Name: high-resolution complexome profiling by cryoslicing bn-ms analysis
Uploaded: 2019-10-15T13:30:00
Duration: 9 min 33 s
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이 연구는 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG, 독일 연구 재단)-프로젝트 ID 403222702 – SFB 1381 및 독일의 우수 전략 CIBSS - EXC-2189 - 프로젝트 ID 390939984에 의해 지원되었다. 우리는 기술 지원을 위한 Katja Zappe에게 감사드립니다.

1. 준비 BN-PAGE
<ol><li>젤 제제<ol>
<li>효과적인 냉각 세트10 °C와 중간 에서 대형 수직 젤 전기 영동 시스템 (>10cm 젤 분리 거리, 14cm x 11cm, 1.5 mm 스페이서)를 사용합니다.</li>
		<li>펌프에 의해 구동되는 교반 2 챔버 그라데이션 믹서를 사용하여 선형 또는 쌍곡선 기공 구배 겔(1.5-3.0 mm 스페이서)을 캐스팅합니다(재료 및 시약 표참조). 제시된 예에서(선형 그라데이션 젤 1%-13%):<ol>
<li>13% 아크릴아미드(30% 스톡 용액, 37.5:1.0 아크릴아미드:비삼크릴라미드), 0.75 M 아미노카프로산, 50 mM 비스-트리스(pH= 7.0), 및 10% 글리세로 구성된 전면(혼합) 챔버용 용액을 준비한다.</li>
			<li>1% 아크릴아미드(30% 스톡 용액, 37.5:1.0 아크릴아미드:비삼크릴라미드), 0.75 M 아미노카프로산, 50 mM 비스 트리스(pH = 7.0), 0.2% CL-47 세제로 구성된 저수지 챔버용 10 mL 용액을 준비합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>교반기를 시작하고 APS (암모늄 퍼옥소디설페이트, 10 % 스톡 용액)와 TEMED (N,N,N', N'N', N'-tetramethyl 에틸렌디아민)의 2.5 μl의 30 마이크로 리터와 2.5 마이크로 리터의 TEMED를 전면 챔버의 용액에 추가합니다. 펌프를 시작하고 전면 밸브를 엽니 다 (흐름은 10 분에서 주조를 완료하도록 조정되어야한다). 1분 후 90 μL의 APS 및 5 μL의 TEMED를 저수지 챔버 내의 용액에 추가하고 챔버 연결을 엽니다.</li>
		<li>겔이 실온(RT)에서 적어도 24시간 동안 천천히 또는 철저하게 중합되도록 하여 균일한 공극 크기 구배를 생성한다. 촉촉하게 유지되면 중합 겔을 4°C에서 최대 1주일 동안 똑바로 보관할 수 있습니다. 참고: 의도적으로 젤 의 상단은 부드럽고 끈적끈적한 일관성을 갖습니다. 이것은 나중에 제거될 것입니다 그러나 그렇지 않으면 이주 유물로 이끌어 낼 수 있는 단백질 침전의 최소한의 리스크와 함께 젤로 단백질의 원활한 진입을 허용합니다 (즉, 줄무늬 또는 단백질 침전).</li>
	</ol>
</li>
	<li>시료 준비 및 로딩<ol>
<li>0.5-2.0 mg의 단백질을 분리하기 위해 유리 판 사이에 적절한 스페이서(예: 실리콘 튜브)를 삽입하여 로딩 슬롯을 준비합니다. 슬롯은 적어도 3cm 너비 (또는 더 나은, 5-6cm 폭)를 만들어야한다.</li>
		<li>1% (w/v) 비변성 세제(ComplexioLyte CL-47)를 함유하는 2 mL의 용해성 충액에서 30분 동안 얼음에 담출 ~2.5 mg의 멤브레인(마우스 신장 내몸 농축 제제)을 용해시켰다. 초원심분리기(침전 컷오프 = 200 S 이하; 130,000 x g/11분 사용). </li>
		<li>400,000 x g에서1 시간 동안 초원심분리에 의해 짧은 50 % / 20 %(w / v, 0.3 ml 각) 자당 스텝 그라데이션에 용해염을 집중시다. 최종 단백질 수율은 적어도 1 mg이어야 한다.</li>
		<li>0.05% (v) 쿠마시 G-250을 용해염에 넣고 젤에 샘플을 적재합니다. 단백질 부하를 10-15 μg/mm2 젤 레인 단면으로 제한하여 고분해능을 얻고 단백질 침전으로 인한 아티팩트를 피하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BN-PAGE 실행 조건<ol>
<li>완충액을 실행하기 위해 50 mM 트리신, 15 mM 비스 트리스 및 0.01 % Coomassie G-250으로 구성된 표준 음극 버퍼를 준비하십시오. 50 mM 비스 트리스 (pH = 7.0)로 구성된 표준 양극 버퍼를 준비합니다.</li>
		<li>10°C에서 10°C에서 3단계 전압프로토콜(13)으로 구성된 3단계 전압 프로토콜을 사용하여 하룻밤 동안 준비된 BN-PAGE를 실행합니다: 100V에서 30분 동안 의 평형 단계를, 그 다음에 는 완충전압(40-50 V/cm 젤 길이)에 대한 경감(3시간) 램프로 최종적으로 6시간 이상 유지됩니다. 단백질의 끝점 초점. 참고: 이동 전선이 젤의 중간에 도달하면 전기 동극을 일시 중지하고 Coomassie G250없이 새로운 버퍼로 음극 버퍼를 교환하는 것이 좋습니다. 이것은 매트릭스 기공 구조의 국부 붕괴로 인한 겔내의 침전 아티팩트를 피하는 데 도움이 된다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 젤 샘플링 및 소화
<ol><li>젤 레인 의 절제<ol>
<li>실행 후, 유리 판 사이에 유지하면서 문서화 목적을 위해 젤을 스캔합니다.</li>
		<li>플레이트를 분해하고 관심 있는 차선 섹션을 절제합니다.</li>
		<li>2D BN/SDS-PAGE 및 단백질 염색 또는 서부 블로팅(그림 1B에나타난 바와 같이)에 의한 분석을 위해 차선의 샘플 스트립을 사용하여 관심 영역, 효과적인 복합 크기 분해능 및 단백질 풍부도를 결정합니다.</li>
		<li>30%(v/v) 에탄올과 15%(v/v) 아세트산으로 30분 이상 선택한 젤 레인을 두 번 고정합니다.</li>
		<li>샘플을 임베딩 배지로 옮기고 4°C에서 적어도 2시간 동안 담그고 평형화할 수 있도록 하면서, 겔 슬래브를 궤도 셰이커에서 슬로우 모션으로 유지합니다. 참고: 겔 분리는 전체 적인 분리 품질 및 마이그레이션 아티팩트에 대해 신중하게 검사해야 합니다. 지배적인 단백질을 나타내는 젤 밴드는 왜곡이 없고 강도가 균일해야 합니다. 젤의 국소 아티팩트는 절제하거나 분석에서 제외해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>포함 및 저온 마이크로토메 슬라이스 참고 : 이것은 8cm11의넓은 젤 레인을 포함하고 슬라이스 할 수있는 이전에 설명되고 사진 으로 문서화 된 포함 절차의 개선 된 버전입니다.<ol>
<li>첫째, 고정 젤 레인을 단백질 이동 전면/밴드 패턴과 정확히 평행한 섹션(여기, 3cm)으로 자른다. 취급이 용이하면 각 섹션을 동일한 치수의 플라스틱 필름 지지체에 놓습니다.</li>
		<li>레인을 스토퍼가 있는 열린 튜브로 옮기십시오(하단에 닫혀 있고, 상단에 중앙천공으로 천공되어 있으며, 모두 젤 섹션의 상하단과 정확하게 정렬됩니다).</li>
		<li>실린더를 액체 질소에 잠시 담그고 빠르게 응고를 시작합니다. 투명 임베딩 매체는 몇 초 안에 굳어지고 색상이 흰색으로 바어집니다.</li>
		<li>캐비티를 임베딩 배지로 채우고 액체 질소에 잠시 담근 다음 몇 시간 동안 -20 °C에서 실린더를 얼입니다. 참고: 액체 질소에 담그어 실린더를 빠르게 냉각하면 튜브 내의 젤 슬래브의 변위를 방지하는 데 도움이 됩니다. 다음 MS 분석에서 높은 해상도를 보장하려면 왜곡을 피해야 합니다.</li>
		<li>분해 후, 플라스틱 필름을 제거하고 임베디드 젤 섹션으로 블록을 평평한 지지체(즉, 페트리 접시)에 놓고 실린더 외부에 임베딩 매체로 밀봉하여 직경이 더 큰 냉각된 금속 실린더로 옮김을 옮니다. 임베딩 매체로 실린더를 채우고 완전히 얼립니다.</li>
		<li>이 절차를 원통의 다른 면과 함께 반복하여 평면 표면이 있는 솔리드 블록을 가져옵니다.</li>
		<li>실린더에서 블록을 제거하고 미리 냉각 된 금속 홀더에 매포로 붙이고 저온 분쇄기 (저온 광석)에 홀더를 삽입하십시오. 블록의 표면은 슬라이싱 평면과 관련하여 신중하게 정렬되어야 합니다. 슬라이싱 공정(여기--15°C)에 대한 최적의 온도에서 평형을 허용합니다. 참고: 임베디드 젤 섹션의 표면에 부딪을 때까지 0.1 mm 스텝 크기의 천천히 진행되는 수동 슬라이스 사이클을 사용하여 올바른 포지셔닝을 보장합니다.</li>
		<li>젤 슬라이스를 각각 수확하고 최종 원하는 두께0.25 mm 스텝 크기로 수확하고 단백질 결합 특성이 낮은 반응 튜브로 개별적으로 옮김을 전달합니다. 참고: 이 셋업에서는 균일한 젤 슬라이스를 0.1mm, 두께0.5mm로 쉽게 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>트립틱 소화<ol>
<li>겔 슬라이스를 광범위하게 세척한 후 인-겔 트립틱 소화를 수행(적어도 3회 이상의 추가 세척은 임베딩 배지의 중합체 성분을 제거하는 것이 좋습니다)에 따라 표준 절차11.</li>
		<li>진공 건조 용출 펩티드를 0.5% (v/v) 삼불환아제산에서 37°C(10분)에서 흔들어 서 목욕 초음파 처리(5분) 및 간략한 원심분리를 다시 용해시켰다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 질량 분석법
<ol><li>나노HPLC 및 MS 설정<ol>
<li>고분해능의 질량 분석계에 결합된 (분할 프리) 나노 HPLC를 사용하여 0.05%(v/v) 삼불소화아세트산으로 C18 프리컬럼(입자 크기 = 5 μm; 직경 = 300 μm)에 소화된 샘플을 로드합니다.</li>
		<li>수성 유기 그라데이션 (eluent A)으로 펩티드를 포획 : 5 분 3 % B에서 3 % B에서 30 % B까지 120 분, 30 % B에서 99 % B까지 20 분, 5 분 99 % B, 99 % B에서 5 분, 15 분 3 % B (유량 = 300 nL / min). 참고: csBN-MS 젤 슬라이스는 전형적으로 낮은 중간 펩티드 풍부하고 복잡성의 한정된 정도를 가진 견본 귀착됩니다. 따라서 nanoLC-MS/MS 해석은 합리적인 감도 및 시퀀싱 속도, 높은 질량 해상도(>100,000) 및 최대 동적 범위(효과적으로 3-4배의 크기)를 제공하는 셋업으로 수행되어야 합니다. 그러나 3h를 초과하는 긴 열 치수 또는 용출 그라데이션이 필요하지 않습니다.</li>
		<li>방사체(즉, 75 μm; 팁 = 8 μm)에서 용출된 펩티드를 C18 물질로 약 20cm 수동으로 포장하였다(입자 크기 = 3 μm). 2.3 kV (양성 이온 모드)에서 시료를 질량 분광기의 가열 된 전사 모세관 (250 °C)에 전기 분무하십시오.</li>
		<li>다음 계측기 설정11: 최대 MS/MS 주입 시간 = 400 ms; 제외 기간 = 60s; 최소 신호 임계값 = 5,000카운트, 상위 10개 전구체 조각화; 격리 폭 = 1.0 m/z). 참고: 많은 수의 데이터 세트 또는 측정에서 펩타이드 신호의 질량, 보존 시간 및 할당을 용이하게 하기 위해 매개 변수 및 하드웨어의 중단이나 변화 없이 각 MS 측정 계열을 수행하는 것이 좋습니다. 즉, 동일한 C18 열/방사체에서 확인할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>단백질 식별 (MS 데이터는 앞서 설명한 대로평가 11)<ol>
<li>"msconvert.exe" 도구(ProteoWizard의 일부)를 사용하여 조각 이온 스펙트럼에서 피크 목록을 추출합니다.</li>
		<li>50 ppm 펩티드 질량 허용 오차를 가진 예비 데이터베이스 검색에서 단백질에 할당된 모든 펩티드의 중앙값 m/z 오프셋에 의해 각 데이터 세트에 대한 모든 전구체 m/z 값을 이동합니다.</li>
		<li>UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스(릴리스 2018_11)의 모든 마우스 항목에 대해 적합한 검색 엔진(여기, 마스코트 2.6.2)으로 수정된 피크 목록을 검색합니다.</li>
		<li>"아세틸 (단백질 N-기간)", "카르바미도메틸 (C)", "Gln | 파이로 글루 (N-기간 Q), 글루 | 파이로 글루 (N-기간 E)", "산화 (M)", 및 "프로피온 아미드 (C)"가 변수 수정으로.</li>
		<li>펩티드 및 단편 질량 내성을 ±5 ppm 및 ± 0.8 Da로 설정하고, 놓친 트립틱 절단을 각각 허용한다. 펩타이드 식별에 대한 예상 값 컷오프를 0.5 이하로 설정합니다. 미끼 데이터베이스 검색을 사용하여 거짓 긍정 검색 속도(FDR)를 결정합니다. FDR을 1%로 설정하거나 신뢰할 수 있는 식별을 보장하기 위해 추가 품질 기준을 적용합니다. 참고: 제시된 실험은 3,500개 이상의 단백질을 확인하였고, 평균 펩타이드 FDR은 4.4±0.77% (n = 101슬라이스 샘플) 또는 펩티드 FDR이 1%로 설정된 경우 3,000개의 단백질을 확인하였다. 중요한 것은, 프로파일된 단백질(2,568)의 선택을 위해 보다 엄격한 기준을 사용하였다. 101개의 슬라이스 샘플 중 적어도 하나에서 적어도 2개의 펩티드로 확인된 모든 단백질, 적어도 1개 이상의 단백질 특이적 단백질을 포함하였다.</li>
	</ol></li>
	<li>단백질 정량화<ol>
<li>FT 전체 스캔에서 얻은 단백질 정량화를 위해 펩타이드 신호 강도(피크 볼륨[PV])를 사용하고 적절한 소프트웨어를 사용하여 유지 시간 및 질량 이동을 교정합니다(여기, MaxQuant v1.6.3).</li>
		<li>LOESS 회귀를 사용하여 MS 데이터 세트를 하나씩 참조(총 평균) 펩티드 용출 시간을 정렬합니다. 펩티드에 직접(MS/MS 기반 식별) 또는 간접적으로(즉, 매우 좁은 허용 오차 내에서 일치하는 m/z 및 용출 시간을 기준으로)에 PV를 할당합니다. 참고: 이 프로토콜은 "삽입된" 펩티드를 할당하기 위해 사내 소프트웨어를 사용합니다. 설정 매개변수는 각각 ±2 ppm 및 ±1분의 유효 m/z 및 용출 시간 매칭 허용오차를 초래합니다(도 2A, B참조).</li>
		<li>펩티드 하중 및 이온화 효율의 체계적인 실행-실행 변동에 대한 정확한 펩티드 강도 재조정은 인접한 슬라이스 샘플 간의 상대적 펩티드 강도의 중간 차이로부터 계산됩니다(그림2C).</li>
		<li>내부 PV 일관성 분석으로 식별된 이상값 및 나머지 가양성 할당에 대한 PV 데이터를 필터링합니다.</li>
		<li>상대적인 펩티드 풍부 프로파일을 산출하는 모든 슬라이스 데이터 세트에 걸쳐 각 펩티드의 PV를 최대 값으로 정규화합니다.</li>
		<li>마지막으로, 상대 단백질 풍부 프로파일을 3개의 연속된 슬라이스의 창에서 가장 좋은 상관 관계 펩티드 프로파일의 적어도 2개(최대 6~50%)의 평균으로 계산합니다. 이렇게 하면 누락된 PV 값을 연결하고 노이즈를 줄일 수 있습니다. 참고: 이것은 마침내 2,545 (2,568의 미리 선택된) 단백질 단면도 귀착되었습니다(그림 2D).</li>
	</ol></li>
	<li>단백질 복합체의 특성화<ol>
<li>먼저 로컬 맥시마 방법을 사용하여 피크 검출을 수행하여 단백질 프로파일을 분석하고, 이러한 피크에 정규 분포를 연속적으로 맞추고, 최대값과 FWHM의 위치(즉, 슬라이스 지수 또는 명백한 복합 크기)를 산출합니다(전체 폭에서 (그림 4의 인세트) 값(그림 4의인세트)을 참고: 데이터 집합에서 프로필은 사용자 지정 스크립트를 사용하여 자동으로 분석됩니다. 가장 작은 FWHM 값은 접근법의 유효 크기 분해능을 나타냅니다(여기, 6 x 0.25 = 1.5mm).</li>
		<li>log10(예측 된 분자 질량) 값의 선형 회귀 분석을 위해 정의된 분자 질량(UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스에 보고된 대로)을 가진 참조 단백질 복합 피크를 사용하여 슬라이스 수 인덱스를 명백한 분자 크기(즉, kDa에서 명백한 복잡한 크기). 참고: 샘플 내의 23개의 마커 복합체는 본 연구에서 선택되었다(도 4)프로파일 피크의 단색 분산 형상, (ii) 분자량의 실험 적 지지체, 및 (iii) 조사된 BN-PAGE 겔 섹션을 따라 분포.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-secretase+is+a+membrane+protein+complex+comprised+of+presenilin,+nicastrin+Aph-1,+and+Pen-2.">Gamma-secretase is a membrane protein complex comprised of presenilin, nicastrin Aph-1, and Pen-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6382-6387 (2003).</li><li>Hong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+PIG-U+and+yeast+Cdc91p+are+the+fifth+subunit+of+GPI+transamidase+that+attaches+GPI-anchors+to+proteins.">Human PIG-U and yeast Cdc91p are the fifth subunit of GPI transamidase that attaches GPI-anchors to proteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1780-1789 (2003).</li><li>Van Damme, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+ATP6V1E1+or+ATP6V1A+Cause+Autosomal-Recessive+Cutis+Laxa.">Mutations in ATP6V1E1 or ATP6V1A Cause Autosomal-Recessive Cutis Laxa.</a> The American Journal of Human Genetics. 100 (2), 216-227 (2017).</li><li>Budenholzer, L., Cheng, C. L., Li, Y., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+Structure+and+Assembly.">Proteasome Structure and Assembly.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3500-3524 (2017).</li><li>Heusel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex-centric+proteome+profiling+by+SEC-SWATH-MS.">Complex-centric proteome profiling by SEC-SWATH-MS.</a> Molecular Systems Biology. 15 (1), e8438 (2019).</li><li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Forster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome.">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nature Methods. 9 (9), 907-919 (2012).</li></ol>

저자 우베 슐테는 이 연구에 사용된 콤플렉스리테(ComplexioLyte) 47을 생산하는 로고팜 GmbH의 직원이자 주주이다. 이 회사는 비영리 적 근거로 교육 기관에 ComplexioLyte 시약을 제공합니다.

제시된 연구 결과는 이전에 미토콘드리아 제제11로 벤치마킹된 csBN-MS 기술에 기초하고 견본 준비, 젤 처리 및 MS 데이터 평가에 있는 개선을 통합했습니다. 대규모 분리 BN-PAGE 겔의 섹션에 대한 집중 분석은 미토콘드리아 멤브레인을 가진 연구에 필적하는 품질 측정값을 보여주는 포괄적인 데이터 세트를 제공했습니다. 질량 및 유지 시간 오류뿐만 아니라 실행 -투 - 실행 변이가 매우 낮게 유지되었고 신뢰할 수있는 단백질 풍부 프로파일을 결정하기위한 기초를 제공했습니다. 크기 분해능은 6개의 슬라이스(1.5mm에 해당, 도 4에해당)의 절반 최대 피크 폭과 10% 미만의 상대크기 차이로 양호한 것으로 나타났습니다(그림3, 그림 5A). 이러한 값은 미토콘드리아의 이전 csBN-MS 분석의 크기 분해능 품질을 완전히 충족시키지 못했지만(선택된 더 작은 겔 샘플링 단계 크기에도 불구하고), 기존의 BN-MS 또는 크기 배제 MS의 성능보다 훨씬 우수합니다. 최근 인기를 끌고 있는20.
2D BN/SDS-PAGE 웨스턴 블롯 해석으로는 거의 해결할 수 없는 도 3(TPC1 관련 복합체 사용)의 시뮬레이션 실험에서 고효율 복합 크기 분해능의 중요성이 강조됩니다(그림1B). 이러한 결과는 이 경우 0.25mm 슬라이싱으로 인해 일부 오버샘플링이 발생했지만, 이는 여전히 유효 크기 분해능을 손상시키지 않으면서 "정량화 노이즈"를 제거하는 데 유용하다고 입증되었습니다. 따라서, 이전결과(11)에따라, ~0.3 mm의 샘플링 단계 크기는 일반적으로 권장된다.
특히, TPC1 관련 복합체의 차별은 종래의 BN-MS5,6에서수동 슬라이스에 의해 제공되는 가장 작은 단계 크기인 1 mm 겔 샘플링으로 완전히 손실된다. 이것은 강력한 MS 기술이 유효하고 있음에도 불구하고, 아주 몇몇 단백질 복합체 및 소단위가 복합체 프로파일링에 의해 de novo 확인되었다는 사실을 설명할 수 있습니다. csBN-MS는 좋은 해결 력 외에도 높은 다기능성을 제공합니다. 50 kDa에서 여러 MDa에 이르는 막 결합 복합체 및 수용성 단백질 복합체는 최소 바이어스11을사용하여 단일 실험에서 효과적으로 해결될 수 있다. 이것은 특정 크기 범위 또는 전하 속성을 가진 수용성 단백질의 하위 세트로 작동하는 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피와 같은 복합체 프로파일링에 사용되는 대체 분리 기술과 대조됩니다. 단점으로는 csBN-MS는 확장성이 낮으며(젤당 최대 하중 ~3 mg 단백질), 기술적으로 어려울 수 있으며 자동화할 수 없습니다.
전반적으로, 결과는 csBN-MS 기지를 둔 복합체 프로파일링이 비 미토콘드리아 표적에 성공적으로 적용될 수 있다는 것을 보여줍니다 그러나 또한 몇몇 관련되는 도전을 표시합니다. 따라서, 단백질 복합체의 효율적인 추출 및 생화학적 안정성은 보다 최적화되고, 세척 단계가 필요하며, 여전히 제한될 수 있다. 조사된 크기 창 내에서, 미토콘드리아 샘플에 비해 잘 집중된 단분산 단백질 복합체의 수는 실제로 상당히 낮았다(데이터는 도시되지 않음). 또한 허용 가능한 겔 분리를 얻기 위해 BN-PAGE 샘플 부하를 낮추는 것이 좋습니다. 하중이 높을수록 슬라이스를 위해 제대로 처리하기 어려운 더 넓은 젤 레인이 필요할 수 있습니다(함께 제공되는 비디오 참조). 더욱이, 시료의 단백질 복잡성은 미토콘드리아 유래 슬라이스 다이제스트보다 더 높았으며(약 2배) 더 많은 PV 값과 감소된 동적 범위로 이어졌다. 실제로, 도 5에 나타난 복합체의 일부가 될 것으로 예상되는 일부 작은 단백질은 분석에서 누락되었다. 이러한 문제는 더 빠르고 민감한 MS 계측기 또는 데이터 독립적 수집 모드를 사용하여 향후 해결될 수 있습니다.
시료 전제제는 단백질 복합성 검색, 안정성 및 젤 분리 품질에 매우 중요합니다. 파라미터 및 절차는 각 소스 조직, 세포 용해, 막 (분획) 및 관심 단백질 복합체에 대해 최적화되어야 합니다. csBN-MS의 응용 프로그램을 확장하는 데 도움이 될 수 있는 다음과 같은 일반적인 권장 사항이 제공됩니다.
(i) 신선한 샘플을 준비하고 온난화 / 동결, 강한 희석, 버퍼 조건의 변화 및 불필요한 지연을 피하십시오.
(ii) 본질적으로 염이 없는 완충제(500-750 mM 베타인 또는 아미노카프로산으로 대체), 중성 pH에 대해, 비변성 세제의 최대 1%(w/v)를 함유하고 있는 비변성 세제(단백질:1:10 사이의 세제 비율 1:4-10) 단백질 복합체, 수용성 단백질 복합체에 필요한 세제 없음);
(iii) 분석 BN-PAGE에 의한 세제 조건의 신중한 테스트 및 조정은 복잡한 용해의 효율, 시료의 막 단백질 복합체의 표현, 안정성 및 균질성에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 단백질 세제 미셀. 후자는 BN-PAGE 젤에 뚜렷한 밴드/복잡한 인구로 초점을 맞추기 위한 단백질을 위한 전제 조건입니다. 이전 문헌은 광범위한 중성 세제를 제공합니다. 그러나, DDM (n-dodecyl β-d-maltoside)1,2,4,5,6, 디지토닌3,5,7,8, 9,10,13,18은 지금까지 BN-MS 분석을 위한 가장 인기 있는 선택이었습니다. 임의의 세제 조건은 용해 효율과 단백질 상호 작용의 보존 사이의 절충을 나타내며 모든 유형의 표적 단백질 및 공급원 물질에 동등하게 적합하지 않을 수 있음을 강조해야 합니다.
(iv) 피브릴, 필라멘트, 폴리리신, DNA 및 풍부한 저분자 성분(즉, 대사산물, 지질 또는 펩타이드)과 같은 충전된 폴리머를 제거합니다. 이것은 초원심분리, 젤 여과, 또는 투석에 의해 달성될 수 있습니다. 이것은 총 세포 또는 조직 용해물특히 중요합니다;
(v) 쿠마시 G-250 추가 (최종 농도 0.05%-0.1%) 그리고 자당 (로딩을위한 밀도를 높이기 위해, 최종 농도 10 %-20 % [w /v]) 로딩 직전에 샘플에, 짧은 초원심분리에 의해 취소, 교란없이 샘플을로드하고, 그 후 즉시 실행을 시작합니다.
미래의 관점에서, csBN-MS 기반 의 안색 프로파일링은 특정 생물학적 조건과 관련된 단백질 복합 역학 또는 변화를 연구하기 위해 다중화에 대한 옵션을 제공합니다. 크기 배제 기반프로파일링(21)에 대해 제안된 바와 같이 대사표지된 시료의 결합분리는 간단해 보이지만, 사용된 분리와 는 별개로 발생하는 복합체에서의 자발적인 소단위 교환에 의해 방해받을 수 있다. 메서드. 또는, 라벨이 붙은 시료는 인접한 겔 레인에서 해결될 수 있으며, 이 차선은 높은 감도와 견고성을 갖춘 차동 분석을 위해 공동 슬라이스 또는 결합후 소화를 할 수 있습니다.

BN-PAGE 분리는 먼저 BN-PAGE 겔 레인의 수동 슬라이스를 사용하여 Majeran1 및 Wessels2 연구 그룹에 의해 LC-MS 분석(BN-MS)에 직접 결합되었습니다. 그들의 분석은 식물 석고와 HEK 세포 미토콘드리아에서 알려진 소단위 조성물을 가진 풍부한 막 단백질 복합체의 수를 각각 확인했습니다. 그러나 이러한 분석은 포괄적인 분석과는 거리가 멀었고 새로운 어셈블리를 편견 없이 식별할 수 없었습니다. 질량 분석기 및 라벨없는 정량화 방법의 성능은 그 이후로 상당히 향상되어 포괄적 인 BN-MS 분석을 가능하게했습니다. 이것은 용어 "복합프로파일링"을 만들어 주었습니다. 예를 들어, Heide와 동료들은 464개의 미토콘드리아 단백질을 식별하고 클러스터링하여 많은 알려진 어셈블리를 확인하여 쥐 심장 미토콘드리아를 분석했습니다. 또한, 그들은 TMEM126B가 특정 어셈블리 컴플렉스3의참신규하고 중요한 하위 단위로 발견했습니다. 비교 결과 (와 437 미토 콘 드리 아 단백질 프로필) HEK 세포 미토 콘 드리 아의 병렬 연구에서 얻은4.
이러한 개선에도 불구하고, 복잡한 프로파일링을 위한 BN-MS의 잠재력을 최대한 억제하는 몇 가지 문제가 남아 있습니다. 주요 제한은 두 가지 요인에 의해 결정되는 복합체의 유효 크기 분해능입니다: (i) BN-PAGE 분리의 품질, 이는 겔 매트릭스 기공 구배의 균일성뿐만 아니라 시료 복합체의 안정성/용해도에 따라 달라집니다. (ii) 기존의 수동 슬라이스5,6을사용할 때 최고의 1mm인 겔 샘플링의 단계 크기. 가난한 크기 해상도는 미묘한 복잡한 등소폼과 이질성을 놓칠뿐만 아니라 편견없는 de novo 하위 단위 할당 및 정량화의 동적 범위와 신뢰도에 부정적인 영향을 미칩니다.
그밖 과제는 질량 분광 분석에 의하여 견본에 있는 단백질 풍부의 실제 동적 범위의 단백질 정량화 그리고 엄호의 정밀도를 포함합니다. 따라서 BN-MS 복합체 프로파일링의 적용은 복잡성이 낮고, 표적 복합체의 발현이 높으며, 용해 특성(즉, 플라스티드, 미토콘드리아) 및 미생물)6,7,8,9,10.
우리는 최근에 포괄적인 MS 분석및 높은 단백질 단면도의 측정을 위한 정교한 MS 데이터 처리를 가진 BN-PAGE 젤 레인의 정밀한 서브 밀리미터 샘플링을 결합한 저온 균 슬라이스 지원 BN-MS (csBN-MS)를 소개했습니다. 신뢰도 11. 쥐 뇌로부터미토콘드리아 막 제제에 적용하여 이전에 충족되지 않은 유효 복합크기 분해능 및 산화호흡사슬 복합체(OXPHOS) 소단위(즉, 90MS-접근성)의 최대 커버리지를 입증하였다. 이 예는 또한 다수의 신규한 단백질 어셈블리를 확인했습니다.
여기서 설명한 것은 단백질 복합체의 예비 규모 BN-PAGE 분리(특정 생물학적 공급원에 국한되지 않음), 대형 예비 BN-PAGE 겔 주조, 광범위한 겔 레인의 극저온 균사체 슬라이스 및 MS 데이터에 대한 최적화된 절차입니다. 처리. 고분해능 프로파일링의 성능은 마우스 신장 내인성 농축 막으로부터의 단백질 복합 제제에 대해 입증된다. 마지막으로, 질량 분광 정량화의 분해능 및 정밀도 증가의 이점에 대해 논의합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>#1610158</td>
			<td>Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>#1610154</td>
			<td>Recommended for acrylamide gradient gel solutions &#62;13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby Protein Blot Stain</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>#1703127</td>
			<td>Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Serva</td>
			<td>no. 35050</td>
			<td>Centrifugate stock solutions prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ComplexioLyte 47</td>
			<td>Logopharm</td>
			<td>CL-47-01</td>
			<td>Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Medium / Tissue Freezing Medium</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14020108926</td>
			<td>Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>any supplier, important for making gel section embedding tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>broad razor blade</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal tube / cylinder, ca. 4 cm long</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>mold for embedding and freezing of gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Nr. 0030108116</td>
			<td>highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing-grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 &#181;m</td>
			<td>Dionex / Thermo Scientific</td>
			<td>P/N 160454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoTip emitter (i.d. 75 &#181;m; tip 8 &#181;m)</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>FS360-75-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 &#181;m)</td>
			<td>Dr. Maisch GmbH</td>
			<td>r13.93.</td>
			<td>columns packed manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-TPC1 antibody</td>
			<td>Gramsch Laboratories</td>
			<td>custom production</td>
			<td>described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>CY-1300</td>
			<td>described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>#B1325</td>
			<td>described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-microtome Leica CM1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047743905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean II Cell with wetblot unit</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penguin Midi Gel Electrophoresis System</td>
			<td>PeqLab</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>for BN-PAGE (not sold any more)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera</td>
			<td>Zeiss / Photometrics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump (IP high precision multichannel)</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM940</td>
			<td>for casting of gradient polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gradient mixer with stirring (two chambers)</td>
			<td>selfmade, alternatively Bio Rad</td>
			<td>1652000 or 1652001</td>
			<td>for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor</td>
			<td>Sorvall / Thermo Scientific</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>for sample preparation (not sold any more)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano HPLC</td>
			<td>Dionex / Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Elite mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMAZQ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution complexome profiling by cryoslicing bn-ms analysis

단백질은 일반적으로 다른 단백질과의 상호 작용을 통해 생물학적 기능을 발휘, 동적 단백질 어셈블리또는 안정적으로 형성 된 복합물의 일부로. 후자는 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(BN-PAGE)을 사용하여 분자 크기에 따라 우아하게 해결될 수 있다. 이러한 분리를 민감한 질량 분석법(BN-MS)에 결합하는 것은 잘 확립되었으며 이론적으로 생물학적 샘플에서 추출 가능한 복합체의 철저한 평가를 가능하게 합니다. 그러나 이 방법은 다소 힘들고 제한된 복잡한 크기 해상도및 감도를 제공합니다. 또한, 그것의 응용 프로그램은 풍부한 미토 콘 드리 아 및 석 고 단백질에 제한 남아 있다. 따라서, 단백질의 대다수를 위해, 안정한 단백질 복합체로의 통합에 관하여 정보는 아직도 부족합니다. 여기에 제시된 것은 예비 규모 BN-PAGE 분리, 저온 마이크로톤 슬라이싱에 의한 넓은 겔 레인의 서브 밀리미터 샘플링, 라벨없는 단백질 정량화를 통해 질량 분광 분석으로 구성된 복합체 프로파일링을 위한 최적화된 접근법입니다. 중요한 단계에 대한 절차와 도구에 대해 자세히 설명합니다. 응용 프로그램으로, 보고는 마우스 신장에서 용해된 endosome 농축된 막 분획의 복합성 분석을 기술합니다, 총 2,545개의 단백질을 단면도했습니다. 이 결과는 세포내 이온 채널과 같은 균일하고 풍부한 막 단백질뿐만 아니라 글리코실화 이소폼을 포함한 고분해능, 복잡한 단백질 조립 패턴의 식별을 입증합니다. 결과는 독립적인 생화학 적 분석과 일치합니다. 요약하면, 이 방법론은 단백질 (슈퍼) 복합체 및 그 하위 단위 조성물의 포괄적이고 편견없는 식별을 허용하여 모든 단백질 복합체의 조직체측정법, 조립 및 상호 작용 역학을 조사하기위한 기초를 제공합니다. 생물학적 시스템.

기존의 BN-MS 연구의 대다수뿐만 아니라 최근에 확립 된 고해상도 csBN-MS 접근법은 (i) 쉽게 사용할 수있는 미토콘드리아 및 석고 제제에 적용되었으며, (ii) 복잡성이 제한적이며, (iii) express 표적 (막) 높은 밀도에서 단백질 복합체. 이 프로토콜은 저부단백질을 발현하는 비미토콘드리아 막에 고분해능 복합체 프로파일링의 적용을 확장하며, 복합체에 대한 통합에 대한 정보는 거의 없습니다. 데모 목적을 위해, 우리는 밀도 구배 원심분리에 의해 얻어진 마우스 신장에서 내인성 농축 막 준비를 선택했습니다.
이러한 제제의 최적화는 세포내 이온 채널을 주로 초기 및 재활용 endosomes12로형성하는 마커 단백질 TPC1에 의해 유도되었다. 또한 신장 조직 섹션의 면역 조직화학적 분석에 의해 도시된 바와 같이 신장 근위관 형 세포에서 높게 발현된다(도 1A). 이 멤브레인은 부드럽게 용해 (저단백질에서 콤플렉스 Lyte 47 : 세제 비율 1 :8) 초원심분리에 의해 자당 쿠션에 집중하였다. 후자는 예비 BN-PAGE 분리의 분해에 부정적인 영향을 미치는 경향이 과잉 낮은 분자량 구성 요소 (즉, 세제, 지질, 염, 유기 중합체 및 대사 산물)를 제거하기위한 중요한 단계로 밝혀졌다.
네이티브 1%-13% (w/v) 폴리아크릴아미드 그라데이션겔(도 1B,중간 패널)에 대한 복합분리는 거의 이동 유물을 가진 강하게 염색된 단백질 밴드를 보였다. SDS-PAGE 좁은 BN-PAGE 겔 스트립의분리(그림 1B,적색으로 박스형 프레임) 2차원으로, 서쪽 얼룩 분석이 뒤이어 뚜렷한 TPC1 관련 복합 집단의 잘 해결된 패턴을 보였다(그림1B , 상부 패널, 빨간색 화살표로 표시, 가장 가능성이 추가 단백질 하위 단위 및 / 또는 번역 후 수정과의 연관에서 유래 (글리코실화등 12). 관심의 3 cm 섹션은설명도 11에따라 극저온 균사에 대해 절제, 고정 및 처리되었다. 샘플링 중에 해상도를 유지하는 데 매우 중요한 이 절차의 개별 단계(특히 넓은 젤 섹션의 정확한 정렬)가 함께 제공되는 비디오에 설명되어 있습니다. 임베디드 겔 섹션은 최종적으로 0.25mm(도 1B,하부 패널)의 균일한 두께로 101개의 겔 슬라이스로 절단하였으며, 이는 고성능 LC 결합 질량 분석법에 의해 별도로 소화및 분석되었다.
크기 분해능 외에도 단백질 정량화의 품질은 성공적인 복합체 프로파일링을 위한 핵심입니다. MS 설정 및 설정이 사용된 경우, 샘플 분석은 매우 포괄적이었으며, 그 결과 슬라이스당 1,000개 이상의 단백질과 10,000개 이상의 펩타이드(8,200개)와 약 3,000개의 단백질 과 43,000개의 단백질을 평균적으로 식별할 수 있었습니다. 펩티드(그 중 38,500개)가 단백질 특이적이었습니다. 그럼에도 불구하고, 데이터 의존MS/MS 시퀀싱의 과대 론적 특성과 동적 범위의 한계로 인해 강도 정보는 여전히 덜 풍부한 단백질에 대해 단편적이었다. 따라서, 정교한 MS 데이터 처리절차(11)는전체 계열의 데이터 세트에 걸쳐 펩티드 신호(피크 볼륨 [PV] = m/z 및 시간에 걸쳐 통합된 펩티드 관련 신호 강도)의 정확한 할당에 기초하여 수행되었다.
그림 2A, B,보정 후 남아있는 질량 및 유지 시간의 펩티드 신호 편차는 MS 시퀀싱 및 간접적으로 할당 된 PV에 대해 동일했습니다 (95 %의 매우 좁은 허용 오차 및 <0.5 분의 매우 좁은 허용 오차 가양성 PV 할당에 대한 비율이 매우 낮다는 것을 나타냅니다. 나머지 이상값은 다른 관련 PV와의 일관성에 따라 필터링되었습니다. 모든 MS 측정은 매개 변수 또는 하드웨어 구성 요소의 변화 없이 동일한 LC-MS 설정에서 연속적으로 수행되었기 때문에 실행 간 변동(인접 슬라이스에 있는 샘플의 모든 PV 강도의 중앙값으로 결정). PV 데이터 세트의 크기 조정을 통해 작고 쉽게 제거되었습니다(그림2C). 생성된 펩티드 강도 정보는 2,545개의 단백질 상대적 풍부 프로파일을 재구성하는 데 사용되었다. 도 2D에도시된 바와 같이, 이들 단백질 프로파일의 75% 이상이 적어도 3개의 독립적인 단백질 특이적 펩티드를 기초로 하였다.
다음으로, 프로토콜은 단백질 복합체의 분해를 위한 BN-PAGE 겔 샘플링의 단계 크기의 관련성을 평가했다. 이를 위해 슬라이스 데이터 집합은 2개, 3개 또는 4개의 연속 슬라이스에서 PV 정보를 합산하여 0.5mm, 0.75mm 및 1mm의 스텝 크기에 대한 결과를 시뮬레이션합니다(0.25mm의 원래 샘플링과 비교). 도 3은 일례로서 단백질 TPC1에 대한 생성된 풍부 프로파일을 도시한다(A-D). 0.25 mm에서, TPC1 관련 복합 집단의 상대적 강도 및 크기분리(그림 3A)는서부 블롯 분석(도1B,상부 패널)의 결과와 잘 일치하였다; 비록, 프로파일은 정량화에 사용되는 PV 매트릭스에서 누락 된 값 ("간격")에서 주로 발생하는 약간의 노이즈를 보였다.
0.5 mm에 해당하는 두 개의 슬라이스의 결합은 TPC1 관련 복합체의 정확한 강도 및 분리를 유지하고 정량화 노이즈를 제거하였다(도3B). 반면, 0.75mm 및 1mm(그림3C,D)의더 큰 스텝 크기는 크기 해상도의 손실로 이어졌고 TPC1 복합 하위 모집단의 차별을 폐지했습니다. 기존의 BN-MS 분석의 대부분은 수동으로 2mm 슬라이스 (전체 젤 레인을 커버하기 위해 약 60)를 사용하여7,8,9,10을사용한다는 점에 유의해야한다.
분자 크기로의 이동 거리 또는 슬라이스 지수의 변환은 일반적으로 마커에 기초하여, 상업적으로 이용 가능한 네이티브 표준 단백질 또는 공지된 소단위 조성물을 가진 잘 특징적인 내인성 단백질 복합체(대부분 [super] 미토콘드리아 산화 호흡기 사슬의 복합체 [OXPHOS])13. 그러나 BN-PAGE 분리는 분자 질량뿐만 아니라 관련 지질, 세제 및 Coomassie 분자의 3D 구조 및 수에 의해 결정되는 효과적인 분자 단면을 기반으로하기 때문에 개별 단백질이 나타날 수 있습니다. 더 큰 편차. 따라서, 마커11로서더 큰 단백질 복합체 세트를 사용하도록 선택하였다. 그림 4의 플롯은 검은 색 원으로 표시된 대표 하위 단위가있는 23 개의 선택된 마커를 보여 주며, UniProtKB / Swiss-Prot 데이터베이스에 따라 예측 된 분자 질량의 log10 값을 나타냅니다. 해당 프로파일 피크 최대값의 슬라이스 인덱스입니다. 후자는 샤페론 BCS1을 사용하여 예를 보여주는 도 4의 인세트에 나타난 바와 같이, 상대적인 풍부도 데이터에 맞게 자동화된 가우시안으로부터 수득되었다. 선형 회귀(빨간색 선)는 조사된 겔 섹션을 따라 슬라이스 인덱스 값을 160-630 kDa범위의 명백한 분자 크기로 변환하는 기능을 제공했습니다.
마지막으로, 이 분석은 잘 특성화된 복합체에 대한 정보를 제공하고 새로운 하위 단위와 복잡한 어셈블리의 존재를 입증했습니다. 복합체의 상이한 양상을 강조하는 예는 도 5에 도시되어 있다(A-C: 단백질 발현 또는 바람직하게는 내인체 구획에 위치; D-F: 다른 세포 외 지역화에서 복합체). 철 운반 단백질 페리틴은 총 분자량이 440 kDa14 (그림 5A,채워진 화살표)인 24 개의 빛 (FRIL1) 및 / 또는 무거운 (FRIH) 소단위에서 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있습니다. 소단위 프로파일(그림 5A)은뚜렷한 무거운 / 경체인 stoichiometries (더 잘 스케일링 후 볼 수 있음)와 함께 적어도 두 개의 작은 형태의 단지 (360 kDa 및 340 kDa; 열린 화살표)의 존재를 제안합니다. 풍부, endosomes에 풍부 하 게 존재 하는 그림 5A)의inset.
반면, 니칼린-노모1 단지15(도 5D),감마-분비코어 복합체16(도 5B),및 GPI-트랜스아미다아제 기계류17(그림 5E)은고정된 것으로 나타났습니다. 전체 크기 범위에 걸쳐 그들의 핵심 하위 단위의 풍부한 비율 및 추가 단백질과의 연관에서 독립적. 이는 하위 단위가 서로 배타적임을 나타냅니다. Vacuolar H+-ATPases는 약 900 kDa의 총 분자량으로 모듈 식으로 20 개 이상의 하위 단위의 풀에서 조립 된 다단백질 복합체입니다. 그림 5C는 적어도 17개의 하위 단위에서 뚜렷한 조성물을 가진 하위 복합체를 보여 주며, 그 중 일부는 실험 조건에 의해 생성된 생물학적(디스) 어셈블리 중간체 또는 하위 복합체를 나타내며, 그 중 일부는 최근 BN-MS 연구에서 관찰18. 또 다른 다중 단백질 복합예는 프로테아좀19(도 5F)이다. 20S proteasome 코어를 형성하는 알파 및 베타 하위 단위의 풍부한 프로파일을 면밀히 검사하면 크기 (590 kDa 및 575 kDa, 회색 화살표로 표시)와 3 개의 베타 하위 단위의 통합이있는 두 가지 주요 복잡한 인구를 제안합니다.
요약하면, 내분형 이성신장막의 csBN-MS 복합체 프로파일링은 (i) 균일하고 낮은 표적 단백질을 복합체로의 통합, (ii) 일반 복합체 소단위 조성및 (iii) 복잡한 이질성, 하부 구조 및 (디스)어셈블리 중간체.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig1.jpg"> 도 1: 마커로서 세포내 채널 TPC1을 사용하여 마우스 신장으로부터 용해화된 내인성 농축 막의 예비 BN-PAGE 분리. (A)공초점 현미경검사법에 의한 신근위부에서 TPC1 단백질의 면역조직화학적 국소화. 녹색: 항-TPC1 항체12 염색이 이차 Cy3-생체화 염소 항토끼 IgG로 가시화; 빨간색: 근위 수혈 세포의 발광 표면을 표시하는 생체 연꽃 테트라놀로버스 렉틴 (LTL, 10 μg / mL, FITC-컨쥬게이션). 인세트는 음성 대조군으로서 TPC1-KO 신장으로부터 의 해당 섹션의 염색을 나타낸다. 백색 눈금 막대는 20 μm입니다. 또한 주목할 점은 세포내 소포에서 강력한 TPC1 발현이며, 독립적인 실험으로부터 공지된 초기 및 재활용 내인성12를나타낸다. (B)용해된 내인성 농축 막 2.5 mg의 예비 BN-PAGE 분리를 1%-13% (v) 폴리아크릴아미드 그라데이션 겔에. 좁은 차선(빨간색 프레임)을 연속 SDS-PAGE/웨스턴 블롯 분석(상부 패널)에 대해 잘라내어 다른 TPC1 관련 복합체 및 글리코실화 패턴(빨간색 화살표: 안티-TPC1/안티-토끼 HRP/ECL 프라임; 녹색: 위치 및 예측됨) 얼룩의 총 단백질 염색[SYPRO 루비 얼룩]에 의해 확인된 마커 단백질 복합체의 질량[MDa]. 오른쪽에서 왼쪽으로: Na+/K+-수송 ATPase, 시토 크롬 b-c1 복합 디머, ATP 신디아제, NADH:유비퀴논 옥시도레덕타아제. 겔 레인으로부터관심있는 3 cm 섹션을 절제하고, 조직 임베드 배지에 내장하고, 장착하고, 저온 미생물을 사용하여 단백질 이동 전선을 따라 101 단면도 (0.25 mm)로 슬라이스하였다(하부 패널; 비디오 링크 참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig2.jpg"> 그림 2: MS 신호 할당 및 정량화의 정확도와 분석 심도를 결정하는 주요 파라미터. (A)MS/MS 시퀀스(빨간 막대)의 m/z 교정 후 상대 질량 오차(ppm)의 분포와 간접적으로 할당(즉, 밀접하게 일치하는 질량 및 유지 시간에 따라, 프로토콜, 파란색 막대 참조) 펩티드 신호. 이는 최종 질량 오차 (신호/할당된 PV의 95%)와 거짓 긍정 할당의 매우 낮은 비율을 나타냅니다. (B)펩티드 신호의 용출 시간 정렬 후 총 평균으로부터 나노-HPLC 유지 시간 편차의 분포, Loess 회귀(프로토콜 참조) 및 색상 코딩(A)에서 사용되는 바와 같이. 시간 오차는 펩티드 신호/할당된 PV의 >95%에 대해 30s 미만이다.(C)두 인접 시료의 평균에 비해 플롯된 총 MS 강도의 실행-실행 변동. 이러한 스케일 팩터는 체계적인 기술적 오류를 최소화하기 위해 원시 PV 테이블에 적용되었습니다. (D)단백질의 상대적 풍부도 프로파일을 계산하는 데 사용되는 펩티드 정보. 이상치, 저조한 점수, 또는 단일 식별에 대한 단백질 특이적 펩티드를 필터링한 후(프로토콜 참조), 2,545개의 단백질 풍부 프로파일이 결정되었고, >75%는 합리적인 확신을 가지고 적어도 3개의 펩티드를 기초로 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig3.jpg"> 그림 3: TPC1의 컴플렉스 분해능에 대한 겔 샘플링에서스텝 크기의 중요한 영향. 데이터 집합은 1, 2, 3 및 4개의 연속적인 슬라이스(각각 A-D)의 그룹으로 신호 강도를 합산하여 결합되었으며 표시된 대로 젤 슬라이싱에서 서로 다른 단계 크기를 시뮬레이션하기 위해 동일하게 처리되었습니다. TPC1 프로파일은 0.25mm의 일부(오버샘플링) 노이즈를 보여 주지만 3개의 복잡한 모집단의 양호한 크기 해상도(그림 1B참조)는 0.5mm 스텝 너비로 크게 보존됩니다. 이 인구의 차별은 1mm가 접근되면 손실됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig4.jpg"> 그림 4 : 명백한 분자량의 결정. 정의된 분자 조성을 가진 23개의 마커 복합체(UniProtKB/Swiss-Prot에 따라 지시된 대로)를 크기 마커로 사용하였다. 예상 분자량(kDa)의 로그값은 표시된 대표적인 단백질 서브유닛(검은색으로 채워진 원)의 프로파일 피크 최대 슬라이스 지수. 이 데이터에 맞는 선형 회귀(빨간색 선)는 슬라이스 인덱스 값을 명백한 분자량으로 변환하는 함수를 제공했습니다. 피크 맥시마는 샤페론 단백질 BCS1에 대한 인세트(오른쪽)에 도시된 바와 같이 단백질 프로파일 피크에 자동화된 가우시안 적합에 의해 결정되었다(파란색의 1차 데이터, 주황색 선으로 표시된 경계에 맞는 경계, 적색 맞춤 기능). 또한, 이들은 1.5 mm 젤 주위에 걸쳐 가장 날카로운 초점 복합체와 피크 반 최대 폭 (녹색 선, 6.5 슬라이스, 또는 그림에 대한 1.6 mm)을 결정했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig5.jpg"> 그림 5: 단백질 복합 소단위 프로파일의 예. 상대 단백질 풍부 vs. 명백한 분자량은 페리틴(A)의무겁고 가벼운 사슬에 대해 플롯, 페리틴 소단위 stoichiometry의 분자 이질성을 공개, 풍부의 재 스케일링 후 더 명확하게 볼 수 (inset). 채워진 화살표와 열린 화살표는 각각 전체 복합체(440kDa)와 두 개의 복합체를 나타냅니다. 감마 분비체(B)하위 단위는 단일 코어 복합 집단에 정량적으로 통합됩니다. 공소체 H+-ATPases(C)의소복합체는 모두 endosomes로 표현된 별개의 소단위 조성을 가진 다중 어셈블리를 나타냈다. 노모1 및 니칼린단백질(D)은여러 복합체를 형성하는 다중 서브유닛 효소 기계인 배타적 복합체(GPI-트랜스아미다제)를 형성하였다. (E)20S proteasome 코어 복합체 표시(F)회색 화살표로 표시된 두 개의 인구와 미묘한 하위 복합체 패턴, 모든 다른 세포 지역화에서 유래. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

마이크로톰을 이용한 다목적 저온 분석 BN-MS 프로토콜이 고분해능 복합체 프로파일링을 위해 제시된다.

BN-MS 분석에 의한 고분해능 컴플렉스 프로파일링

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

csBN-MS 기술의 개발을 위한 핵심 목표는 다양한 유형의 조직 및 장기의 플라즈마 멤브레인을 가로질러 신호 전이를 뒷받침하는 단백질 복합체의 조직 및 조립에 대한 포괄적인 접근을 얻는 것이었습니다. csBN-MS는 현재 특히 막 단백질과 관련하여 토착 단백질 복합체 및 하위 단위 조성을 분석하기 위한 가장 높은 해상도의 다기능성을 제공합니다. csBN-MS 기술은 설치류 뇌에서 막 단백질 어셈블리의 복잡한 혼합물을 분석하기 위해 개발되었지만 모든 유형의 생물학적 시료의 분석에 쉽게 적응될 수 있다.우리의 방법의 주요 단계 중 하나는 젤 조각의 포함 및 슬라이스하기 전에 절단 평면에 올바른 정렬입니다. 이 분석의 해상도를 줄일 수 있기 때문에 찢어또는 젤을 압축하고 절단 평면에 기울어져 있지 않은 있는지 확인해야합니다. 우리의 csBN-MS 기술은 좋은 결과를 위해 중요한 몇 가지 실용적인 단계가 있습니다.단순히 설명하는 것보다 해당 단계를 자세히 수행하는 방법을 보다 쉽게 표시할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 펌프에 의해 구동되는 교반 2 챔버 그라데이션 믹서를 사용하여 선형 또는 고가모 그라데이션 젤을 캐스팅하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전면 믹싱 챔버 및 저수지 챔버에 대한 솔루션을 준비합니다.교반기를 시작하고 앞 챔버의 용액에 APS 30 마이크로리터와 2.5 마이크로리터의 TEMED를 추가합니다. 그런 다음 펌프를 시작하고 전면 밸브를 엽니다. 약 1분 후, 90마이크로리터의 APS와 5개의 마이크로리터를 저수지 챔버에 넣고 챔버 연결을 엽니다.젤이 실온에서 적어도 24시간 동안 천천히 철저하게 중합하여 균일한 모공 크기 그라데이션을 생성하도록 허용합니다. 촉촉하게 유지되면 중합체 젤은 최대 1 주일 동안 섭씨 4도에서 똑바로 보관 할 수 있습니다. 다음으로, 단백질의 0.5 와 2.0 밀리그램 사이를 분리하기 위한 유리 판 사이에 적절한 공간을 삽입하여 적재 슬롯을 준비합니다.슬롯의 너비는 3cm 이상이어야 합니다. 버퍼를 실행하기 위해 50 밀리머 트리신, 50 밀리모어 비스 트리스 및 0.01 %의 Coomassie G-250으로 구성된 서있는 음극 버퍼를 준비하십시오. 50 밀리몰러 비스 트리스로 구성된 표준 양극 버퍼를 준비합니다.약 2.5 밀리그램의 멤브레인과 2밀리리터의 용해도화 버퍼를 30분 동안 얼음에 1%의 비침하 세제를 함유하고 있습니다. 그런 다음 11 분 동안 130, 000 배 G에서 초원심 분리기. 1시간 동안 400G, 000배의 초원심분리로 짧은 50%20%의 자당스 스텝 그라데이션에 용해제를 농축합니다.그 후, 튜브의 바닥에서 자당 그라데이션을 수확하고, 0.05%의 쿠마시 G-250을 용해성염에 넣고, 젤에 샘플을 적재한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 3단계 전압 프로토콜을 사용하여 하룻밤 사이에 10도에서 사전 BN-PAGE를 실행합니다. 젤이 실행 된 후 유리 판 사이에 유지하면서 문서화 목적으로 젤을 스캔합니다.젤 분리의 품질을 검사합니다. 다음으로, 판을 분리하고 관심의 차선 섹션을 소비. 30%에탄올과 15%의 아세트산으로 차선을 30분 이상 두 번 수정합니다.중간 을 포함 시료를 옮기고 멜슬래브를 궤도 셰이커에 슬로우 모션으로 유지하면서 적어도 2시간 동안 담그고 평형화할 수 있도록 합니다. 그런 다음 고정 젤 레인을 단백질 마이그레이션 전면 또는 밴드 패턴과 정확히 평행한 섹션으로 잘라냅니다. 각 섹션을 동일한 차원의 플라스틱 필름 지지에 배치하여 취급이 용이합니다.차선을 맨 아래에 닫고 중앙에 천포처리된 스토퍼가 있는 열린 튜브로 이동하여 젤 섹션의 상하쪽과 하부와 정확하게 정렬됩니다. 실린더를 액체 질소에 잠깐 찍어 신속하게 응고를 시작하십시오. 투명 한 포함 매체는 몇 초 이내에 고형화 하 고 색상흰색이 된다.캐비티를 중간 크기로 채우고 실린더를 액체 질소에 잠깐 담근 다음 몇 시간 동안 영하 20도에서 철저히 얼립니다. 분해 후 플라스틱 필름을 제거하고 임베디드 젤 섹션으로 블록을 냉각 된 금속 실린더로 옮김합니다. 실린더는 직경이 크고 중간을 포함하여 외부에 밀봉됩니다.그것은 평면 지원에 배치됩니다. 실린더를 중간 크기로 채우고 앞에서 언급한 대로 철저히 동결하십시오. 이 절차를 실린더의 다른 쪽과 함께 반복하여 코플러너 바닥 표면이 있는 솔리드 블록을 얻습니다.그런 다음 실린더에서 블록을 제거하고 중간을 포함하여 미리 냉각된 금속 홀더에 붙입니다. 금속 홀더를 냉동 기계에 삽입합니다. 홀더는 슬라이스 평면에 대해 신중하게 정렬해야합니다.블록이 슬라이스 공정에 대해 최적의 온도로 평형화되도록 합니다. 이 수확 후 젤은 0.25 밀리미터의 최종 원하는 두께로 차례로 슬라이스하고 낮은 단백질 결합 특성을 가진 반응 튜브로 개별적으로 전달합니다. 그런 다음, 슬라이스는 트립틱 다이제스트 및 질량 분광 분석을 받게 됩니다.이 프로토콜은 저분단백질을 발현하는 비미토콘드리아 막에 고해상도 안성 프로파일링의 적용을 확장합니다. 복잡한 분리는 매우 작은 이동 유물과 강하게 얼룩진 단백질 밴드를 보여줍니다. 질량 및 유지 시간에 펩티드 신호의 편차는 거짓 양성 피크 볼륨 할당에 대한 매우 낮은 속도를 나타냅니다.최대 볼륨 데이터 집합의 다시 배율을 조정하여 실행-투-런 변형을 쉽게 제거할 수 있습니다. 결과 펩티드 강도 정보는 상대적 풍부의 2545 단백질 프로파일을 재구성하는 데 사용됩니다. 단백질 복합체의 분해를 위한 겔 샘플링 단계 크기의 관련성은 인접한 슬라이스의 데이터 집합에 가입하여 평가되었다.0.25 밀리미터에서, TPC1 관련 복합 인구의 크기 분리는 서쪽 얼룩 분석결과와 잘 일치합니다. 두 개 이상의 슬라이스의 결합은 TPC1 복잡한 하위 인구의 차별을 폐지합니다. 마지막으로, 분석은 잘 특징짓는 단지에 대한 정보를 제공하고 새로운 하위 단위및 복잡한 어셈블리의 존재를 보여줍니다.페리틴의 경우 상대적 풍요로움을 위해 조정된 서브유닛 프로파일은 뚜렷한 중형/라이트 체인 스토이치오메트리를 가진 적어도 세 개의 복잡한 동소형의 존재를 시사합니다. 대조적으로, nicalin-nomo1 복합체, 감마-분비 코어 복합체 및 GPI-transamidase 기계는 전체 크기 범위에 걸쳐 그들의 핵심 서브 유닛의 고정 된 풍부 비율을 보여주고 추가 단백질과의 연결에서 독립적. csBN-MS 분석의 주요 매개 변수는 샘플 생화학, BN 젤 품질, 포함 및 슬라이스 중 적절한 정렬, 획득 된 MS 데이터의 품질에 의해 결정되는 복합체의 효과적인 해상도입니다.단백질과 시료의 동위원소 라벨링으로 csBN-MS를 빗질하면 다양한 병리학적, 생물학적 또는 발달 상태에서 복잡한 을 직접 비교할 수 있습니다. 설치류 뇌의 멤브레인에서 수행된 csBN-MS는 아체유닛 구성 및 기능에 대한 수용체, 이온 채널 및 수송기의 엄청난 다양성을 밝혀냈으며, 네이티브 제제에서 3D 구조를 분석하는 데 도움이 될 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

연구

생화학

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

유전자 발현 프로파일링을 위한 수정된 방법으로 시리얼 씨앗에서 고품질 전사 데이터 획득

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

고해상도 호흡 측정법에 의한 좌골 신경의 미토콘드리아 기능 평가

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...