök godkändes tidigare av CIPF:s etikkommitté. Möss var inrymt i en patogenfri anläggning vid Centro de Investigación Príncipe Felipe (Valencia, Spanien), registrerad som försöksdjur uppfödare, användare och leveranscentrum (reg. nr. ES 46 250 0001 002) enligt gällande tillämpliga europeiska och spanska djurskyddsbestämmelser (RD 53/2013).
1. Vävnadsskörd och provberedning
OBS: Detta protokoll beskriver hur man fryser vävnad utan föregå...

<ol>
	<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+in+liver+tissue.">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+polyploidy:+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide?.">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?.</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Restricts+Hepatocyte+Proliferation+and+Liver+Regeneration+in+Mice.">The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice.</a> Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploid+Hepatocytes+Facilitate+Adaptation+and+Regeneration+to+Chronic+Liver+Injury.">Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury.</a> The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver.">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li><li>Chao, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clock+regulates+hepatic+polyploidy+by+modulating+Mkp1-Erk1/2+signaling+pathway.">Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway.</a> Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).</li><li>Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin/Akt+pathway+controls+a+specific+cell+division+program+that+leads+to+generation+of+binucleated+tetraploid+liver+cells+in+rodents.">The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).</li><li>Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+polyploidization+and+its+association+with+pathophysiological+processes.">Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (5), e2805 (2017).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Toyoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+to+hepatocyte+ploidy+and+binuclearity+profiles+during+human+chronic+viral+hepatitis.">Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis.</a> Gut. 54 (2), 297-302 (2005).</li><li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+and+Unconventional+Cell+Division+of+Hepatocytes+Underlie+Liver+Regeneration.">Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration.</a> Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. , (2019).</li><li>Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+determining+ploidy+distributions+in+liver+tissue+by+stereological+analysis+of+nuclear+size+calibrated+by+flow+cytometric+DNA+analysis.">A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis.</a> Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).</li><li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Cell+Polyploidization:+A+Pivotal+Role+for+Binuclear+Hepatocytes.">Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li><li>Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+mouse+hepatocyte+ploidy+-+I.+Preparative+and+mathematical+protocol.">Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol.</a> Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).</li><li>Manzano-N&#250;&#241;ez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury.">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214 (2015).</li><li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+of+normal+mouse+liver:+A+histological,+quantitative+immunocytochemical,+and+fine+structural+analysis.">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li><li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells.">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li><li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hepatocyte+ploidy+levels+with+body+size+and+growth+rate+in+mammals.">Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals.</a> Genome. 44 (3), 350-360 (2001).</li><li>Tanami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+zonation+of+liver+polyploidy.">Dynamic zonation of liver polyploidy.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).</li><li>Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+and+liver+proliferation.">Polyploidy and liver proliferation.</a> Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).</li><li>Uhl&#233;n, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-based+map+of+the+human+proteome.">Tissue-based map of the human proteome.</a> Science. 347 (6220), 1260419 (2015).</li></ol>

En hög-innehåll, hög genomströmning strategi för analys av vävnad ombyggnad och uppskattning av hepatocyte nukleära ploidy i murine levern beskrivs. När en användare är bekant med proceduren kan han eller hon bearbeta, avbilda och analysera flera exempel under en 3–5-dagarsperiod, vilket genererar stora testbara datauppsättningar som ger en detaljerad signatur av leverhälsa. Med tanke på att provberedningsmetoden är enkel, tillsammans med det stora antalet analyserade celler och vävnadsyta (i genomsnitt ...

Hepatocyter i däggdjurlever kan genomgå avstannad cytokinesi att producera binuclear celler, och DNA endoreplication att producera polyploida kärnor som innehåller upp till 16N DNA-innehåll. Övergripande cellulära och nukleära knep ökar under postnatal utveckling, åldrande och som svar på olika cellulära påfrestningar1. Processen för polyploidatisering är dynamisk och reversibel2, även om dess exakta biologiska funktion är fortfarandeoklart 3. Ökad knep är associerad med minskad proliferative kapacitet4, genetisk mångfald2, anpassning till kronisk skada5 och cancer skydd6. Hepatocyte ploidy förändringar sker som ett resultat av förändrad dygnsrytm7, och avvänjning8. Framför allt, ploidy profilen av levern ändras av skada och sjukdom9, och övertygande bevis tyder på att specifika knep förändringar, såsom ökad ≥8N atomkärnor eller förlust av 2N hepatocyter, ger användbara signaturer för att spåra alkoholfria fettlever (NAFLD) progression3,,10, eller den differentiella effekten av virusinfektioner11.
Generellt sett är leverskada och regenerering förknippade med ökad hepatocyte cellstorlek och kärnområde12, tillsammans med minskat totalt antal hepatocyter, särskilt de med 2N DNA-halt10,11. Parenchymal skada i levern är också ofta åtföljs av expansion av icke-parenkymala celler (NPC), inklusive stromal myofibroblasts, inflammatoriska celler och bipotenta lever stamgenitor celler. Metoder med hög genomströmning som ger en kvantitativ cytologisk profil av parenkymalt cellnummer och kärnsken, samtidigt som de också står för förändringar i NPC,har därför stor potential som forskning och kliniska verktyg för att spåra leverns svar under skada och sjukdom. Övertygande senaste in situ analys av ploidy spektra i mänskliga prover av hanpatocellular carcinom visar också att nukleära knep är dramatiskt ökat inom tumörer och förstärks specifikt i mer aggressiva tumör subtyper med minskad differentiering och förlust av TP5313. Därför finns det en stor möjlighet att metodologiska framsteg i kvantitativ bedömning av nukleära knep kommer att bidra till framtida prognostisk profilering av levercancer.
I detta protokoll beskrivs en flexibel hög genomströmningsmetodik för jämförande analys av muslevvävnadssektioner, som ger detaljerad cytometrisk profilering av hepatocytenummer, NPC-svaret och en internt kalibrerad metod för att uppskatta kärntrick (figur 1). Hepatocyter skiljer sig från NPC genom hepatocyte nukleära faktor 4 alfa (HNF4α) immunmärkning, före karakterisering av nukleärstorlek och nukleära morfomi. "Minimal DNA-innehåll" uppskattas för alla cirkulära kärnmasker genom att integrera medelvärdet Hoechst 33342 intensitet (en proxy för DNA-densitet) med interpolerad tredimensionell (3D) kärnvolym. Hepatocyte minimal DNA-innehåll kalibreras sedan med hjälp av NPC för att generera en nukleär ploidy profil.
Bildinsamling, kärnsegmentering och bildanalys utförs med höginnehållsavbildning, vilket gör att stora områden med tvådimensionella (2D) leversektioner som innehåller tiotusentals celler kan kontrolleras. Ett specialskrivet program tillhandahålls för automatiserad efterbehandling av höginnehållsbildanalysdata för att producera en provomfattande ploidyprofil för alla cirkulära hepatocytekärnor. Detta utförs med hjälp av gratis för att ladda ner programvara för att beräkna nukleära knep baserat på stereological bildanalys (SIA)10,11,14,15. SIA-metoden har tidigare validerats av flödescytometri som en korrekt, om än mödosam, metod för att uppskatta hepatocyte nukleära knep i levern14, förutsatt cirkulär nukleär morfologi och ett monotont förhållande mellan nukleär storlek och DNA-innehåll. I detta protokoll mäts båda nukleära parametrar genom bedömning av kärnmorometri och Hoechst 33342-märkning. Beräkning av "minimal DNA-innehåll" för varje kärnmask följs av kalibrering av hepatocytkärnacom med hjälp av NPC, som har en känd 2−4N DNA-innehåll och därför fungerar som en användbar intern kontroll.
Jämfört med konventionella flöde cytometri metoder16 den metod som beskrivs gör hepatocyte nukleära knep som skall bedömas på plats och kräver inte tillgång till färsk vävnad eller disaggregering metoder som kan bias resultat och vara svårt att standardisera. Som med alla SIA-baserade metoder är underklasser av kärnlexi >2N underrepresenterade genom 2D-provtagning på grund av snittning av större kärnor utanför ekvatorialplanet. Den vävnadsomfattande ploidyprofilen beskriver också det lägsta DNA-innehållet för alla cirkulära hepatocytekärnmasker och diskriminerar inte direkt mellan mononukleära hepatocyter och binukleära celler som har två diskreta (icke-rörande) kärnor av samma knep. Enkelheten i detta protokoll ger dock stort utrymme för att anpassas för att ta hänsyn till ytterligare parametrar såsom internukleära avstånd eller cell perimeteranalys, som skulle underlätta identifiering av binukleära celler som ger en mer detaljerad bedömning av cellulära knep.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)</td>
			<td>TestDiet</td>
			<td>1810704</td>
			<td>Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM1850 UV</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>CM1850 UV</td>
			<td>Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statistical software for graphing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IN Cell Analyzer 1000</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td>
			<td></td>
			<td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>630-2864</td>
			<td>Size of 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Speadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Tissue Tek</td>
			<td>Pascual y Furi&#243;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>141451.121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen for immunostaining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>5mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine Microscope Slides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-79380</td>
			<td>Dilution 1:250 (alternative)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6556</td>
			<td>Dilution 1:200 (antibody used in the study)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice

När levern är skadad, hepatocyte tal minskar, medan cellstorlek, nukleärstorlek och ploidy ökar. Expansionen av icke-parenkymala celler såsom cholangiocytes, myofibroblasts, stamfader och inflammatoriska celler indikerar också kronisk leverskada, vävnad remodeling och sjukdomsprogression. I detta protokoll beskriver vi en enkel hög genomströmning metod för att beräkna förändringar i den cellulära sammansättningen av levern som är associerade med skada, kronisk sjukdom och cancer. Vi visar hur information som extraheras från tvådimensionella (2D) vävnad sektioner kan användas för att kvantifiera och kalibrera hepatocyte nukleära knep inom ett prov och göra det möjligt för användaren att lokalisera specifika ploidy delmängder inom levern på plats. Vår metod kräver tillgång till fast/fryst levermaterial, grundläggande immunocytokemireagenser och alla vanliga högkvalitativa bildplattform. Det fungerar som ett kraftfullt alternativ till standard flöde cytometri tekniker, som kräver störningar av nysamlad vävnad, förlust av rumslig information och potentiella uppdelning bias.

Denna metod har använts för att mäta effekten av kolestatisk skada på den vuxna muslevern genom att mata djur i 0−21 dagar med en hepatotoxisk diet som innehåller 0,1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidin (DDC)17. Kronisk DDC utfodring resulterar i hepatocellular skada ökad ploidy och periportal expansion av NPC. Användaren bör vara medveten om att musstam och åldersberoende skillnader kan förekomma i kärnknöjighet och att alla analyser har utför...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

Vi presenterar en robust, kostnadseffektiv och flexibel metod för att mäta förändringar i hepatocyte nummer och nukleära ploidy inom fasta / kryoreserverade vävnadsprover som inte kräver flöde cytometri. Vår metod ger en kraftfull provomfattande signatur av lever cytologi perfekt för att spåra utvecklingen av leverskada och sjukdom.

En hög genomströmning in Situ metod för uppskattning av Hepatocyte Nuclear Ploidy hos möss

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Denna metod gör det möjligt för användaren att generera en profil av hepatocyte kärn-DNA-innehåll från 2D vävnad sektioner för studie av leverutveckling, regenerering, och kronisk sjukdom. Denna automatiserade hög genomströmning strategi kan tillämpas på alla 2D lever vävnad sektioner, vilket ger en internt kalibrerad avläsning av nukleära ploidy för alla enkla cirkulär hepatocyte kärnor. Förändringar i hepatocyte nukleära ploidy är associerade med åldrande, kronisk leversjukdom, och cancer.Denna teknik ger ett enkelt sätt att profilera nukleära ploidy i fasta eller cryopreserved lever exemplar. In situ ploidy profilering metoder har stor potential som forskning och kliniska verktyg för att spåra leversjukdom progression eftersom de inte kräver vävnad desegregation eller tillgång till färskt material. Efter skörden av murin levervävnad prov, bädda in levern lobule i en optimal skärtemperatur medelstora fyllda cryomold och omedelbart placera formen på torris för att säkerställa snabb frysning.För att få skivor av det frysta leverlobuleprovet, dela upp provet på en sex mikrometertjocklek, placera en märkt polyamidbelagd bild över varje prov i fem sekunder för att låta varje prov fastna på bilden. När alla skivor har samlats in, låt proverna ekvilo i tre till fem minuter vid rumstemperatur före immunolabeling. Vid slutet av jämvikten, fixera vävnadssektionerna i en draghuv med en milliliter på 4%paraformaldehyd i PBS i 10 minuter vid rumstemperatur.Vid slutet av fixeringen sköljer du objektglasen med tre tre minuters tvättar i PBS med mild agitation. Efter den sista tvätten, torka området runt varje vävnad avsnitt och använda en hydrofoba penna för att rita en cirkel runt varje prov. För att permeabilisera proverna, behandla sektionerna med ett 0,5%icke-joniskt ytaktiva medel i PBS i 15 minuter vid rumstemperatur.Vid inkubationens tvätta proverna i tre minuter i PBS två gånger med mild agitation som visats innan den icke-specifika bindningen blockeras med en filtrerad lösning av 1%bovint serumalbumen, 5%hästserum och 0,2%icke-joniskt ytaktiva medel i PBS i minst en timme vid rumstemperatur. Därefter inkubera bilderna med HHF4-alfa antikroppen utspädd i blockerande buffert över natten vid fyra grader Celsius i en fuktig färgningskammare skyddad från ljus. Nästa morgon, tvätta diabilderna fyra gånger i PBS med mild agitation före inkubation med en lämplig fluorescens konjugerad sekundär antikropp och Hoechst utspädd i filtrerad 1%bovint serumalbumen och 0,2%icke-joniska tensid i PBS i två timmar vid rumstemperatur i en fuktig färgningskammare skyddad från ljus.Vid slutet av inkubationen tvättar du rutschkanorna fyra gånger som det visats, följt av två tre minuters tvättar i dubbeldestillerat vatten med mild agitation. Efter den sista tvätten, montera proverna med två droppar fluorescens monteringsmedium på en coverslip och applicerar försiktigt tryck efter behov för att eliminera eventuella bubblor. Kontrollera sedan bilderna med hjälp av ett konventionellt fluorescensmikroskop för att säkerställa god fixering och immunolabeling.För fluorescens bild förvärv, ställa in parametrarna på en hög halt bildplattform att förvärva fluorescens bilder med hjälp av lämplig excitation för fluoroforer som används. Sedan skanna prover för att förvärva tillräckliga bilder för att få fullständig täckning av vävnadssektionen. I slutet av skanningen, justera de nukleära segmentering parametrar av programvaran för att säkerställa att atomkärnorna är optimalt segregerade och ändra tröskel intensitet för att säkerställa optimal gating av de HNF4-alfa positiva hepatocyter och HNF4-alfa negativa icke-parenkymala celler.För kärnkalkning, ställ in kärnområdet i kvadratiska mikrometer baserat på Hoechst-färgningen, den huvudsakliga kärn- Hoechst-intensiteten, kärn- töjningsfaktorn, det kärn- roundnessindexet för medel, HNF4-alfa- status, och det kärn- X, Y-koordinater som baseras på centrera av gravitation. För att utföra en hepatocyte kärnknipidy analys, först ladda ner och installera ploidy kvantifiering analysprogram. I MATLAB navigerar du till fliken App på verktygsremsan och klickar på Installera app.Öppna programmet Ploidy Application ML App Install. Ett meddelande kommer att visas för att bekräfta den lyckade installationen. I varje dataanalysfil, inkludera ett blad som kallas, Cell Measures, som innehåller alla de data som krävs för den ploidyanalys som anges i kolumner enligt vad som anges.För varje experimentellt tillstånd, ge en kontroll datauppsättning som kommer att användas för att beräkna den interna kontrollen för två till fyra N kärn-ploidy kalibrering. För biologiska replikat, lagra varje kalkylblad i sin egen mapp, namnge mappen prefix stegvis. Därefter starta Ploidy ansökan.Det grafiska användargränssnittet ploidy-programmet kommer att visas. Klicka på knappen Sökväg till kontrolldata för att navigera till den mapp där kontrolldatareplikterna finns. Denna datasökväg kommer då att visas i gränssnittet.I Mappprefix skriver du det namn som ska ges till utdatafilerna. Klicka på knappen Sökväg till andra data och navigera till den mapp där de jämförande datareplikterna finns. Denna datasökväg kommer då att visas i gränssnittet.Klicka sedan på Kör. När analysen är klar kommer Statusfältet att läsa Analys komplett. Efter immunolabeling är det viktigt att kontrollera alla av glidbanorna genom konventionell fluorescensmikroskopi för att bekräfta att en god kvalitet fixering och färgning har erhållits.Utstryk eller oskärpa av Hoechst-färgämnet kan tyda på otillräcklig fixering eller provnedbrytning före fixering. Kärnsegregation och HNF4-alpha tröskelvärde parametrar bör noggrant optimeras före automatisk bildanalys att i stort sett återspegla det visuella mönstret av immunfärgning observerats av fluorescens mikroskopi. Efter bildanalys bör data återspegla det ökande antalet icke-parenkymala celler och de små, men signifikanta, minskning av HNF4-alfa positiva atomkärnor nummer inom levern med DDC skada.I friska kontroll lever, cirka 63%av HNF4-alpha positiva atomkärnor uppvisar en enkel cirkulär morphometry. Jämförelse av den relativa nukleära ploidy mellan kontroll och DDC behandlade grupper bör återspegla en betydande förlust av 2C och 4C hepatocyte atomkärnor med skada tillsammans med ökat antal större än 8C celler. Den relativa positionella informationen för varje ploidy undergrupp kan förhöras genom att hämta 2D-platsen för särskilda hepatocyte delmängder inom hög innehåll bildanalys programvara.Immunolabeling med ytterligare antikroppar, såsom Ki-67, kan utföras för att bedöma cell replikation och hepatocyte nukleära morphometry data kan ytterligare förhöras för att komplettera ploidy analysen. Den vävnadsomfattande ploidyprofil som genereras med denna metod beskriver den lägsta DNA-halten för alla cirkulära hepatocytekärnor, men diskriminerar inte mellan mononukleära celler och binukleära hepatocyter. Metoden kan potentiellt anpassas för att redovisa parametrar som cellperimeter, för att underlätta identifiering av binukleära celler och ge en ytterligare avläsning av cellulär ploidy.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

En enkel guide Skruv Metod för Intrakraniell xenograft studier på möss

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

En enkel metod för mus Lung Intubation

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering av östrogenreglerade MicroRNAs i bröstcancerceller

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halspulsådern Tinkturer för farmakokinetiska och farmakodynamiska Analys av taxaner i möss

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Hög genomströmning karakterisering av vuxna stamceller Engineered för leverans av terapeutiska faktorer för Nervskyddande Strategier

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

En förbättrad metod för Rapid Intubation av luftstrupen hos möss

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Creation of Abdominal Adhesions in Mice

Skapande av buken adhesioner hos möss

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

En metod för att kvantifiera Upper Limb Performance i det dagliga livet som använder accelerometrar

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Uppskattning av Nephron antal i hela njuren med hjälp av Acid maceration metod

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...