Name: high-resolution complexome profiling by cryoslicing bn-ms analysis
Uploaded: 2019-10-15T13:30:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis at JoVE.com

ساندت هذا دراسة كان ب ال [ديوتسكه] [فورسكهنغجميندسكهفت] ([دغ], المانيه بحث مؤسسه)-[بروجكت-معرف] 403222702-[سفيس] 1381 وتحت ألمانيا امتياز استراتيجية [كسبس-اكسك-2189-مشروع [فيد] 390939984. نشكر كاتيا زابي علي المساعدة الفنية.

<ol>
	<li>Majeran, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+C4+Differentiation+for+Chloroplast+Membrane+Proteomes+in+Maize+Mesophyll+and+Bundle+Sheath+Cells.">Consequences of C4 Differentiation for Chloroplast Membrane Proteomes in Maize Mesophyll and Bundle Sheath Cells.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 7, 1609-1638 (2008).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes.">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li><li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex.">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 538-549 (2012).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling.">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS ONE. 8 (7), e68340 (2013).</li><li>W&#246;hlbrand, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+membrane-protein+complexes+of+the+marine+sulfate+reducer+Desulfobacula+toluolica+Tol2+by+1D+blue+native-PAGE+complexome+profiling+and+2D+blue+native-/SDS-PAGE.">Analysis of membrane-protein complexes of the marine sulfate reducer Desulfobacula toluolica Tol2 by 1D blue native-PAGE complexome profiling and 2D blue native-/SDS-PAGE.</a> Proteomics. 16 (6), 973-988 (2016).</li><li>Takabayashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCoM-DB+Update:+A+Protein+Co-Migration+Database+for+Photosynthetic+Organisms.">PCoM-DB Update: A Protein Co-Migration Database for Photosynthetic Organisms.</a> Plant and Cell Physiology. 58 (1), e10 (2017).</li><li>Senkler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+complexome+of+Arabidopsis+thaliana.">The mitochondrial complexome of Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 89 (6), 1079-1092 (2017).</li><li>de Almeida, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+electron+transport+systems+of+an+anammox+bacterium:+A+complexome+analysis.">Membrane-bound electron transport systems of an anammox bacterium: A complexome analysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (10), 1694-1704 (2016).</li><li>Anand, R., Strecker, V., Urbach, J., Wittig, I., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mic13+Is+Essential+for+Formation+of+Crista+Junctions+in+Mammalian+Cells.">Mic13 Is Essential for Formation of Crista Junctions in Mammalian Cells.</a> PLoS ONE. 11 (8), e0160258 (2016).</li><li>Eydt, K., Davies, K. M., Behrendt, C., Wittig, I., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cristae+architecture+is+determined+by+an+interplay+of+the+MICOS+complex+and+the+F1FO+ATP+synthase+via+Mic27+and+Mic10.">Cristae architecture is determined by an interplay of the MICOS complex and the F1FO ATP synthase via Mic27 and Mic10.</a> Microbial Cell. 4 (8), 259-272 (2017).</li><li>M&#252;ller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoslicing+Blue+Native-Mass+Spectrometry+(csBN-MS),+a+Novel+Technology+for+High+Resolution+Complexome+Profiling.">Cryoslicing Blue Native-Mass Spectrometry (csBN-MS), a Novel Technology for High Resolution Complexome Profiling.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 669-681 (2016).</li><li>Castonguay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two-pore+channel+TPC1+is+required+for+efficient+protein+processing+through+early+and+recycling+endosomes.">The two-pore channel TPC1 is required for efficient protein processing through early and recycling endosomes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10038 (2017).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li><li>Banyard, S. H., Stammers, D. K., Harrison, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+density+map+of+apoferritin+at+2.8-A+resolution.">Electron density map of apoferritin at 2.8-A resolution.</a> Nature. 271 (5642), 282-284 (1978).</li><li>Dettmer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+protein+147+(TMEM147)+is+a+novel+component+of+the+Nicalin-NOMO+protein+complex.">Transmembrane protein 147 (TMEM147) is a novel component of the Nicalin-NOMO protein complex.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (34), 26174-26181 (2010).</li><li>Kimberly, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-secretase+is+a+membrane+protein+complex+comprised+of+presenilin,+nicastrin+Aph-1,+and+Pen-2.">Gamma-secretase is a membrane protein complex comprised of presenilin, nicastrin Aph-1, and Pen-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6382-6387 (2003).</li><li>Hong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+PIG-U+and+yeast+Cdc91p+are+the+fifth+subunit+of+GPI+transamidase+that+attaches+GPI-anchors+to+proteins.">Human PIG-U and yeast Cdc91p are the fifth subunit of GPI transamidase that attaches GPI-anchors to proteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1780-1789 (2003).</li><li>Van Damme, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+ATP6V1E1+or+ATP6V1A+Cause+Autosomal-Recessive+Cutis+Laxa.">Mutations in ATP6V1E1 or ATP6V1A Cause Autosomal-Recessive Cutis Laxa.</a> The American Journal of Human Genetics. 100 (2), 216-227 (2017).</li><li>Budenholzer, L., Cheng, C. L., Li, Y., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+Structure+and+Assembly.">Proteasome Structure and Assembly.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3500-3524 (2017).</li><li>Heusel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex-centric+proteome+profiling+by+SEC-SWATH-MS.">Complex-centric proteome profiling by SEC-SWATH-MS.</a> Molecular Systems Biology. 15 (1), e8438 (2019).</li><li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Forster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome.">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nature Methods. 9 (9), 907-919 (2012).</li></ol>

المؤلف أوى شولتي هو موظف ومساهم في Logopharm GmbH التي تنتج المجمع 47 المستخدمة في هذه الدراسة. وتقدم الشركة الكواشف المعقدة إلى المؤسسات الاكاديميه علي أساس غير ربحي.

الدراسة المقدمة التي بنيت علي تقنيه csBN-MS قياسها سابقا مع اعداد الميتوكوندريا11 ودمج التحسينات في اعداد العينة ، ومعالجه هلام ، وتقييم البيانات MS. وقدم التحليل المركز لقسم من هلام الفصل واسعه النطاق BN-PAGE مجموعه شامله من البيانات التي تبين تدابير الجودة مماثله للدراسة مع اغشيه الميتوكوندريا. وظلت الأخطاء التي طرات علي الكتلة ووقت الاستبقاء ، فضلا عن الاختلافات في التشغيل ، منخفضه جدا ووفرت الأساس لتحديد ملامح موثوقه لوفره البروتين. حجم القرار يبدو ان تكون جيده ، مع عرض الذروة نصف القصوى منخفضه مثل سته شرائح (المقابلة 1.5 مم ، الشكل 4) والاختلافات النسبية حجم اقل من 10 ٪ حل (الشكل 3، الشكل 5ا). هذه القيم لم تلبي تماما جوده دقه الحجم من تحليل csBN-MS السابقة من الميتوكوندريا (علي الرغم من أصغر حجم الخطوة أخذ العينات هلام المختار) ، لكنها أفضل بكثير من أداء التقليدية BN-MS أو حجم الاستبعاد MS تقترب من20 التي أصبحت في الاونه الاخيره شعبيه.
وتبرز اهميه دقه الحجم المعقدة العالية الفعالية في تجربه المحاكاة في الشكل 3 (باستخدام المجمعات المرتبطة بالTPC1) التي يصعب حلها بواسطة تحليل اللطخه الغربية من الدرجة الثانية (الشكل 1ب). وتشير هذه النتائج إلى ان تشريح 0.25 مم في هذه الحالة ادي إلى بعض الإفراط في أخذ العينات ، ولكن هذا ثبت انه لا يزال مفيدا للقضاء علي "التشويش الكمي" دون المساومة علي دقه الحجم الفعال. التالي ، تمشيا مع النتائج السابقة11، حجم خطوه أخذ العينات من ~ 0.3 مم هو عموما الموصي بها.
ولا سيما ان التمييز في المجمعات المرتبطة بالTPC1 يفقد تماما مع أخذ عينات هلام 1 مم ، وهو أصغر حجم الخطوة المقدمة من التقطيع اليدوي في التقليدية BN-MS5،6. وهذا قد يفسر حقيقة انه علي الرغم من التكنولوجيات MS قويه المتاحة, وقد تم تحديد عدد قليل جدا من مجمعات البروتين والوحدات الفرعية من قبل التنميط المعقدة. بالاضافه إلى قوه حل جيده ، csBN-MS يقدم براعة عاليه. يمكن حل المجمعات المرتبطة بغشاء ومجمعات البروتين القابلة للذوبان التي تتراوح من 50 كده إلى عده MDa بشكل فعال في تجربه واحده مع الحد الأدنى من التحيز11. هذا يتناقض مع تقنيات الفصل البديلة المستخدمة لتنميط المعقدة مثل حجم الاستبعاد أو اللوني تبادل الأيونات ، التي تعمل مع مجموعات من البروتينات القابلة للذوبان مع نطاقات معينه من حجم أو تهمه خصائص. علي الجانب السلبي ، csBN-MS اقل قابليه للتطوير (الحمولة القصوى من ~ 3 ملغ بروتين لكل هلام) ، قد تكون صعبه من الناحية الفنية ، ولا يمكن ان تكون تلقائية.
وإجمالا ، تبين النتائج ان التنميط المعقد القائم علي csBN MS يمكن تطبيقه بنجاح علي الأهداف غير المتقدريه ولكنه يشير أيضا إلى بعض التحديات المرتبطة به. التالي ، يتطلب الاستخراج الفعال والاستقرار البيوكيميائي لمجمعات البروتين المزيد من التحسين ، وخطوات التنظيف وقد لا تزال محدوده. وفي اطار حجم التحقيق ، كان عدد المجمعات البروتينية المركزة بشكل جيد ، والمكونات أحاديه التشتت ، في الواقع اقل بكثير (لم تظهر البيانات) بالمقارنة مع عينه من الميتوكوندريا. ويوصي أيضا لخفض الأحمال العينة BN-PAGE للحصول علي انفصال هلام مقبوله. قد تتطلب الأحمال العالية ممرات جل أوسع أكثر صعوبة لمعالجتها بشكل صحيح لتقطيعها (انظر الفيديو المصاحب). وعلاوة علي ذلك ، كان تعقيد البروتين من العينات اعلي (حوالي ضعفين) من الهضم شريحة المشتقة من الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى المزيد من القيم الكهروضوئية المفقودة والنطاق الديناميكي المنخفض. في الواقع ، بعض البروتينات الصغيرة المتوقع ان تكون جزءا من المجمعات المبينة في الشكل 5 كانت مفقوده في التحليلات. ويمكن حل هذه المشاكل في المستقبل باستخدام أدوات MS أسرع وأكثر حساسية أو أوضاع اكتساب مستقله للبيانات.
اعداد العينة أمر بالغ الاهميه لاستخلاص البروتين المعقدة ، والاستقرار ، ونوعيه الانفصال هلام. يجب ان تكون المعلمات والإجراءات الأمثل لكل مصدر الانسجه ، الخلية lysate ، غشاء (كسر) ، والبروتين المعقدة من الفائدة. وترد التوصيات العامة التالية التي قد تساعد علي توسيع نطاق تطبيقات csBN-MS:
' 1 ' اعداد عينات جديده وتجنب الاحترار/التجميد ، والتخفيفات القوية ، والتغيرات في الظروف العازلة ، والتاخيرات غير الضرورية ؛
' 2 ' استخدام المخازن المؤقتة الخالية أساسا من الأملاح (يستعاض عنها بالبيتين 500-750 مم أو بحمض امينوكابرويك) ، وعن درجه الحموضة المحايدة ، وتحتوي علي ما يصل إلى 1 في المائة (ث/ف) من المنظفات غير المزيلة (البروتين: نسبه المنظفات بين 1:4-1:10 لأذابه الغشاء مجمعات البروتين ، لا المنظفات اللازمة لمركبات البروتين القابلة للذوبان) ؛
' 3 ' الاختبار الدقيق وضبط ظروف المنظفات بواسطة الصفحة التحليلية BN ، لأنها قد تؤثر بشده علي كفاءه الذوبان المعقد ، وتمثيل مجمعات البروتين الغشائي في العينة ، والاستقرار ، وتجانس البروتين المنظفات micelles. هذه الاخيره هي الشروط المسبقة للبروتينات للتركيز كفرق متميزة/المجموعات السكانية المعقدة علي الهلام BN-PAGE. الأدب السابق يقدم مجموعه واسعه من المنظفات المحايدة. ومع ذلك ، DDM (ن-دوديسيل β-د-مالتوسيدي)1،2،4،5،6 و ديجيتونين3،5،7،8، 9,10,13,18 وكانت الخيارات الأكثر شعبيه لتحليلات BN-MS حتى الآن. ويجب التاكيد علي ان اي حاله من حالات المنظفات تمثل بالضرورة حلا توفيقيا بين كفاءه الذوبان والحفاظ علي تفاعلات البروتين وقد لا تكون مناسبه بالتساوي لجميع أنواع البروتين المستهدف والمواد المصدرية ؛
' 4 ' أزاله البوليمرات المشحونة مثل ألياف الليفية ، والخيوط ، وبوليلسين ، والحمض النووي ، ومكونات الوزن الجزيئي المنخفضة الوفيرة (اي نواتج الأيض أو الدهون أو الببتيدات). ويمكن تحقيق ذلك عن طريق التسميد ، والترشيح هلام ، أو غسيل الكلي. وهذا مهم بشكل خاص لمجموع الخلايا أو الانسجه lysates;
' 5 ' أضافه كوماسي G-250 (التركيز النهائي 0.05%-0.1%) والسكروز (لزيادة الكثافة للتحميل ، والتركيز النهائي 10 ٪-20 ٪ [ث/ف]) إلى العينة قبل التحميل فقط ، لمسح بواسطة ultracentrifugation قصيرة ، وتحميل العينة دون اضطراب ، وبدء تشغيل مباشره بعد ذلك.
وكمنظور مستقبلي ، يقدم التنميط القائم علي csBN MS خيارات لمضاعفه الإرسال لدراسة ديناميات معقده البروتين أو التغييرات المتعلقة بالظروف البيولوجية المحددة. ويبدو الفصل المشترك بين العينات الموسومة بالأيض علي النحو المقترح لتحديد الحجم القائم علي الاستبعاد21 واضحا ، ولكنه قد يعوقه تبادل الوحدات الفرعية العفوية في مجمعات تحدث بشكل مستقل عن الانفصال المستخدم الاسلوب. بدلا من ذلك ، يمكن حل العينات الموسومة في الممرات هلام المجاورة ، والتي يمكن بعد ذلك ان تكون مشتركه في شرائح أو مجتمعه بعد هضم للتحليل التفاضلي مع حساسية عاليه ومتانة.

وقد اقترن فصل الصفحات الاولي بالتحليل المباشر لل LC-MS بواسطةالمجموعتين البحثيتين majeran1 و wessels 2 باستخدام التقطيع اليدوي لممرات جل الصفحات bn. وقد حددت تحاليلهم عددا من مجمعات البروتينات الغشائية الوفيرة المعروفة بتكوين الوحدة الفرعية من البلازما النباتية والميتوكوندريا الخلوية ، علي التوالي. ومع ذلك ، فان هذه التحليلات ابعد ما تكون عن الشمول ولا تسمح بالتحديد غير المتحيز للجمعيات الجديدة. ومنذ ذلك الحين ، تحسن أداء مقاييس الطيف الجماهيري وأساليب القياس الكمي الخالية من العلامات إلى حد كبير ، مما مكن من اجراء تحليلات شامله لهذه المقاييس. وقد صاغ هذا مصطلح "التنميط المعقد". علي سبيل المثال, وحللت هايد وزملاءه الفئران الميتوكوندريا القلب تحديد وتجميع 464 البروتينات الميتوكوندريا, مما يؤكد العديد من الجمعيات المعروفة. الاضافه إلى ذلك ، وجدوا TMEM126B ان تكون الوحدة الفرعية الجديدة والحاسمة لمجمع التجميع المحدد3. وقد تم الحصول علي نتائج مماثله (مع ملفات تعريف البروتين الميتوكوندريا 437) في دراسة موازيه من الخلية يشيك الميتوكوندريا4.
وعلي الرغم من هذه التحسينات ، فقد ظلت هناك عده قضايا تحد من الإمكانات الكاملة لهذه المجموعة من أجل التنميط المعقد. ومن القيود الرئيسية هو دقه حجم المجمعات التي يتم تحديدها من قبل عاملين: (1) نوعيه الفصل BN-PAGE ، والذي يعتمد علي التوحيد من التدرج المسام هلام مصفوفة ، فضلا عن استقرار/الذوبان في المجمعات عينه ، و (2) حجم الخطوة من أخذ العينات هلام ، وهو في أفضل 1 ملم عند استخدام اليدوية التقليدية تشريح5،6. ضعف القرار الحجم لا يخطئ فقط المعقدة المتشابكة والتغاير ، ولكنه يؤثر سلبا أيضا علي المدى الديناميكي والثقة من التخصيص غير متحيزة ، والوحدة الفرعية من نوفو والتقدير الكمي.
وتشمل التحديات الأخرى دقه القياس الكمي للبروتين وتغطيه المجموعة الدينامية الفعلية لوفره البروتينية في العينة عن طريق تحليل الطيف الكتلي. ولذلك ، فقد ظل تطبيق التنميط المعقد لل BN-MS مقتصرا إلى حد كبير علي العينات البيولوجية ذات التعقيد الأقل ، والتعبير العالي عن المجمعات المستهدفة ، وخصائص الاذابه المواتية (اي البلازما ، الميتوكوندريا ، الكائنات المجهرية)6،7،8،9،10.
وقد أدخلنا مؤخرا بمساعده التشريح الدقيق لل BN-MS (csBN-MS) ، والذي يجمع بين العينات الدقيقة الفرعية من الممرات الهلامية من BN-PAGE مع تحليل MS الشامل ومعالجه بيانات MS المفصلة لتحديد ملامح البروتين مع ارتفاع الثقة11. التطبيق علي اعداد غشاء الميتوكوندريا من أدمغه الفئران أظهرت سابقا غير الملبية القرار الفعال المعقدة الحجم والتغطية القصوى لسلسله الجهاز التنفسي المؤكسد (OXPHOS) الوحدات الفرعية (اي ، 90 من 90 MS الوصول اليها). وقد حدد هذا المثال أيضا عددا من الجمعيات البروتينية الجديدة.
وصفت هنا الإجراءات الأمثل للجدول المعد الفصل BN-PAGE من المجمعات البروتينية (لا تقتصر علي مصدر بيولوجي معين) ، والصب من الهلام اعداد كبير من الصفحات BN ، التقطيع بالتبريد من الممرات هلام واسعه ، وبيانات MS معالجه. ويظهر أداء التنميط عاليه الدقة لاعداد معقده البروتين من الاغشيه الكلي الفئران المخصب التنظير. وأخيرا ، تناقش الفوائد الناجمة عن زيادة الاستبانة والدقة في تحديد الكميات الطيفية الشاملة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>#1610158</td>
			<td>Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>#1610154</td>
			<td>Recommended for acrylamide gradient gel solutions &#62;13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby Protein Blot Stain</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>#1703127</td>
			<td>Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Serva</td>
			<td>no. 35050</td>
			<td>Centrifugate stock solutions prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ComplexioLyte 47</td>
			<td>Logopharm</td>
			<td>CL-47-01</td>
			<td>Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Medium / Tissue Freezing Medium</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14020108926</td>
			<td>Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>any supplier, important for making gel section embedding tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>broad razor blade</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal tube / cylinder, ca. 4 cm long</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>mold for embedding and freezing of gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Nr. 0030108116</td>
			<td>highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing-grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 &#181;m</td>
			<td>Dionex / Thermo Scientific</td>
			<td>P/N 160454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoTip emitter (i.d. 75 &#181;m; tip 8 &#181;m)</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>FS360-75-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 &#181;m)</td>
			<td>Dr. Maisch GmbH</td>
			<td>r13.93.</td>
			<td>columns packed manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-TPC1 antibody</td>
			<td>Gramsch Laboratories</td>
			<td>custom production</td>
			<td>described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>CY-1300</td>
			<td>described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>#B1325</td>
			<td>described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-microtome Leica CM1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047743905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean II Cell with wetblot unit</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penguin Midi Gel Electrophoresis System</td>
			<td>PeqLab</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>for BN-PAGE (not sold any more)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera</td>
			<td>Zeiss / Photometrics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump (IP high precision multichannel)</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM940</td>
			<td>for casting of gradient polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gradient mixer with stirring (two chambers)</td>
			<td>selfmade, alternatively Bio Rad</td>
			<td>1652000 or 1652001</td>
			<td>for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor</td>
			<td>Sorvall / Thermo Scientific</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>for sample preparation (not sold any more)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano HPLC</td>
			<td>Dionex / Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Elite mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMAZQ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution complexome profiling by cryoslicing bn-ms analysis

البروتينات عموما ممارسه الوظائف البيولوجية من خلال التفاعلات مع البروتينات الأخرى, اما في الجمعيات البروتين الحيوي أو كجزء من المجمعات التي شكلت باقتدار. ويمكن حل هذه الاخيره باناقه وفقا للحجم الجزيئي باستخدام الأصلي بولياكرياميد هلام الكهربائي (BN الصفحة). وقد ثبت جيدا اقتران هذه الحالات بالطيف الكتلي الحساس ويسمح نظريا باجراء تقييم شامل للمعقد القابل للاستخراج في العينات البيولوجية. بيد ان هذا النهج شاق إلى حد ما ويوفر قدرا محدودا من الدقة المعقدة والحساسية. أيضا ، وقد ظل تطبيقه يقتصر علي وفره البروتينات الميتوكوندريا والبلازما. التالي ، بالنسبة لغالبيه البروتينات ، لا تزال هناك نقص في المعلومات المتعلقة بالاندماج في مجمعات البروتين المستقرة. العرض هنا هو نهج الأمثل لتنميط المعقدة التي تتالف من الفصل الاعداديه BN-الصفحة ، والعينات الفرعية ملليمتر من الممرات هلام واسعه من قبل تقطيع بالتبريد ، وتحليل الطيف الشامل مع كميه البروتين خاليه من التسمية. يتم وصف الإجراءات والاداات اللازمة للخطوات الهامه بالتفصيل. وكتطبيق ، يصف التقرير التحليل المعقد لجزء من غشاء التنظير الداخلي المخصب المذاب من الكلي الفاره ، مع 2,545 البروتينات في المجموع. وتبين النتائج تحديد البروتينات الغشائية الموحدة والمنخفضة الوفرة مثل القناات الايونيه داخل الخلايا بالاضافه إلى الدقة العالية ، وأنماط تجميع البروتين المعقدة ، بما في ذلك ايزوفورم غليكويليشن. وتتفق النتائج مع التحاليل الكيميائية الحيوية المستقلة. وباختصار ، تسمح هذه المنهجية لتحديد شامله وغير متحيزة من البروتين (سوبر) المجمعات وتكوينها الوحدة الفرعية ، وتوفير أساس للتحقيق في القياس ، والتجمع ، وديناميكيات التفاعل من المجمعات البروتينية في اي النظام البيولوجي.

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis at JoVE.com

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

يتم تقديم البروتوكول متعدد الاستخدامات الذي يستخدم ميكروتومي لتحديد السمات المعقدة عاليه الدقة.

التنميط العالي الاستبانة بواسطة Cryoslicing BN-MS التحليل

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

وكان الهدف الرئيسي لتطوير تقنية CSBN-MS الحصول على الوصول الشامل إلى تنظيم وتجميع مجمعات البروتين التي تكمن وراء تحويل الإشارة في وعبر غشاء البلازما لأنواع مختلفة من الأنسجة والأعضاء. يوفر csBN-MS حاليًا أعلى تنوع في الدقة لتحليل مركب البروتين الأصلي وتكوينها الفرعي، خاصة فيما يتعلق بالبروتينات الغشائية. على الرغم من أن تقنية CSBN-MS تم تطويرها لتحليل الخلائط المعقدة من مجمعات البروتين الغشائي في دماغ القوارض ، إلا أنه يمكن تكييفها بسهولة مع تحليل أي نوع من العينة البيولوجية.واحدة من الخطوات الرئيسية لطريقتنا هو تضمين قطعة هلام ومحاذاة الصحيح إلى مستوى القطع قبل تقطيع. يجب الحرص على عدم المسيل للدموع أو لضغط هلام وتأكد من أنه لا يميل إلى الطائرة القطع لأن هذا من شأنه أن يقلل من قرار التحليل. لدينا تقنية CSBN-MS لديها العديد من الخطوات العملية التي تعتبر حاسمة لتحقيق نتائج جيدة.من الأسهل إظهار كيفية تنفيذ هذه الخطوات بالتفصيل من مجرد وصفها. لبدء هذا الإجراء استخدام اثارة اثنين من غرفة خلاط التدرج التي يقودها مضخة ليلقي خطي أو جل التدرج المسامية الزائد. إعداد حلول لغرفة الخلط الأمامية وغرفة الخزان كما هو موضح في بروتوكول النص.بدء تشغيل المُحرك وإضافة 30 ميكرولترات من وكالة الأنباء الجزائرية و 2.5 ميكرولترات من TEMED إلى الحل في الغرفة الأمامية. ثم، بدء المضخة وفتح صمام الجبهة. بعد ما يقرب من دقيقة واحدة، إضافة 90 ميكرولترات من وكالة الأنباء الجزائرية وخمسة microliters من TEMED إلى غرفة الخزان وفتح اتصال الغرفة.السماح للجل البلمرة ببطء ودقة لمدة 24 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة لتوليد التدرج حجم المسام متجانسة. إذا أبقى رطبة هلام بلمرة يمكن تخزينها تستقيم في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. المقبل، وإعداد فتحات التحميل عن طريق إدراج المسافات المناسبة بين لوحات الزجاج لفصل بين 0.5 و 2.0 ملليغرام من البروتين.يجب أن يكون عرض الفتحات ثلاثة سنتيمترات على الأقل. لتشغيل المخازن المؤقتة، وإعداد العازلة الكاثود الدائمة التي تتكون من 50 ميليمولار tricine، 50 ملليمولار بيس تريس، و 0.01٪ Coomassie G-250. إعداد العازلة الأنود القياسية التي تتكون من 50 ميليمولار بيس تريس.Solubilize ما يقرب من 2.5 ملليغرام من الغشاء واثنين من ملليلتر من العازلة solubilization تحتوي على 1 ٪ غير denaturing المنظفات على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم فائقة الrifuge في 130، 000 مرات G لمدة 11 دقيقة. تركيز solubilisate على 50٪ 20٪ خطوة sucrose متدرجة من قبل الrifugation فائقة في 400، 000 مرات G لمدة ساعة واحدة.بعد هذا، حصاد التدرج السكروز من الجزء السفلي من الأنبوب، إضافة 0.05٪ Coomassie G-250 إلى solubilisate، وتحميل العينة على هلام. تشغيل BN-PAGE إعداد في 10 درجة مئوية بين عشية وضحاها باستخدام بروتوكول الجهد ثلاث خطوات، كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد أن يتم تشغيل الجل مسح المواد الهلامية لأغراض التوثيق مع الاحتفاظ بها بين لوحات الزجاج.فحص نوعية فصل هلام. بعد ذلك ، dissemble لوحات ومكوس المقاطع حارة من الفائدة. إصلاح الممرات مرتين مع 30٪ الإيثانول و 15٪ حمض الخليك لمدة 30 دقيقة على الأقل.نقل عينة من التضمين المتوسطة والسماح لها لنقع وتككيل لمدة ساعتين على الأقل مع الحفاظ على لوح هلام في حركة بطيئة على شاكر المدارية. ثم، قطع الممرات هلام ثابت في أقسام موازية تماما لواجهة هجرة البروتين، أو نمط الفرقة. ضع كل قسم على دعم فيلم بلاستيكي بأبعاد متساوية من أجل التعامل معه بسهولة.نقل الممرات إلى أنبوب مفتوح مع سدادات مغلقة في الجزء السفلي ومثقبة مركزيا على الجزء العلوي، وكلاهما الانحياز بدقة مع الطرفين العلوي والسفلي من قسم هلام. تراجع اسطوانة في النيتروجين السائل لفترة وجيزة لبدء بسرعة التصلب. يقوي متوسط التضمين الشفاف في غضون ثوان ويصبح أبيض اللون.ملء تجويف مع تضمين المتوسطة، تراجع لفترة وجيزة الاسطوانة في النيتروجين السائل، ومن ثم السماح لها تجميد جيدا في ناقص 20 درجة مئوية لعدة ساعات. بعد التفكيك، قم بإزالة الفيلم البلاستيكي ونقل الكتلة مع قسم الجل المدمج إلى أسطوانة معدنية مبردة. الاسطوانة أكبر قطر ومختومة في الخارج مع التضمين المتوسط.يتم وضعه على دعم مسطح. ملء الاسطوانة مع تضمين المتوسطة وتجميد تماما كما ذكر من قبل. كرر هذا الإجراء مع الجانب الآخر من الاسطوانة للحصول على كتلة صلبة مع سطح القاع االقطار.ثم، إزالة كتلة من الاسطوانة واستخدام تضمين المتوسطة للصقه إلى حامل معدني ما قبل التبريد. أدخل حامل المعدن في آلة التبريد. حامل يجب أن يكون محاذاة بعناية فيما يتعلق الطائرة تقطيع.السماح للكتلة لتكواز إلى درجة الحرارة المثلى لعملية تشريح. بعد هذا الحصاد شرائح هلام واحدا تلو الآخر مع سمك المطلوب النهائي من 0.25 ملليمتر حجم الخطوة ونقلها بشكل فردي إلى أنابيب رد فعل مع خصائص منخفضة البروتين ملزمة. ثم، يتم إخضاع الشرائح إلى هضم مُلَكِم وتحليل مطياف الكتلة.ويوسع هذا البروتوكول نطاق تطبيق التنميط المعقد العالي الدقة ليشمل الأغشية غير الميتوكوندريا التي تعبر عن البروتينات المنخفضة الوفرة. الفصل المعقد يظهر عصابات البروتين الملون بقوة مع القليل جدا من القطع الأثرية الهجرة. تشير انحرافات إشارات الببتيد في الكتلة ووقت الاحتفاظ إلى معدل منخفض للغاية لتعيين حجم الذروة الموجبة الكاذبة.يتم التخلص بسهولة من الاختلافات التشغيل لتشغيل عن طريق إعادة تحديد مجموعات بيانات حجم الذروة. ثم يتم استخدام معلومات كثافة الببتيد الناتجة لإعادة بناء 2545 ملامح البروتين من وفرة نسبية. تم تقييم أهمية حجم خطوة أخذ عينات الهلامية في حل مجمعات البروتين من خلال الانضمام إلى مجموعات البيانات من الشرائح المجاورة.في 0.25 ملليمتر، حجم فصل من السكان المعقدة TPC1 المرتبطة بشكل جيد في الاتفاق مع نتائج تحليل البقع الغربية. الانضمام لأكثر من شريحتين يلغي التمييز في الـ TPC1 السكان الفرعيين المركبين. وأخيراً، يقدم التحليل معلومات عن المجمعات ذات الميز الجيد ويبين وجود وحدات فرعية جديدة وجمعيات معقدة.بالنسبة للفيريتين، تشير ملفات تعريف الوحدات الفرعية المعدلة لوفرتها النسبية إلى وجود ثلاثة أشكال متساوية معقدة على الأقل مع سلسلة ثقيلة /خفيفة متميزة. وعلى النقيض من ذلك، تظهر مجمعات nicalin-nomo1، ومجمع ناما-سيكرياز الأساسي، وآلات GPI-transamidase نسب وفرة ثابتة من وحداتها الفرعية الأساسية على نطاق الحجم الكامل ومستقلة عن الارتباط مع بروتينات إضافية. المعلمة الرئيسية لتحليل csBN-MS هي الدقة الفعالة للمجمعات ، والتي يتم تحديدها من خلال الكيمياء الحيوية عينة ، جودة هلام BN ، المحاذاة السليمة أثناء التضمين وتقطيع ، ونوعية البيانات MS المكتسبة.وتمشيط csBN-MS مع وضع العلامات النظيرية للبروتينات والعينات سيسمح بإجراء مقارنة مباشرة بين المجمعات في مختلف الحالات الفيزيولوجية أو البيولوجية أو التنموية. كشف csBN-MS على الأغشية من دماغ القوارض التنوع الهائل للمستقبلات والقنوات الأيونية والناقلات فيما يتعلق بتكوين الوحدة الفرعية ووظيفتها ، وسيكون ذلك مفيدًا لتحليل الهيكل ثلاثي الأبعاد في الاستعدادات الأصلية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

الحصول على بيانات النسخ عالية الجودة من بذور الحبوب من خلال طريقة معدلة لتنميط التعبير الجيني

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

الجمع الروتيني لمجموعات بيانات التبريد EM عالية الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل 200 كيلو فولت

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

مطيافية نيوترونية عالية الدقة لدراسة ديناميكيات بيكو ثانية-نانوثانية للبروتينات ومياه الترطيب

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

تقييم وظيفة الميتوكوندريا في العصب الوركي عن طريق قياس التنفس عالي الدقة

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...