Name: high-resolution complexome profiling by cryoslicing bn-ms analysis
Uploaded: 2019-10-15T13:30:00
Duration: 9 min 33 s
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Este estudo foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação alemã de pesquisa) – Project-ID 403222702 – SFB 1381 e a estratégia de excelência da Alemanha CIBSS-EXC-2189-projeto ID 390939984. Agradecemos a Katja Zappe pela assistência técnica.

1. preparative BN-PAGE
<ol><li>Preparação do gel<ol>
<li>Use um sistema vertical do electroforese do gel do médio-à-grande formato (distância da separação do gel de > 10 cm; 14 cm x 11 cm, espaçador de 1,5 milímetros) com refrigerar eficaz ajustado a 10 ° c.</li>
		<li>Cast linear ou hiperbólico poros gradiente gel (1.5-3.0 mm espaçadores) usando um agitador de duas câmaras gradiente misturador impulsionado por uma bomba (ver tabela de materiais e reagentes). No exemplo apresentado (linear gradiente gel 1%-13%):<ol>
<li>Prepare uma solução de 13 mL para a câmara frontal (mistura) constituída por: 13% acrilamida (a partir de 30% de solução de ações, 37,5:1,0 acrilamida: bisacrilamida), 0,75 M de Ácido aminocapróico, 50 mM bis-tris (pH = 7,0) e 10% de glicerol.</li>
			<li>Prepare uma solução de 10 mL para a câmara de reservatório constituída por: 1% acrilamida (a partir de 30% de solução de ações, 37,5:1,0 acrilamida: bisacrilamida), 0,75 M de Ácido aminocapróico, 50 mM bis-tris (pH = 7,0), e 0,2% CL-47 detergente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Inicie o agitador e adicione 30 microlitros de APS (peroxodisulfato de amônio, solução de estoque de 10%) e 2,5 μL de TEMED (N, n, N ', n'-tetrametil etilenodiamina) e 2,5 microlitros de TEMED à solução na câmara frontal. Inicie a bomba e abra a válvula dianteira (o fluxo deve ser ajustado para completar a fundição em 10 min). Após 1 min, adicione 90 μL de APS e 5 μL de TEMED à solução na câmara do reservatório e abra a conexão da câmara.</li>
		<li>Permita que o gel polimerize lentamente mas completamente para pelo menos 24 h na temperatura ambiente (RT) para gerar um inclinação homogêneo do tamanho de pore. Quando mantido úmido, o gel polimerizado pode ser armazenado na posição vertical a 4 ° c por até 1 semana. Nota: intencionalmente, a parte superior do gel terá uma consistência macia/viscoso. Isto será removido mais tarde mas permite a entrada Lisa das proteínas no gel, com risco mínimo da precipitação da proteína que pode de outra maneira conduzir aos artefatos da migração (isto é, estrias ou precipitação da proteína).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação e carregamento da amostra<ol>
<li>Prepare os slots de carregamento inserindo espaçadores apropriados (por exemplo, tubos de silício) entre as placas de vidro para separar 0,5-2,0 mg de proteína. As ranhuras devem ser feitas pelo menos 3 cm de largura (ou melhor, 5-6 cm de largura).</li>
		<li>Solubilize ~ 2,5 mg de membrana (preparação de endosome-enriquecido com rim de rato) em 2 mL de tampão de solubilização contendo 1% (p/v) detergente não desnaturante (Complexolyte CL-47) durante 30 min no gelo. Ultracentlee Gate (corte de sedimentação = 200 S ou menos; 130.000 x g/11 min é usado aqui).</li>
		<li>Concentrar o solubilisate em um curto 50%/20% (w/v, 0,3 ml cada) gradiente passo de sacarose por ultracentlee por 1 h em 400.000 x g. O rendimento final da proteína deve ser de pelo menos 1 mg.</li>
		<li>Adicione 0, 5% (w/v) Coomassie G-250 ao solubilisate e carregue a amostra no gel. Limitar a carga proteica a uma secção transversal de 10-15 μg/mm2 gel Lane para obter alta resolução e evitar artefactos resultantes da precipitação proteica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Condições de execução de BN-PAGE<ol>
<li>Para a execução de buffers, prepare um tampão de cátodos padrão consistindo de 50 mM de tricina, 15 mM de bis-Tris e 0, 1% de Coomassie G-250. Prepare um tampão padrão do ânodo que consiste em 50 milímetros de bis-tris (pH = 7,0).</li>
		<li>Execute um BN-Page preparativa em 10 ° c durante a noite usando um protocolo de tensão de três etapas13 consistindo em: uma fase do equilíbrio por 30 minutos em 100 v, então uma rampa lenta (de 3 h) à tensão máxima (40-50 comprimento do gel de V/cm) que é mantida finalmente por pelo menos 6 h para foco do ponto final das proteínas. Nota: recomenda-se pausar a electroforese quando a parte dianteira da migração alcangou o meio do gel e troca o amortecedor do cátodos para o amortecedor fresco sem Coomassie G250. Isso ajuda a evitar artefatos de precipitação no gel resultante do colapso local da estrutura de poros da matriz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. amostragem e digestão do gel
<ol><li>Excisão de pistas de gel<ol>
<li>Após a corrida, digitalizar os géis para fins de documentação, mantendo-o entre as placas de vidro.</li>
		<li>Desmontar as chapas e extirpar a (s) secção (ões) de juros.</li>
		<li>Pegue uma tira de amostra da pista para análise por 2D BN/SDS-PAGE e coloração de proteínas ou western blotting (como mostrado na Figura 1B) para determinar regiões de interesse, resolução de tamanho complexo eficaz e abundância de proteínas.</li>
		<li>Fixar faixas de gel selecionadas duas vezes por pelo menos 30 min com 30% (v/v) etanol e 15% (v/v) de ácido acético.</li>
		<li>Transfira a amostra para o meio de incorporação e deixe-a mergulhar e equilibrar por pelo menos 2 h a 4 ° c, mantendo a laje de gel em câmara lenta em um agitador orbital. Nota: a separação do gel deve ser cuidadosamente inspecionada para a qualidade geral de separação e artefatos de migração. Bandas de gel representando proteínas dominantes devem ser livres de distorção e homogênea em intensidade. Artefatos locais no gel devem ser excisados ou deixados de fora da análise.</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporação e corte de cryomicrotome Nota: esta é uma versão melhorada do procedimento de incorporação descrita e foto-documentado previamente que permite incorporar e fatiar de faixas mais amplas do gel de até 8 cm11.<ol>
<li>Primeiramente, corte faixas fixas do gel em seções (aqui, 3 cm) exatamente paralelas ao teste padrão da frente/faixa da migração da proteína. Para facilitar o manuseio, coloque cada seção em um suporte de filme plástico com dimensões iguais.</li>
		<li>Transfira as pistas para um tubo aberto com rolhas (fechadas na parte inferior, perfuradas centralmente no topo, alinhadas precisamente com as extremidades superior e inferior da secção de gel).</li>
		<li>Mergulhe o cilindro brevemente em nitrogênio líquido para iniciar rapidamente a solidificação. O meio de incorporação transparente solidifica dentro de segundos e torna-se branco na cor.</li>
		<li>Encha a cavidade com meio de incorporação, mergulhe-a brevemente em nitrogênio líquido e congele o cilindro a-20 ° c por várias horas. Nota: refrigerar o cilindro ràpida mergulhando o no nitrogênio líquido ajuda a evitar o deslocamento da laje do gel dentro do tubo. A distorção deve ser evitada para garantir alta resolução na seguinte análise de MS.</li>
		<li>Após a desmontagem, retire a película plástica e transfira o bloco com a seção encaixada do gel a um refrigerado, maior no diâmetro, cilindro do metal coloc em um apoio liso (isto é, prato de Petri) e selado com o meio de incorporação na parte externa do cilindro. Encha o cilindro com o meio de incorporação e congele completamente.</li>
		<li>Repita este procedimento com o outro lado do cilindro para obter um bloco sólido com superfícies coplanares.</li>
		<li>Retire o bloco do cilindro, Cole-o com meio de incorporação em um suporte de metal pré-arrefecido e insira o suporte na máquina de criocirurgia (criotomo). A superfície do bloco deve ser cuidadosamente alinhada com relação ao plano de fatiamento. Deixe-a equilibrar a temperatura ideal para o processo de fatiamento (aqui,-15 ° c). Nota: Use um ciclo de corte manual de progressão lenta de 0,1 mm de tamanho até atingir a superfície da seção de gel incorporada para garantir o posicionamento correto.</li>
		<li>Colha as fatias do gel uma após a outra, com uma espessura desejada final do tamanho da etapa de 0,25 milímetros, e transfira-as individualmente aos tubos da reação com baixas propriedades da ligação da proteína. Nota: neste set-up, as fatias uniformes do gel podem prontamente ser obtidas tão finas quanto 0,1 milímetros e tão grossos quanto 0,5 milímetros.</li>
	</ol></li>
	<li>Digestão de Tryptic<ol>
<li>Realize a digestão Tríptico do em-gel após a lavagem extensiva das fatias do gel (pelo menos três círculos adicionais da lavagem são recomendados remover os componentes poliméricos do meio de incorporação) que seguem um procedimento padrão11.</li>
		<li>Peptídeos eluída secos a vácuo e redissolvem em 0,5% (v/v) de ácido trifluoroacético agitando a 37 ° c (10 min) seguido de sonication banho (5 min) e breve centrifugação.</li>
	</ol></li>
</ol>3. espectrometria de massas
<ol><li>nanoHPLC e MS set-up<ol>
<li>Carregue amostras digeridas em uma pré-coluna C18 (tamanho de partícula = 5 μm; diâmetro = 300 μm) com 0, 5% (v/v) de ácido trifluoroacético usando uma nano-HPLC (livre de separação) acoplada a um espectrómetro de massa com alta resolução.</li>
		<li>Elute capturou peptídeos com um gradiente aquoso-orgânico (eluente A): 5 min 3% B, 120 min de 3% B a 30% B, 20 min de 30% B a 99% B, 5 min 99% B, 5 min de 99% B a 3% B, 15 min 3% B (vazão = 300 nL/min). Nota: as fatias do gel de csBN-MS conduzem tipicamente às amostras com baixa à abundância intermediária do peptide e a um grau limitado de complexidade. a análise de nanoLC-MS/MS deve conseqüentemente ser executada com um set-up que fornece a sensibilidade razoável e a velocidade de sequenciamento, a definição maciça elevada (> 100000) e a escala dinâmica máxima (eficazmente 3-4 ordens de magnitude). No entanto, ele não requer dimensões de coluna longa ou gradientes de eluição estendidos além de 3 h.</li>
		<li>Peptídeos eluída separados em um emissor (identificação 75 μm; Tip = 8 μm) embalaram manualmente aproximadamente 20 cm com material C18 (tamanho de partícula = 3 μm). Electrospray as amostras em 2,3 quilovolts (modalidade positiva do íon) no capilar aquecido da transferência (° c 250) do espectrómetro maciço.</li>
		<li>Realize análises com as seguintes configurações de instrumento11: tempo máximo de injeção de MS/ms = 400 MS; duração da exclusão = 60 s; limiar mínimo de sinal = 5.000 contagens, Top 10 precursores fragmentados; largura de isolamento = 1,0 m/z). Nota: para facilitar a calibração da massa, o tempo de retenção e a atribuição de sinais peptídicos em um grande número de conjuntos de dados ou medições, recomenda-se realizar as respectivas séries de medição MS sem interrupções ou alterações nos parâmetros e no hardware ( ou seja, na mesma coluna/emissor C18).</li>
	</ol></li>
	<li>Identificação de proteínas (dados MS avaliados como descrito anteriormente11)<ol>
<li>Extraia listas de pico de espectros de íons de fragmento usando a ferramenta "msconvert. exe" (parte do ProteoWizard).</li>
		<li>Mude todos os valores do precursor m/z para cada conjunto de dados pelo deslocamento mediano de m/z de todos os peptídeos atribuídos a proteínas em uma pesquisa preliminar de banco de dados com tolerância de massa peptídeo de 50 ppm.</li>
		<li>Pesquise as listas de pico corrigidas com um mecanismo de pesquisa adequado (aqui, mascote 2.6.2) contra todas as entradas do mouse do banco de dados UniProtKB/Swiss-Prot (Release 2018_11).</li>
		<li>Selecione "acetil (proteína N-termo)", "Carbamidomethyl (C)", "GLN | Pyro-Glu (N-Term Q), glu | Pyro-Glu (N-termo E) "," oxidação (M) ", e" Propionamide (C) "como modificações variáveis.</li>
		<li>Ajuste o peptide e a tolerância maciça do fragmento a ± 5 ppm e a ± 0,8 da, respectivamente, e permita uma clivagem tríptico faltada. Ajuste o corte do valor da espera para a identificação do peptide a 0,5 ou menos. Use uma pesquisa de banco de dados de chamariz para determinar a taxa de descoberta falsa positiva (FDR). Defina o FDR para 1% ou aplique critérios de qualidade adicionais para garantir uma identificação confiável. Nota: o experimento apresentado identificou mais de 3.500 proteínas, com um peptídeo médio FDR de 4,4 ± 0,77% (n = 101 amostras de fatia), ou 3.000 proteínas quando o peptídeo FDR foi ajustado para 1%. É importante ressaltar que foram utilizados critérios mais rigorosos para a seleção de proteínas perfiladas (2.568). Incluiu todas as proteínas que foram identificadas com pelo menos dois peptídeos, pelo menos um deles sendo específico de proteínas, em pelo menos uma das amostras de 101 fatias.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação de proteínas<ol>
<li>Use intensidades de sinal peptídeo (volumes de pico [PVs]) para quantificação de proteínas que são obtidas a partir de exames completos FT e corretas para o tempo de retenção e mudanças em massa usando o software apropriado (aqui, MaxQuant v 1.6.3).</li>
		<li>Alinhe os conjuntos de dados do MS um por um para referenciar os tempos de eluição do peptídeo de referência (média total) usando a regressão LOESS. Atribua PVs a peptídeos diretamente (identificação baseada em MS/MS) ou indiretamente (ou seja, com base em seu tempo de correspondência m/z e eluição dentro de tolerâncias muito estreitas). Nota: Este protocolo utiliza o software em casa para atribuição dos peptídeos denominados "inseridos". Os parâmetros ajustados resultam em tolerâncias de harmonização do tempo de m/z e de eluição eficazes de ± 2 ppm e de ± 1 minuto, respectivamente (veja Figura 2A, B).</li>
		<li>Correto para variações sistemáticas de execução em execução na carga peptídica e eficiência de ionização por recalagem da intensidade do peptídeo calculada a partir das diferenças medianas das intensidades de peptídeos relativos entre amostras de fatias vizinhas (Figura 2C).</li>
		<li>Filtre dados PV para outliers e atribuições falso-positivas restantes identificadas pela análise de consistência PV interna.</li>
		<li>Normalize PVs de cada peptídeo para seus valores máximos em todos os conjuntos de dados de fatia produzindo perfis de abundância de peptídeos relativos.</li>
		<li>Finalmente, calcule os perfis relativos da abundância da proteína como as médias de pelo menos dois (e até seis ou 50%, o que valor é maior) do melhor correlacionando perfis do peptide sobre uma janela de três fatias consecutivas. Isso permite a ponte de valores de PV ausentes e reduzindo o ruído. Nota: isto finalmente resultou em 2.545 (de 2.568 pré-selecionados) perfis proteicos (Figura 2D).</li>
	</ol></li>
	<li>Caracterização de complexos proteicos<ol>
<li>Analise os perfis proteicos realizando primeiro a detecção de pico usando o método Maxima local e ajuste consecutivamente as distribuições normais a esses picos, produzindo a posição (i.e., índice de fatia ou tamanho complexo aparente) de seus máximos e FWHM (largura total em intensidade do meio máximo) (Inset da Figura 4). Observação: no conjunto de dados, os perfis são analisados automaticamente usando scripts personalizados. Os menores valores de FWHM são indicativos da resolução de tamanho efetivo da abordagem (aqui, 6 x 0,25 = 1,5 mm).</li>
		<li>Use picos complexos de proteínas de referência com massa molecular definida (conforme relatado no banco de dados UniProtKB/Swiss-Prot) para a análise de regressão linear dos valores de (massa molecular prevista) de $64 para converter índices de número de fatia em tamanhos moleculares aparentes (i.e., tamanho complexo aparente no kDa). Nota: foram selecionados 23 complexos de marcadores na amostra (Figura 4) com base em (i) formas monodispersa de picos de perfil, (II) suporte experimental de pesos moleculares e (III) distribuições ao longo das seções de gel de BN-Page investigadas.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome.">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nature Methods. 9 (9), 907-919 (2012).</li></ol>

O autor Uwe Schulte é um funcionário e acionista da Logopharm GmbH que produz o Complexolyte 47 utilizado neste estudo. A empresa fornece reagentes Complexolyte para instituições acadêmicas em uma base sem fins lucrativos.

O estudo apresentado construiu na técnica de CSBN-MS previamente aferido com uma preparação mitochondrial11 e incorporou melhorias na preparação da amostra, no processamento do gel, e na avaliação dos dados do MS. A análise focalizada de uma seção do gel BN-PAGE da separação em grande escala forneceu um jogo detalhado dos dados que mostram medidas da qualidade comparáveis ao estudo com membranas mitochondrial. Os erros de massa e tempo de retenção, bem como as variações de Run-to-Run, foram mantidos muito baixos e forneceram a base para determinar perfis confiáveis de abundância de proteínas. A resolução de tamanho pareceu ser boa, com larguras de pico meia-máxima tão baixas quanto seis fatias (correspondendo a 1,5 mm, Figura 4) e diferenças de tamanho relativo de menos de 10% resolvidas (Figura 3, Figura 5A). Esses valores não atenderam totalmente à qualidade de resolução de tamanho da análise anterior de csBN-MS das mitocôndrias (apesar do tamanho da etapa de amostragem de gel menor escolhida), mas eles são significativamente melhores do que o desempenho de BN-MS convencional ou MS de exclusão de tamanho abordagens20 que recentemente se tornaram populares.
A importância de uma alta resolução efetiva de tamanho complexo é sublinhada pelo experimento de simulação na Figura 3 (utilizando os complexos associados ao TPC1) que dificilmente podem ser resolvidos pela análise de Western blot 2D BN/SDS-PAGE (Figura 1B). Estes resultados sugerem que o corte de 0,25 milímetros neste caso conduziu a algum oversampling, mas este ainda provou ser útil para a eliminação do "ruído da quantificação" sem comprometer a definição eficaz do tamanho. Assim, em consonância com os resultados anteriores11, um tamanho de etapa de amostragem de ~ 0,3 mm é geralmente recomendável.
Notavelmente, a discriminação de complexos TPC1-Associated é perdida completamente com a amostragem do gel de 1 milímetro, que é o tamanho o menor da etapa fornecido pelo fatiamento manual em BN-MS convencionais5,6. Isso pode explicar o fato de que, apesar das poderosas tecnologias MS estarem disponíveis, muito poucos complexos proteicos e subunidades foram identificados de novo pelo perfil complexome. Além de seu bom poder de resolução, csBN-MS oferece alta versatilidade. Complexos ligados à membrana e complexos proteicos solúveis variando de 50 kDa a vários MDa podem ser efetivamente resolvidos em um único experimento com viés mínimo11. Isto contrasta com as técnicas alternativas da separação usadas para o perfilamento complexome como a exclusão do tamanho ou a cromatografia da troca iónica, que operam com subconjuntos de proteínas solúveis com determinadas escalas do tamanho ou propriedades da carga. Na desvantagem, csBN-MS é menos escalável (carga máxima de ~ 3 mg de proteína por gel), pode ser tecnicamente desafiador, e não pode ser automatizado.
Globalmente, os resultados demonstram que o perfil complexome baseado em csBN-MS pode ser aplicado com sucesso a alvos não mitocondriais, mas também indicar alguns desafios associados. Assim, a extração eficiente e a estabilidade bioquímica de complexos proteicos exigem mais otimização, e as etapas de limpeza e ainda podem ser limitadas. Dentro da janela de tamanho investigado, o número de complexos proteicos bem focados e monodispersantes foi realmente consideravelmente menor (dados não mostrados) em comparação com uma amostra mitocondrial. Também é recomendável reduzir as cargas de amostra BN-PAGE para obter a separação aceitável do gel. Cargas mais elevadas podem necessitar de vias de gel mais amplas que são mais difíceis de processar corretamente para fatiar (ver vídeo que acompanha). Além disso, a complexidade proteica das amostras foi maior (em torno de duas vezes) do que as escavações de fatias derivadas de mitocôndrias, levando a mais valores de PV ausentes e uma faixa dinâmica reduzida. De fato, algumas pequenas proteínas esperadas para fazer parte dos complexos mostrados na Figura 5 faltavam nas análises. Esses problemas podem ser resolvidos no futuro usando instrumentos de MS mais rápidos e mais sensíveis ou modos de aquisição independentes de dados.
A preparação da amostra é altamente crítica para a recuperação complexa da proteína, a estabilidade, e a qualidade da separação do gel. Os parâmetros e procedimentos devem ser otimizados para cada tecido de origem, lisado de células, membrana (fração) e complexo proteico de interesse. As seguintes recomendações gerais são fornecidas que podem ajudar a estender aplicações de csBN-MS:
(i) preparar amostras frescas e evitar o aquecimento/congelamento, diluições fortes, alterações nas condições de reserva e atrasos desnecessários;
(II) uso de buffers que são essencialmente desprovidos de sais (substitua com 500-750 mM de betaína ou Ácido aminocapróico), sobre um pH neutro, e contendo até 1% (p/v) de detergente não desnaturante (relação proteína: detergente entre 1:4-1:10 para solubilização de membrana complexos proteicos, nenhum detergente necessário para complexos proteicos solúveis);
(III) teste cuidadoso e ajuste das condições de detergente por BN-PAGE analítica, uma vez que estes podem impactar fortemente a eficiência da solubilização complexa, a representação de complexos proteicos de membrana na amostra, estabilidade e homogeneidade de micelas de detergente proteico. Estes últimos são pré-requisitos para que as proteínas se concentrem como bandas distintas/populações complexas em géis BN-PAGE. A literatura precedente oferece uma escala larga de detergentes neutros. No entanto, DDM (n-Dodecyl β-d-maltoside)1,2,4,5,6 e digitonin3,5,7,8, 9,10,13,18 foram as escolhas mais populares para análises de BN-MS até agora. Deve-se enfatizar que qualquer condição de detergente representa necessariamente um comprometimento entre a eficiência de solubilização e a preservação das interações protéicas e pode não ser igualmente adequada para todos os tipos de proteínas-alvo e material de origem;
(IV) remoção de polímeros carregados como fibrilas, filamentos, polylysine, DNA e abundantes componentes de peso molecular inferiores (i.e., metabólitos, lipídios ou peptídeos). Isto pode ser conseguido por ultracentlee, filtração do gel, ou diálise. Isto é particularmente importante para os lisados totais da pilha ou do tecido;
(v) adição de Coomassie G-250 (concentração final 0,05%-0,1%) e sacarose (para aumentar a densidade de carga, a concentração final de 10%-20% [w/v]) para a amostra pouco antes do carregamento, para limpar por ultracentlee curto, carregar a amostra sem perturbação, e iniciar a corrida imediatamente depois disso.
Como perspectiva futura, o perfil complexome baseado em csBN-MS oferece opções de multiplexação para estudar dinâmicas complexas de proteínas ou alterações relacionadas a condições biológicas específicas. A separação combinada de amostras metabolicamente etiquetadas como propor para a criação de perfil baseada tamanho-exclusão21 parece direta, mas pode ser dificultada pela troca espontânea da subunidade nos complexos que ocorrem independentemente da separação usada Método. Alternativamente, as amostras rotuladas podem ser resolvidas em faixas de gel vizinhas, que podem então ser cofatiadas ou combinadas pós-digerindo para análise diferencial com alta sensibilidade e robustez.

A separação BN-PAGE foi primeiramente acoplada diretamente à análise de LC-MS (BN-MS) pelos grupos de pesquisa de Majeran1 e Wessels2 usando o fatiamento manual de pistas do gel da BN-página. Suas análises identificaram um número abundante de complexos proteicos da membrana com composição conhecida do subunidade dos plastídios da planta e das mitocôndria da pilha de HEK, respectivamente. No entanto, essas análises estavam longe de ser abrangentes e não permitiriam a identificação imparcial de novos conjuntos. O desempenho dos espectrómetros de massa e dos métodos de quantificação sem rótulo melhorou consideravelmente desde então, o que permitiu análises abrangentes de BN-MS. Isto cunhou o termo "perfilamento complexome". Por exemplo, Heide e colegas de trabalho analisaram as mitocôndrias do coração de rato identificando e aglomerando 464 proteínas mitocondrial, confirmando assim muitas montagens conhecidas. Além, encontraram TMEM126B para ser um subunidade novo e crucial de um complexo específico3do conjunto. Os resultados comparáveis (com 437 perfis mitochondrial da proteína) foram obtidos em um estudo paralelo de mitocôndria da pilha de HEK4.
Apesar dessas melhorias, várias questões permaneceram que restringem o pleno potencial da BN-MS para o perfilamento complexome. Uma grande limitação é a resolução efetiva de tamanho de complexos que é determinado por dois fatores: a (i) qualidade da separação BN-PAGE, que depende da uniformidade do gradiente de poros da matriz de gel, bem como da estabilidade/solubilidade dos complexos amostrais, e (II) tamanho da etapa da amostragem do gel, que é no melhor 1 milímetro ao usar a fatiagem manual convencional5,6. A baixa resolução de tamanho não só perde as isoformas complexas sutis e heterogeneidades, mas também impacta negativamente a amplitude dinâmica e a confiança da atribuição e quantificação de subunidades de novo e imparcialidade.
Outros desafios incluem a precisão da quantificação de proteínas e a cobertura da faixa dinâmica real de abundâncias protéicas na amostra por espectrometria de massas. Portanto, a aplicação do perfil complexome de BN-MS permaneceu largamente restrita a amostras biológicas com menor complexidade, alta expressão de complexos-alvo e propriedades de solubilização favoráveis (i.e., plastids, mitocôndrias e microorganismos)6,7,8,9,10.
Recentemente, introduzimos o cryomicrotome slicing-Assisted BN-MS (csBN-MS), que combina uma amostragem de submilímetro precisa de faixas de gel BN-PAGE com análise abrangente de MS e processamento de dados MS elaborado para determinação de perfis proteicos com alta confiança11. A aplicação a uma preparação mitochondrial da membrana dos cérebros do rato demonstrou a definição complexa eficaz previamente não atendidas do tamanho e a cobertura máxima de subunidades oxidativos do complexo Chain respiratório (oxphos) (isto é, 90 de 90 MS-acessíveis). Este exemplo também identificou uma série de novos conjuntos proteicos.
Descritos aqui estão os procedimentos otimizados para a separação preparativa BN-PAGE de complexos proteicos (não restritos a uma fonte biológica específica), fundição de grandes géis preparativos de BN-PAGE, corte de cryomicrotome de vias de gel amplas e dados MS Processamento. O desempenho do perfilamento de alta resolução é demonstrado para uma preparação complexa da proteína das membranas endosome-enriquecidas do rim do rato. Finalmente, os benefícios de aumentar a definição e a precisão da quantificação espectrométrica maciça são discutidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>#1610158</td>
			<td>Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>#1610154</td>
			<td>Recommended for acrylamide gradient gel solutions &#62;13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby Protein Blot Stain</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>#1703127</td>
			<td>Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Serva</td>
			<td>no. 35050</td>
			<td>Centrifugate stock solutions prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ComplexioLyte 47</td>
			<td>Logopharm</td>
			<td>CL-47-01</td>
			<td>Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Medium / Tissue Freezing Medium</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14020108926</td>
			<td>Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>any supplier, important for making gel section embedding tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>broad razor blade</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal tube / cylinder, ca. 4 cm long</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>mold for embedding and freezing of gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Nr. 0030108116</td>
			<td>highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing-grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 &#181;m</td>
			<td>Dionex / Thermo Scientific</td>
			<td>P/N 160454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoTip emitter (i.d. 75 &#181;m; tip 8 &#181;m)</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>FS360-75-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 &#181;m)</td>
			<td>Dr. Maisch GmbH</td>
			<td>r13.93.</td>
			<td>columns packed manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-TPC1 antibody</td>
			<td>Gramsch Laboratories</td>
			<td>custom production</td>
			<td>described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>CY-1300</td>
			<td>described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>#B1325</td>
			<td>described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-microtome Leica CM1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047743905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean II Cell with wetblot unit</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penguin Midi Gel Electrophoresis System</td>
			<td>PeqLab</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>for BN-PAGE (not sold any more)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera</td>
			<td>Zeiss / Photometrics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump (IP high precision multichannel)</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM940</td>
			<td>for casting of gradient polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gradient mixer with stirring (two chambers)</td>
			<td>selfmade, alternatively Bio Rad</td>
			<td>1652000 or 1652001</td>
			<td>for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor</td>
			<td>Sorvall / Thermo Scientific</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>for sample preparation (not sold any more)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano HPLC</td>
			<td>Dionex / Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Elite mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMAZQ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution complexome profiling by cryoslicing bn-ms analysis

As proteínas geralmente exercem funções biológicas através de interações com outras proteínas, seja em conjuntos proteicos dinâmicos ou como parte de complexos formados de forma estável. O último pode elegantemente ser resolvido de acordo com o tamanho molecular usando a electroforese nativa do gel do poliacrilamida (BN-página). O acoplamento de tais separações à espectrometria maciça sensível (BN-MS) foi estabelecido bem e permite teoricamente a avaliação exaustiva do complexome extraível em amostras biológicas. No entanto, esta abordagem é bastante trabalhosa e fornece resolução de tamanho complexo limitado e sensibilidade. Além disso, sua aplicação permaneceu restrita a abundantes proteínas mitocondrial e plastid. Assim, para a maioria das proteínas, ainda faltam informações sobre a integração em complexos proteicos estáveis. Aqui apresentamos uma abordagem otimizada para o perfilamento complexome compreendendo separação de BN-PAGE em escala preparativa, amostragem de submilímetro de largas faixas de gel por corte de cryomicrotome e análise espectrométrica de massa com quantificação de proteínas sem rótulo. Os procedimentos e ferramentas para etapas críticas são descritos detalhadamente. Como uma aplicação, o relatório descreve a análise complexome de uma fração solubilizado endosome-enriquecida da membrana dos rins do rato, com as 2.545 proteínas perfiladas no total. Os resultados demonstram a identificação de proteínas uniformes, da membrana da baixo-abundância tais como os canais de íon intracelular assim como os testes padrões de alta resolução, complexos da montagem da proteína, incluindo isoforms do glicosilação. Os resultados estão de acordo com análises bioquímicas independentes. Em síntese, esta metodologia permite a identificação abrangente e imparcial de complexos proteicos (super) e sua composição de subunidades, proporcionando uma base para investigar a dinâmica de estequiometria, montagem e interação de complexos proteicos em qualquer sistema biológico.

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High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Um protocolo versátil de cryoslicing BN-MS usando um micrótomo é apresentado para o perfilamento complexome de alta resolução.

Perfilamento Complexome de alta resolução por Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

O objetivo central para o desenvolvimento da técnica csBN-MS foi obter acesso abrangente à organização e montagem de complexos proteicos que fundamentam a transdução de sinais na membrana plasmática de vários tipos de tecidos e órgãos. atualmente, o CSBN-MS fornece a maior versatilidade de resolução para análise do complexo proteico nativo e sua composição subunidade, em especial no que diz respeito às proteínas da membrana. Embora a técnica csBN-MS tenha sido desenvolvida para analisar misturas complexas de conjuntos de proteínas de membrana no cérebro de roedores, ela pode ser facilmente adaptada à análise de qualquer tipo de amostra biológica.Um dos passos-chave do nosso método é a incorporação da peça de gel e seu alinhamento correto ao plano de corte antes de cortar. Tenha cuidado para não rasgar ou comprimir o gel e certifique-se de que ele não está inclinado para o plano de corte, pois isso reduziria a resolução da análise. Nossa técnica csBN-MS tem várias etapas práticas que são cruciais para bons resultados.É mais fácil mostrar como executar essas etapas em detalhes do que apenas descrevê-las. Para iniciar este procedimento use um misturador de gradiente de duas câmaras agitado conduzido por uma bomba para lançar um gel linear ou um gradiente de poros hiperbólico. Prepare soluções para a câmara de mistura frontal e câmara de reservatório, conforme descrito no protocolo de texto.Inicie o agitador e adicione 30 microliters de APS e 2,5 microliters de TEMED à solução na câmara frontal. Em seguida, ligue a bomba e abra a válvula dianteira. Após aproximadamente um minuto, adicione 90 microliters de APS e cinco microliters de TEMED à câmara do reservatório e abra a conexão da câmara.Deixe o gel polimerizar lentamente e completamente por pelo menos 24 horas à temperatura ambiente para gerar um gradiente de tamanho de poros homogêneo. Se mantido úmido, o gel polimerizado pode ser armazenado em pé a quatro graus Celsius por até uma semana. Em seguida, prepare as ranhuras de carregamento inserindo os espaços apropriados entre as placas de vidro para separar entre 0,5 e 2,0 miligramas de proteína.As ranhuras devem ter pelo menos três centímetros de largura. Para os buffers de corrida, prepare um tampão de cátodo em pé composto por 50 milimolars tricine, 50 milimolares Bis-Tris e 0,01% Coomassie G-250. Prepare um tampão de ânodo padrão composto por 50 mililitros Bis-Tris.Solubilize aproximadamente 2,5 miligramas de membrana e dois mililitros de tampão de solubilização contendo 1% de detergente não desnaturado no gelo por 30 minutos. Em seguida, ultracentrifuuge a 130.000 vezes G por 11 minutos. Concentre o solubilisato em um gradiente curto de passo de sacarose de 50%20% por ultracentrifugação a 400.000 vezes G durante uma hora.Depois disso, retire o gradiente de sacarose da parte inferior do tubo, adicione 0,05% Coomassie G-250 ao solubilisato e carregue a amostra no gel. Execute um BN-PAGE preparatório a 10 graus Celsius durante a noite usando um protocolo de tensão de três etapas, conforme descrito no protocolo de texto. Depois que o gel tiver executado escaneie os géis para fins de documentação, mantendo-o entre as placas de vidro.Inspecione a qualidade da separação do gel. Em seguida, dissimule as placas e extirver os trechos de pista de interesse. Conserte as pistas duas vezes com 30% de etanol e ácido acético de 15% por pelo menos 30 minutos.Transfira a amostra do meio de incorporação e permita que ela mergulhe e equilibre por pelo menos duas horas, mantendo a placa de gel em câmera lenta em um agitador orbital. Em seguida, corte as faixas de gel fixa em seções exatamente paralelas à frente de migração de proteínas, ou padrão de banda. Coloque cada seção em um suporte de filme plástico com dimensões iguais para facilitar o manuseio.Transfira as pistas para um tubo aberto com rolhas que estão fechadas na parte inferior e perfuradas centralmente na parte superior, ambas precisamente alinhadas com as extremidades superior e inferior da seção de gel. Mergulhe o cilindro no nitrogênio líquido brevemente para iniciar rapidamente a solidificação. O meio de incorporação transparente solidifica em segundos e se torna branco na cor.Encha a cavidade com meio de incorporação, mergulhe brevemente o cilindro em nitrogênio líquido e, em seguida, deixe congelar completamente a menos 20 graus Celsius por várias horas. Após a desmontagem, remova a película plástica e transfira o bloco com a seção de gel incorporado para um cilindro de metal resfriado. O cilindro tem maior diâmetro e selado por fora com meio de incorporação.É colocado em um suporte plano. Encha o cilindro com meio de incorporação e congele bem como mencionado anteriormente. Repita este procedimento com o outro lado do cilindro para obter um bloco sólido com uma superfície inferior coplanar.Em seguida, remova o bloco do cilindro e use o meio de incorporação para colar-o a um suporte de metal pré-resfriado. Insira o suporte de metal na máquina de criosco. O suporte deve estar cuidadosamente alinhado em relação ao plano de corte.Deixe que o bloco se equilibre até a temperatura ideal para o processo de corte. Após esta colheita, o gel corta um após o outro com uma espessura final desejada de 0,25 milímetros de tamanho de passo e transferi-los individualmente para tubos de reação com baixas propriedades de ligação proteica. Em seguida, as fatias são submetidas à digestão trippética e análise espectrométrica de massa.Este protocolo estende a aplicação de perfil complexome de alta resolução a membranas não mitocondriais expressando proteínas de baixa abundância. A separação complexa mostra bandas de proteínas fortemente manchadas com muito poucos artefatos migratórios. Desvios de sinais de peptídeos em massa e tempo de retenção indicam uma taxa muito baixa para atribuição de volume de pico falso positivo.As variações run-to-run são facilmente eliminadas pelo redimensionamento dos conjuntos de dados de volume de pico. As informações resultantes da intensidade do peptídeo são então usadas para reconstruir 2545 perfis proteicos de abundância relativa. A relevância do tamanho da etapa de amostragem de gel para a resolução de complexos proteicos foi avaliada pela junção de conjuntos de dados de fatias adjacentes.A 0,25 milímetros, a separação de tamanho das populações complexas associadas ao TPC1 está muito bem de acordo com os resultados da análise de manchas ocidentais. A junção de mais de duas fatias aboli a discriminação das subpopulações complexas do TPC1. Por fim, a análise fornece informações sobre complexos bem caracterizados e demonstra a existência de novas subunidades e montagens complexas.Para a ferritina, os perfis de subunidade ajustados para sua abundância relativa sugerem a existência de pelo menos três isoformas complexas com distintas estoquitometrias de cadeia pesada/leve. Em contraste, os complexos nicalin-nomo1, o complexo núcleo gama-secretase, e as máquinas GPI-transamidase mostram proporções fixas de abundância de suas subunidades principais ao longo de toda a gama de tamanho e independentes da associação com proteínas adicionais. O parâmetro-chave da análise da CSBN-MS é a resolução efetiva dos complexos, que é determinada pela bioquímica amostral, qualidade do gel BN, alinhamento adequado durante a incorporação e fatiamento e qualidade dos dados adquiridos de MS.O pentear csBN-MS com rotulagem de isótopos de proteínas e amostras permitirá a comparação direta de complexos em diferentes estados fisiofisiológicos, biológicos ou de desenvolvimento. csBN-MS realizada em membranas do cérebro de roedores revelou a enorme diversidade de receptores, canais de íons e transportadores em relação à sua composição subunidade e sua função, e será fundamental para a análise da estrutura 3D nas preparações nativas.

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