Name: a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

Bu çalışma İspanyol MINECO Hükümeti tarafından finanse edilmiştir BFU2014-58686-P (LAN) ve SAF-2017-84708-R (DJB). LAN ulusal MINECO Ramón y Cajal Bursu RYC-2012-11700 ve Plan GenT ödülü (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) ve FMN tarafından Valencian Generalitat ACIF/2016/020 bölgesel ValI +D öğrenciliği tarafından desteklendi. RP, Prof. Ewa K. Paluch'a fon için teşekkür etmek istiyorum. Biz IN Hücre Analizörü platformu ile yardım için Dr Alicia Martínez-Romero (CIPF Sitometri hizmeti) teşekkür ederiz.

Tüm hayvan deneyleri daha önce CIPF etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Fareler Centro de Investigación Príncipe Felipe'de (Valencia, İspanya) patojensiz bir tesiste, deneysel bir hayvan yetiştiricisi, kullanıcı ve tedarik merkezi olarak kayıtlı (reg. no. ES 46 250 0001 002) geçerli Avrupa ve İspanyol hayvan refahı düzenlemeleri (RD 53/2013) uyarınca.
1. Doku hasadı ve numune hazırlama
NOT: Bu protokol, önceden fiksasyon veya kriyopreservatio...

<ol>
	<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidization+in+liver+tissue.">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li><li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation.">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+polyploidy:+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide?.">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?.</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Restricts+Hepatocyte+Proliferation+and+Liver+Regeneration+in+Mice.">The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice.</a> Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).</li><li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploid+Hepatocytes+Facilitate+Adaptation+and+Regeneration+to+Chronic+Liver+Injury.">Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury.</a> The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver.">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li><li>Chao, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clock+regulates+hepatic+polyploidy+by+modulating+Mkp1-Erk1/2+signaling+pathway.">Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway.</a> Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).</li><li>Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin/Akt+pathway+controls+a+specific+cell+division+program+that+leads+to+generation+of+binucleated+tetraploid+liver+cells+in+rodents.">The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).</li><li>Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+polyploidization+and+its+association+with+pathophysiological+processes.">Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (5), e2805 (2017).</li><li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li><li>Toyoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+to+hepatocyte+ploidy+and+binuclearity+profiles+during+human+chronic+viral+hepatitis.">Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis.</a> Gut. 54 (2), 297-302 (2005).</li><li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+and+Unconventional+Cell+Division+of+Hepatocytes+Underlie+Liver+Regeneration.">Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration.</a> Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).</li><li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+spectrum:+a+new+marker+in+HCC+classification.">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. , (2019).</li><li>Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+determining+ploidy+distributions+in+liver+tissue+by+stereological+analysis+of+nuclear+size+calibrated+by+flow+cytometric+DNA+analysis.">A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis.</a> Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).</li><li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Cell+Polyploidization:+A+Pivotal+Role+for+Binuclear+Hepatocytes.">Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li><li>Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+mouse+hepatocyte+ploidy+-+I.+Preparative+and+mathematical+protocol.">Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol.</a> Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).</li><li>Manzano-N&#250;&#241;ez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury.">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214 (2015).</li><li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organization+of+normal+mouse+liver:+A+histological,+quantitative+immunocytochemical,+and+fine+structural+analysis.">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li><li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells.">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li><li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hepatocyte+ploidy+levels+with+body+size+and+growth+rate+in+mammals.">Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals.</a> Genome. 44 (3), 350-360 (2001).</li><li>Tanami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+zonation+of+liver+polyploidy.">Dynamic zonation of liver polyploidy.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).</li><li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle.">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).</li><li>Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+and+liver+proliferation.">Polyploidy and liver proliferation.</a> Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).</li><li>Uhl&#233;n, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-based+map+of+the+human+proteome.">Tissue-based map of the human proteome.</a> Science. 347 (6220), 1260419 (2015).</li></ol>

Minür karaciğerde doku remodeling ve hepatosit nükleer ploidi tahmini analizi için yüksek içerikli, yüksek iş çıkışlı bir yaklaşım açıklanmıştır. Bir kez prosedür aşina, bir kullanıcı işleyebilir, görüntü ve 3−5 günlük bir süre içinde birden fazla örnek analiz, karaciğer sağlığı ayrıntılı bir imza sağlayan büyük test edilebilir veri kümeleri üreten. Örnek hazırlama yönteminin basitliği göz önüne alındığında, analiz edilen çok sayıda hücre ve doku alanı (ortal...

Memeli karaciğerindeki hepatositler, binükleer hücreler üretmek için durmuş sitokineze ve 16N DNA içeriği içeren poliploid çekirdekleri üretmek için DNA endorepasyonuna uğrayabilirler. Doğum sonrası gelişim sırasında genel hücresel ve nükleer ploidi artışı, yaşlanma ve çeşitli hücresel streslere yanıtolarak 1. Poliploidizasyon süreci dinamik ve geri dönüşümlü2, kesin biyolojik işlevi belirsiz kalırken3. Artmış ploidi azaltılmış proliferatif kapasite ile ilişkilidir4, genetik çeşitlilik2, kronik yaralanma adaptasyon5 ve kanserden korunma6. Hepatosit ploidi değişiklikler değişmiş sirkadiyenritimsonucu ortaya 7 , ve keserek8. En önemlisi, karaciğer ploidi profili yaralanma ve hastalıktarafındandeğiştirilir 9 , ve zorlayıcı kanıtlar belirli ploidi değişiklikler, artmış ≥8N çekirdekleri veya 2N hepatosit kaybı gibi, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı izlemek için yararlı imzalar sağlamak düşündürmektedir (NAFLD)3,10, veya viral enfeksiyonların diferansiyel etkisi11.
Genel anlamda, karaciğer hasarı ve rejenerasyon artmış hepatosit hücre büyüklüğü ve nükleer alan ile ilişkilidir12, hepatosit azaltılmış genel sayılar ile birlikte, özellikle 2N DNA içeriği10olanlar10 ,11. Karaciğerde parenkimal yaralanma da sıklıkla non-parenkimal hücrelerin genişlemesi eşlik (NPCs), stromal miyofibroblastlar da dahil olmak üzere, inflamatuar hücreler ve bipotent karaciğer ata hücreleri. Parenkimal hücre numarası ve nükleer ploidin nicel sitolojik profilini sağlayan yüksek iş parçacığı yöntemleri, nfc'lerde ki değişiklikleri de hesaba katarken, bu nedenle yaralanma ve hastalık sırasında karaciğerin yanıtını takip etmek için araştırma ve klinik araçlar olarak önemli bir potansiyele sahiptir. Hepatosellüler karsinom insan örneklerinde ploidy spektrumların yerinde analizi zorlayıcı son da nükleer ploidi önemli ölçüde tümörler içinde artar ve özellikle azaltılmış farklılaşma ve TP53 kaybı ile daha agresif tümör alt tipleri amplifiye olduğunu göstermektedir13. Bu nedenle, nükleer ploidi kantitatif değerlendirmede metodolojik gelişmeler karaciğer kanserinin gelecekteki prognostik profilleme yardımcı olacağını güçlü bir olasılık vardır.
Bu protokolde, fare karaciğer doku kesitlerinin karşılaştırmalı analizi için esnek bir yüksek iş lenme metodolojisi tanımlanmış olup, hepatosit sayılarının ayrıntılı sitometrik profillemesi, NPC yanıtı ve nükleer ploidiyi tahmin etmek için dahili olarak kalibre edilmiş bir yöntem(Şekil 1). Hepatositler ncd'lerden hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) immünetiketleme ile nükleer boyut ve nükleer morfometri karakterizasyonundan önce ayrılırlar. "Minimal DNA içeriği" ortalama Hoechst 33342 yoğunluğu (DNA yoğunluğu için bir proxy) interpole üç boyutlu (3D) nükleer hacim ile entegre ederek tüm dairesel nükleer maskeler için tahmin edilmektedir. Hepatosit minimal DNA içeriği daha sonra nükleer ploidi profili oluşturmak için NFC'ler kullanılarak kalibre edilir.
Görüntü edinimi, nükleer segmentasyon ve görüntü analizi yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak gerçekleştirilir ve on binlerce hücreiçeren iki boyutlu (2D) karaciğer bölümlerinin geniş alanlarının taranmasını sağlar. Tüm dairesel hepatosit çekirdekleri için örnek geniş ploidi profili oluşturmak için yüksek içerikli görüntü analizi verilerinin otomatik olarak işlenmesi için özel olarak yazılmış bir program sağlanmaktadır. Bu stereoolojik görüntü analizi (SIA)10,11,,14,15dayalı nükleer ploidy hesaplamak için yazılım indirmek için ücretsiz kullanılarak gerçekleştirilir. SIA metodolojisi daha önce dairesel nükleer morfolojisi ve nükleer boyut ve DNA içeriği arasında monoton bir ilişki varsayarak, karaciğer14hepatosit nükleer ploidi tahmin etmek için doğru, zahmetli de olsa, doğru bir yöntem olarak akış sitometri tarafından doğrulanmıştır. Bu protokolde, her iki nükleer parametre de nükleer morfometri ve Hoechst 33342 etiketleme nin değerlendirilmesi ile ölçüldü. Her nükleer maske için "minimal DNA içeriğinin" hesaplanması, bilinen 2−4N DNA içeriğine sahip olan ve bu nedenle yararlı bir iç kontrol görevi gören NPT'ler kullanılarak hepatosit nükleer ploidin kalibrasyonu ile takip edilir.
Konvansiyonel akış sitometri yöntemleri ile karşılaştırıldığında16 açıklanan yaklaşım hepatosit nükleer ploidi yerinde değerlendirilmesini sağlar ve sonuçları önyargı ve standartlaştırmak zor taze doku veya disaggregasyon yöntemlerine erişim gerektirmez. Tüm SIA tabanlı yaklaşımlarda olduğu gibi, nükleer ploidi alt sınıfları >2N ekvator düzlemi dışında büyük çekirdeklerin kesiti nedeniyle 2B örnekleme ile yeterince temsil edilmiştir. Doku çapında ploidi profili de tüm dairesel hepatosit nükleer maskeler için minimum DNA içeriğini açıklar ve doğrudan mononükleer hepatositler ve aynı ploidi iki ayrık ("dokunmaz") çekirdekleri var binükleer hücreler arasında ayrım yapmaz. Ancak, bu protokolün basitliği, hücre içi ploidin daha ayrıntılı bir değerlendirmesini sağlayan iki nükleer hücrelerin belirlenmesini kolaylaştıracak, nükleer aralık lar veya hücre çevre analizi gibi ek parametrelere göre uyarlanması için önemli bir kapsam sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC)</td>
			<td>TestDiet</td>
			<td>1810704</td>
			<td>Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Leica CM1850 UV</td>
			<td>Leica biosystems</td>
			<td>CM1850 UV</td>
			<td>Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statistical software for graphing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IN Cell Analyzer 1000</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td>
			<td></td>
			<td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>630-2864</td>
			<td>Size of 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Speadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Tissue Tek</td>
			<td>Pascual y Furi&#243;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>141451.121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen for immunostaining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>5mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysine Microscope Slides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-79380</td>
			<td>Dilution 1:250 (alternative)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabit polyclonal Anti-HNF4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6556</td>
			<td>Dilution 1:200 (antibody used in the study)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5927</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput in situ method for estimation of hepatocyte nuclear ploidy in mice

Karaciğer yaralandığında hepatosit sayıları azalır, hücre büyüklüğü ise, nükleer boyutu ve ploidi artar. Kolanjiyositler, miyofibroblastlar, atalar ve inflamatuar hücreler gibi parenkimal olmayan hücrelerin genişlemesi de kronik karaciğer hasarı, doku remodeling ve hastalığın ilerlemesini gösterir. Bu protokolde, karaciğerin hücresel bileşiminde yaralanma, kronik hastalık ve kanserle ilişkili değişiklikleri hesaplamak için basit bir yüksek iş ilişkisi yaklaşımını tanımlıyoruz. İki boyutlu (2D) doku bölümlerinden elde edilen bilgilerin, bir numune içinde hepatosit nükleer ploidiyi ölçmek ve kalibre etmek ve kullanıcının karaciğer içinde belirli ploidi alt kümeleri yerinde bulmasını sağlamak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Yöntemimiz sabit/dondurulmuş karaciğer materyaline, temel immünositokimya reaktiflerine ve herhangi bir standart yüksek içerikli görüntüleme platformuna erişim gerektirir. Bu taze toplanan doku bozulması, mekansal bilgi kaybı ve potansiyel disaggregasyon önyargı gerektiren standart akış sitometri teknikleri, güçlü bir alternatif olarak hizmet vermektedir.

Bu yöntem, 0.1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihidrocollidine (DDC)17içeren bir hepatotoksik diyet ile 0−21 gün boyunca hayvanları besleyerek yetişkin fare karaciğeri üzerinde kolestatik yaralanma etkisini ölçmek için kullanılmıştır. Kronik DDC besleme sonuçları hepatosellüler yaralanma artmış ploidi ve NPCs periportal genişleme. Kullanıcı, fare zorlanması ve yaşa bağlı farklılıkların nükleer ploidide mevcut olabileceğini ve tüm analiz...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice at JoVE.com

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

Akış sitometrisi gerektirmeyen sabit/kriyokorunmuş doku örneklerinde hepatosit numarası ve nükleer ploidideki değişiklikleri ölçmek için sağlam, uygun maliyetli ve esnek bir yöntem saseril. Yaklaşımımız karaciğer hasarı ve hastalığın ilerlemesini izlemek için ideal karaciğer sitolojisi güçlü bir örnek çapında imza sağlar.

Farelerde Hepatosit Nükleer Ploidi Tahmini için Yerinde Yüksek Throughput Yöntemi

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Bu yöntem, karaciğer gelişimi, rejenerasyon ve kronik hastalık çalışmaları için 2D doku bölümlerinden hepatosit nükleer DNA içeriği nin bir profil oluşturmak için kullanıcı sağlar. Bu otomatik yüksek iş elde etme yaklaşımı tüm 2D karaciğer dokusu bölümleriuygulanabilir, tüm basit dairesel hepatosit çekirdekleri için nükleer ploidi bir iç kalibre okuma sağlayan. Hepatosit nükleer ploidi değişiklikler yaşlanma ile ilişkilidir, kronik karaciğer hastalığı, ve kanser.Bu teknik, sabit veya kriyokorunmuş karaciğer örneklerinde nükleer ploidin profilini çıkarmak için basit bir araç sağlar. Onlar doku ayrıştırma veya taze malzeme erişimi gerektirmez gibi yerinde ploidy profilleme yöntemleri karaciğer hastalığı ilerlemesini izlemek için araştırma ve klinik araçlar olarak önemli bir potansiyele sahiptir. Murine karaciğer doku örneği hasat sonra, optimal bir kesme sıcaklığı orta dolu kriyomold içine karaciğer lobule gömmek ve hızlı donma sağlamak için hemen kuru buz üzerine kalıp yerleştirin.Dondurulmuş karaciğer lobule örneğinin dilimlerini elde etmek için, numuneyi altı mikrometre kalınlıkta keserek, her numunenin slayta yapışmasını sağlamak için beş saniye boyunca her numunenin üzerine etiketlenmiş poliamid kaplı bir slayt yerleştirin. Tüm dilimler toplandığında, immünetiketlemeden önce numunelerin oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca dengede olmasını bekleyin. Dengenin sonunda, pbs%4 paraformaldehit bir mililitre ile bir duman kaputiçinde doku bölümleri düzeltmek oda sıcaklığında 10 dakika.Fiksasyonun sonunda, pbs üç üç dakikalık yıkıntıları ile nazik ajitasyon ile slaytlar durula. Son yıkamadan sonra, her doku bölümü etrafında alan kuru ve her örnek etrafında bir daire çizmek için bir hidrofobik kalem kullanın. Numuneleri permeabilize etmek için, bölümleri PBS'de %0,5 iyonik olmayan yüzey aktif madde ile oda sıcaklığında 15 dakika tedavi edin.Kuluçka sonunda, numuneleri PBS'de üç dakika boyunca hafif ajitasyonla iki kez yıkayın ve spesifik olmayan bağlamayı %1 büyükbaş serum albumen, %5 at serumu ve PBS'de en az bir saat boyunca %0,2 iyonik olmayan yüzey aktif bir çözelti ile bloke etmeden önce gösterdi. Daha sonra, ışıktan korunan nemli bir boyama odasında bir gecede dört santigrat derecede tampon engelleme seyreltilmiş HHF4-alfa antikor ile slaytlar inkübed. Ertesi sabah, uygun bir floresan konjuge ikincil antikor ve Hoechst filtrelenmiş 1% sığır serum albumen seyreltilmiş ve% 0.2 Non-iyonik yüzey aktif madde ile kuluçka önce nazik ajitasyon ile PBS dört kez slaytlar yıkayın.Kuluçka sonunda, slaytları gösterildiği gibi dört kez yıkayın, ardından iki üç dakikalık yıkama lar çift distile suda nazik ajitasyon ile. Son yıkamadan sonra, numuneleri iki damla floresan montaj ortamıyla bir kapak kaymasına yerleştirin ve kabarcıkları ortadan kaldırmak için gerektiği kadar hafif basınç uygulayın. Daha sonra, iyi bir fiksasyon ve immün etiketleme sağlamak için geleneksel floresan mikroskop kullanarak slaytlar kontrol edin.Floresan görüntü edinimi için, kullanılan floresan için uygun uyarma kullanarak floresan görüntüleri elde etmek için yüksek içerikli görüntüleme platformunda parametreleri ayarlayın. Daha sonra doku bölümünün tam kapsama almak için yeterli görüntü elde etmek için örnekleri tazyin. Taramayı sonunda, çekirdeğin en iyi şekilde ayrıştırılmasından emin olmak için yazılımın nükleer segmentasyon parametrelerini ayarlayın ve HNF4-alfa pozitif hepatositler ve HNF4-alfa negatif negatif parenkimal olmayan hücrelerin optimal gating sağlamak için eşik yoğunluğunu değiştirin.Nükleer niceleme için, Hoechst boyama dayalı kare mikrometreler halinde nükleer alan ayarlayın, ana nükleer Hoechst yoğunluğu, nükleer uzama faktörü, ortalama nükleer yuvarlaklık indeksi, HNF4-alfa durumu, ve nükleer X, Yerçekimi merkezine dayalı Y koordinatları. Hepatosit nükleer ploidi analizi yapmak için, ilk indirin ve ploidy nicelik analizi programı yükleyin. MATLAB'da, araç şeridinin Uygulama sekmesine gidin ve Uygulamayı Yükle'yi tıklatın.Ploidy Application ML Uygulama Yükleme programını açın. Başarılı yüklemeyi onaylamak için bir ileti görüntülenir. Her veri analizi dosyasında, belirtildiği gibi sütunlar halinde belirlenen ploidy analizi için gerekli tüm verileri içeren hücre ölçüleri olarak adlandırılan bir sayfa içerir.Her deneysel durum için, iki ila dört N nükleer ploidy kalibrasyonu için iç kontrolü hesaplamak için kullanılacak bir kontrol veri seti sağlayın. Biyolojik çoğaltmalar için, her elektronik tabloyu kendi klasöründe depolayın ve klasör öneklerini artımlı olarak adlandırın. Sonra, Ploidy uygulamasını başlatın.Ploidy uygulaması grafik kullanıcı arabirimi görünür. Denetim verilerinin bulunduğu klasöre gitmek için Veri Yolu düğmesini tıklatın. Bu veri yolu daha sonra arabirimde görünür.Klasör Öneki'nde, çıktı dosyalarına verilecek adı yazın. Diğer Verilere Giden Yol düğmesini tıklatın ve karşılaştırmalı verilerin çoğaltıldığı klasöre gidin. Bu veri yolu daha sonra arabirimde görünür.Ardından Çalıştır'ı tıklatın. Çözümleme tamamlandığında Durum çubuğu Çözümlemesi Tamamla'yı okuyacaktır. İmmünetiketlemeden sonra, kaliteli bir fiksasyon ve boyama elde edildiğini doğrulamak için konvansiyonel floresan mikroskobu ile tüm slaytların kontrol edilmesi önemlidir.Hoechst boyasının bulaşması veya bulanıklaşması fiksasyon dan önce yetersiz fiksasyon veya örnek bozulmasını gösterebilir. Nükleer segregasyon ve HNF4-alfa eşik parametreleri, floresan mikroskopi ile gözlenen immünboyamanın görsel desenini geniş ölçüde yansıtacak şekilde otomatik görüntü analizi öncesinde dikkatle optimize edilmelidir. Görüntü analizini takiben, veriler artan sayıda parankimal olmayan hücre sayısını ve DDC yaralanması olan karaciğer içindeki HNF4-alfa pozitif çekirdek sayılarında küçük ama önemli olan azalmayı yansıtmalıdır.Sağlıklı kontrol karaciğerlerinde HNF4-alfa pozitif çekirdeklerin yaklaşık %63'ü basit dairesel morfometri ye sahiptir. Kontrol ve DDC tedavi grupları arasında göreceli nükleer ploidin karşılaştırılması 8C'den büyük hücrelerin artan sayıları ile birlikte yaralanma ile 2C ve 4C hepatosit çekirdekleri önemli bir kaybı yansıtmalıdır. Her ploidy alt grup için göreli konumsal bilgiler yüksek içerik görüntü analizi yazılımı içinde belirli hepatosit alt kümeleri 2D konumu alınarak sorgulanabilir.Ki-67 gibi ek antikorlarla immünoetiketleme, hücre replikasyonlarını değerlendirmek için yapılabilir ve hepatosit nükleer morfometri verileri ploidi analizini iltifat etmek için daha fazla sorgulanabilir. Bu yöntemle oluşturulan doku çapında ploidi profili tüm dairesel hepatosit çekirdekleri için minimum DNA içeriğini açıklar, ancak mononükleer hücreler ve binükleer hepatositler arasında ayrım yapmaz. Yöntem potansiyel olarak hücre çevresi gibi parametrelere göre uyarlanabilir, binükleer hücrelerin tanımlanmasını kolaylaştırmak ve hücresel ploidi ek bir okuma sağlamak için.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Basit Fare İntrakranial Xenograftlarında Çalışmaları Kılavuzu Vida Yöntemi

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

Fare Akciğer Entübasyonun Basit Bir Yöntem

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Farelerde Taksanlar Farmakokinetik ve Farmakodinamik Analiz Karotis Arter İnfüzyonlar

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Farelerde Trakea hızlı intübasyon için geliştirilmiş bir yöntem

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Creation of Abdominal Adhesions in Mice

Farelerde Karın Adezyonların Oluşturulması

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

Ivmeölçer kullanan Günlük Yaşamda Üst Ekstremite Performans miktarının Bir Yöntem

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Asit maserasyon yöntemini kullanarak tüm böbrek netron numarasının tahmini

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...