Name: high-resolution complexome profiling by cryoslicing bn-ms analysis
Uploaded: 2019-10-15T13:30:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis at JoVE.com

Denna studie stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tyska Research Foundation)-projekt-ID 403222702-SFB 1381 och enligt Tysklands Excellence strategi CIBSS-EXC-2189-projekt-ID 390939984. Vi tackar Katja Zappe för teknisk assistans.

1. Preparative BN-sida
<ol><li>Gel beredning<ol>
<li>Använd en vertikal gel elektrofores system (> 10 cm avstånd för gel separation, 14 cm x 11 cm, 1,5 mm spacer) med effektiv kylning inställd på 10 ° c.</li>
		<li>Gjuten linjär eller hyperbolisk pore gradient gel (1.5-3.0 mm distanser) med en omrörning två kammare lutning mixer som drivs av en pump (se tabell över material och reagenser). I det presenterade exemplet (linjär gradient gel 1%-13%):<ol>
<li>Bered en 13 mL lösning för den främre (blandnings) kammaren bestående av: 13% akrylamid (från 30% stamlösning, 37,5:1,0 akrylamid: bisacrylamid), 0,75 M aminokapronsyra, 50 mM BIS-tris (pH = 7,0) och 10% glycerol.</li>
			<li>Bered en 10 mL lösning för reservoarkammaren bestående av: 1% akrylamid (från 30% stamlösning, 37,5:1,0 akrylamid: bisacrylamid), 0,75 M aminokapronsyra, 50 mM BIS-tris (pH = 7,0) och 0,2% CL-47 rengöringsmedel.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Starta omröraren och tillsätt 30 mikroliter APS (ammoniumperoxodisulfat, 10% stamlösning) och 2,5 μL TEMED (N, N, N ',, N'-tetrametyletylendiamin) och 2,5 mikroliter TEMED till lösningen i främre kammaren. Starta pumpen och öppna den främre ventilen (flödet bör justeras för att slutföra gjutning i 10 min). Efter 1 min tillsätt 90 μL APS och 5 μL TEMED till lösningen i reservoarkammaren och öppna kammar anslutningen.</li>
		<li>Låt gelen att polymerisera sakta men grundligt i minst 24 h vid rumstemperatur (RT) för att generera en homogen porstorlek lutning. När den hålls fuktig kan den polymeriserade gelen förvaras upprätt vid 4 ° c i upp till 1 vecka. Obs: avsiktligt, toppen av gelen kommer att ha en mjuk/slemmet konsistens. Detta kommer senare att tas bort men möjliggör smidig införsel av proteiner i gelen, med minimal risk för protein nederbörd som annars kan leda till migration artefakter (dvs, strimmor eller protein nederbörd).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Provberedning och lastning<ol>
<li>Förbered lastningsplatserna genom att sätta in lämpliga distansar (t. ex. Silikonrör) mellan glasplattorna för att separera 0,5-2,0 mg protein. Facken bör göras minst 3 cm bred (eller bättre, 5-6 cm bred).</li>
		<li>Solubilize ~ 2,5 mg membran (mus njure endosome-berikad beredning) i 2 mL solubilization buffert som innehåller 1% (w/v) icke-denaturerande rengöringsmedel (Komplexiolyt CL-47) för 30 min på is. Ultracentrifugate (sedimentation cut-off = 200 S eller mindre; 130 000 x g/11 min används här).</li>
		<li>Koncentrera solubilisaten på en kort 50%/20% (w/v, 0,3 ml vardera) sackaros steg gradient av ultracentrifugering för 1 h vid 400 000 x g. Den slutliga protein avkastningen bör vara minst 1 mg.</li>
		<li>Lägg till 0,05% (w/v) Coomassie G-250 till solubilisate och lasta provet på gelen. Begränsa protein belastningen till en 10-15 μg/mm2 gel Lane tvärsnitt för att få hög upplösning och undvika artefakter till följd av protein nederbörd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BN-sidan körförhållanden<ol>
<li>För löpbuffertar, Förbered en standardkatodbuffert som består av 50 mM tricin, 15 mM BIS-Tris och 0,01% Coomassie G-250. Bered en standardanodbuffert som består av 50 mM BIS-tris (pH = 7,0).</li>
		<li>Kör en förberedande BN-sida vid 10 ° c över natten med hjälp av en trestegs spännings protokoll13 bestående av: en jämnings fas för 30 min vid 100 V, sedan en långsam (3 h) ramp till maximal spänning (40-50 V/cm gel längd) som slutligen bibehålls i minst 6 h för Endpoint med fokus på proteiner. Obs: det rekommenderas att pausa elektrofores när migrations fronten har nått mitten av gelen och byta katodbufferten för färsk buffert utan Coomassie G250. Detta bidrar till att undvika nederbörd artefakter i gelen som följd av lokala kollaps av matrisen pore struktur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. gel provtagning och matsmältning
<ol><li>Excision av gel körfält<ol>
<li>Efter körningen, skanna geler för dokumentationsändamål och samtidigt hålla den mellan glasplattorna.</li>
		<li>Ta isär plattorna och punktskatter på Lane (s) av intresse.</li>
		<li>Ta en prov remsa av körfält för analys med 2D BN/SDS-sida och protein färgning eller västra blotting (som visas i figur 1B) för att bestämma regioner av intresse, effektiv komplex storlek upplösning, och protein överflöd.</li>
		<li>Fix valda gel körfält två gånger i minst 30 min med 30% (v/v) etanol och 15% (v/v) ättiksyra.</li>
		<li>Överför provet till inbädda medium och låt det blötlägga och jämbrera i minst 2 h vid 4 ° c, samtidigt som gelplattan hålls i slow motion på en orbitalskak. Anmärkning: gel separation bör inspekteras noggrant för övergripande separation kvalitet och migration artefakter. Gel band som representerar dominerande proteiner bör vara distorsionsfria och homogena i intensitet. Lokala artefakter på gelen bör vara censurerade eller lämnas utanför analys.</li>
	</ol></li>
	<li>Inbäddning och kryomicrotome-skärning Obs: Detta är en förbättrad version av inbäddnings förfarande beskrivs och foto dokumenterade tidigare som gör det möjligt för inbäddning och skivning av bredare gel körfält på upp till 8 cm11.<ol>
<li>Först skär fast gel körfält i sektioner (här, 3 cm) exakt parallellt med proteinet migration front/band mönster. För enklare hantering, placera varje sektion på en plastfilm stöd med samma dimensioner.</li>
		<li>Överför banorna till ett öppet rör med proppar (stängda på botten, centralt perforerade på toppen, både exakt i linje med de övre och nedre ändarna av gel avsnitt).</li>
		<li>Doppa cylindern kort i flytande kväve för att snabbt initiera solidifiering. Det genomskinliga inbäddnings mediet stelnar inom några sekunder och blir vitt i färg.</li>
		<li>Fyll håligheten med inbäddning medium, kort doppa den i flytande kväve, och frysa cylindern vid-20 ° c i flera timmar. Obs: kylning av cylindern snabbt genom att doppa den i flytande kväve hjälper till att undvika förskjutning av gelplattan i röret. Snedvridning bör undvikas för att säkerställa hög upplösning i följande MS-analys.</li>
		<li>Efter demontering, ta bort plastfilmen och överföra blocket med den inbäddade gel avsnitt till en kyld, större i diameter, metallcylinder placeras på en platt stöd (dvs., petriskål) och förseglade med inbäddning medium på utsidan av cylindern. Fyll cylindern med inbädda medium och frys ordentligt.</li>
		<li>Upprepa denna procedur med den andra sidan av cylindern för att få en solid block med plana yta ytor.</li>
		<li>Ta bort blocket från cylindern, limma den med inbäddnings medium på en förfuktad metallhållare, och sätt in hållaren i cryoslicing maskin (cryotome). Ytan på blocket måste noga anpassas med avseende på skivning planet. Låt den jämvikt vid den optimala temperaturen för skivning processen (här,-15 ° c). Obs: Använd en långsamt framskrider manuell skivning cykel av 0,1 mm steg storlek tills slå ytan av den inbäddade gel avsnitt för att säkerställa korrekt positionering.</li>
		<li>Skörda gelen skivor en efter en, med en slutlig önskad tjocklek av 0,25 mm steg storlek, och överföra dem individuellt till reaktionsrör med låg proteinbindnings egenskaper. Notera: i denna uppsättning kan enhetliga gel skivor lätt erhållas så tunna som 0,1 mm och så tjocka som 0,5 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Tryptic matsmältningen<ol>
<li>Utför i-gel tryptic nedbrytning efter omfattande tvättning av gel skivorna (minst tre ytterligare omgångar av tvättning rekommenderas för att avlägsna polymera komponenter i inbäddnings mediet) enligt ett standardförfarande11.</li>
		<li>Vakuum-torr eluerade peptider och lös åter i 0,5% (v/v) trifluorättiksyra genom att skaka vid 37 ° c (10 min) följt av Bath ultraljudsbehandling (5 min) och kort centrifugering.</li>
	</ol></li>
</ol>3. masspektrometri
<ol><li>nanoHPLC och MS set-up<ol>
<li>Ladda smält prover på en C18-precolumn (partikelstorlek = 5 μm; diameter = 300 μm) med 0,05% (v/v) trifluorättiksyra med en (Split-Free) nano-HPLC kopplad till en masspektrometer med hög upplösning.</li>
		<li>Elute fångade peptider med en aqueous-organisk gradient (Eluent A): 5 min 3% B, 120 min från 3% B till 30% B, 20 min från 30% B till 99% B, 5 min 99% B, 5 min från 99% B till 3% B, 15 min 3% B (flödeshastighet = 300 nL/min). Anmärkning: csBN-MS gel skivor resulterar vanligtvis i prover med låg till mellanliggande peptid överflöd och en begränsad grad av komplexitet. nanoLC-MS/MS-analys bör därför utföras med en uppsättning som ger rimlig känslighet och sekvenserings hastighet, hög Mass upplösning (> 100000) och maximalt dynamiskt omfång (effektivt 3-4 storleksordningar). Det kräver dock inte långa Kolumndimensioner eller elueringgradienter som är längre än 3 timmar.</li>
		<li>Separata eluerade peptider i en EMITTER (i.d. 75 μm; spets = 8 μm) packade manuellt ca 20 cm med C18-material (partikelstorlek = 3 μm). Elektrospray proverna på 2,3 kV (Positive Ion-läge) i den uppvärmda överförings kapillär (250 ° c) i masspektrometern.</li>
		<li>Utför analyser med följande instrumentinställningar11: maximal insprutningstid för MS/ms = 400 MS; uteslutnings tid = 60 s; minsta signal tröskel = 5 000 antal, topp 10 prekursorer fragmenterad; isolerings bredd = 1,0 m/z). Anmärkning: för att underlätta kalibrering av massa, retentionstid och tilldelning av peptid signaler i ett stort antal dataset eller mätningar, rekommenderas att utföra respektive MS-mätserie utan avbrott eller förändringar i parametrar och hårdvara ( t. ex. på samma C18-kolonn/sändare).</li>
	</ol></li>
	<li>Protein identifiering (MS-data utvärderade enligt tidigare beskrivning11)<ol>
<li>Extrahera topplistor från fragment Ion Spectra med hjälp av verktyget "msconvert. exe" (del av ProteoWizard).</li>
		<li>SKIFT alla prekursor m/z-värden för varje datamängd med median-m/z-förskjutningen av alla peptider som tilldelats proteiner i en preliminär databas sökning med 50 ppm peptid massa tolerans.</li>
		<li>Söka den korrigerat topp listerna med en passande söka motor (här, MASCOT 2.6.2) emot all mus intrade om UniProtKB/schweizisk-prot data banken (frige 2018_11).</li>
		<li>Välj "acetyl (protein N-term)", "Karbamidometyl (C)", "GLN | pyro-GLU (N-benämna Q), Glu | pyro-GLU (N-term E) "," oxidation (M) "och" Propionamid (C) "som variabla modifieringar.</li>
		<li>Ange peptid och fragment massa tolerans till ± 5 ppm och ± 0,8 da, respektive, och tillåta en missad tryptic klyvning. Ställ in förväntat värde cut-off för peptid-ID till 0,5 eller mindre. Använd en lockbete-databassökning för att fastställa den falska positiva identifierings frekvensen (FDR). Ställ in FDR till 1% eller tillämpa ytterligare kvalitetskriterier för att säkerställa tillförlitlig identifiering. Anmärkning: det presenterade experimentet identifierade mer än 3 500 proteiner, med en genomsnittlig peptid FDR på 4,4 ± 0,77% (n = 101 segment prov), eller 3 000 proteiner när peptid FDR var inställd på 1%. Viktigare, strängare kriterier användes för val av profilerade proteiner (2 568). Det inkluderade alla proteiner som identifierades med minst två peptider, varav minst en av dem var proteinspecifika, i minst ett av 101-segmentsproverna.</li>
	</ol></li>
	<li>Proteinkvantifiering<ol>
<li>Använd peptid signal intensiteter (Peak Volumes [PVs]) för proteinkvantifiering som erhålls från FT fullständiga skanningar och korrekt för retentionstid och massa Skift med hjälp av lämplig programvara (här, MaxQuant v 1.6.3).</li>
		<li>Justera MS-datauppsättningar en i taget till referens (totalt genomsnitt) peptid elueringstider med LOESS regression. Tilldela PVs till peptider antingen direkt (MS/MS-baserad identifiering) eller indirekt (dvs. baserat på deras matchande m/z och elueringstid inom mycket snäva toleranser). Anmärkning: detta protokoll använder egen programvara för tilldelning av "infogade" kallas peptider. Ställ in parametrar resulterar i effektiv m/z och elueringstid som matchar toleranser på ± 2 ppm respektive ± 1 min (se figur 2A, B).</li>
		<li>Korrekt för systematiska Run-to-run variationer i peptid belastning och joniseringseffektivitet genom en peptid-intensitet som beräknats utifrån median skillnaderna mellan de relativa peptid intensiteterna mellan de angränsande segment proven (figur 2C).</li>
		<li>Filtrera PV-data för extremvärden och återstående falskt positiva tilldelningar som identifierats av intern PV konsekvensanalys.</li>
		<li>Normalisera PVs för varje peptid till deras maximala värden över alla segment datauppsättningar som ger relativa peptid överflöd profiler.</li>
		<li>Slutligen, beräkna relativa protein överflöd profiler som medelvärden av minst två (och upp till sex eller 50%, vilket värde är större) av de bästa korrelera peptid profiler över ett fönster av tre på varandra följande skivor. Detta gör det möjligt att överbrygga saknade PV värden och minska bullret. Anmärkning: Detta resulterade slutligen i 2 545 (av 2 568 förvalda) protein profiler (figur 2D).</li>
	</ol></li>
	<li>Karaktärisering av proteinkomplex<ol>
<li>Analysera protein profiler genom att först utföra Peak Detection med den lokala Maxima-metoden, och i följd anpassa normala fördelningar till dessa toppar, vilket ger positionen (dvs. segment index eller skenbar komplex storlek) av deras maxima och FWHM (full bredd vid maximal intensitet) (inuppsättning av figur 4). I datauppsättningen analyseras profiler automatiskt med hjälp av anpassade skript. De minsta FWHM-värdena är indikativa för den effektiva storleks upplösningen för metoden (här, 6 x 0,25 = 1,5 mm).</li>
		<li>Använd referens protein komplexa toppar med definierad molekylmassa (som rapporterats i databasen UniProtKB/Swiss-prot) för linjär regressionsanalys av log10-värden (förutsedd molekylmassa) för att omvandla segmentnummer index till skenbara molekyl storlekar (dvs. skenbar komplex storlek i kDa). Anmärkning: 23 markör komplex i provet valdes i denna studie (figur 4) baserat på (i) monodisperse former av profil toppar, (II) experimentellt stöd av molekylvikter, och (III) fördelningar längs de undersökta BN-Page gel avsnitten.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Majeran, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+C4+Differentiation+for+Chloroplast+Membrane+Proteomes+in+Maize+Mesophyll+and+Bundle+Sheath+Cells.">Consequences of C4 Differentiation for Chloroplast Membrane Proteomes in Maize Mesophyll and Bundle Sheath Cells.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 7, 1609-1638 (2008).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes.">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li><li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex.">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 538-549 (2012).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling.">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS ONE. 8 (7), e68340 (2013).</li><li>W&#246;hlbrand, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+membrane-protein+complexes+of+the+marine+sulfate+reducer+Desulfobacula+toluolica+Tol2+by+1D+blue+native-PAGE+complexome+profiling+and+2D+blue+native-/SDS-PAGE.">Analysis of membrane-protein complexes of the marine sulfate reducer Desulfobacula toluolica Tol2 by 1D blue native-PAGE complexome profiling and 2D blue native-/SDS-PAGE.</a> Proteomics. 16 (6), 973-988 (2016).</li><li>Takabayashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCoM-DB+Update:+A+Protein+Co-Migration+Database+for+Photosynthetic+Organisms.">PCoM-DB Update: A Protein Co-Migration Database for Photosynthetic Organisms.</a> Plant and Cell Physiology. 58 (1), e10 (2017).</li><li>Senkler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+complexome+of+Arabidopsis+thaliana.">The mitochondrial complexome of Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 89 (6), 1079-1092 (2017).</li><li>de Almeida, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+electron+transport+systems+of+an+anammox+bacterium:+A+complexome+analysis.">Membrane-bound electron transport systems of an anammox bacterium: A complexome analysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (10), 1694-1704 (2016).</li><li>Anand, R., Strecker, V., Urbach, J., Wittig, I., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mic13+Is+Essential+for+Formation+of+Crista+Junctions+in+Mammalian+Cells.">Mic13 Is Essential for Formation of Crista Junctions in Mammalian Cells.</a> PLoS ONE. 11 (8), e0160258 (2016).</li><li>Eydt, K., Davies, K. M., Behrendt, C., Wittig, I., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cristae+architecture+is+determined+by+an+interplay+of+the+MICOS+complex+and+the+F1FO+ATP+synthase+via+Mic27+and+Mic10.">Cristae architecture is determined by an interplay of the MICOS complex and the F1FO ATP synthase via Mic27 and Mic10.</a> Microbial Cell. 4 (8), 259-272 (2017).</li><li>M&#252;ller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoslicing+Blue+Native-Mass+Spectrometry+(csBN-MS),+a+Novel+Technology+for+High+Resolution+Complexome+Profiling.">Cryoslicing Blue Native-Mass Spectrometry (csBN-MS), a Novel Technology for High Resolution Complexome Profiling.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (2), 669-681 (2016).</li><li>Castonguay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two-pore+channel+TPC1+is+required+for+efficient+protein+processing+through+early+and+recycling+endosomes.">The two-pore channel TPC1 is required for efficient protein processing through early and recycling endosomes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10038 (2017).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li><li>Banyard, S. H., Stammers, D. K., Harrison, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+density+map+of+apoferritin+at+2.8-A+resolution.">Electron density map of apoferritin at 2.8-A resolution.</a> Nature. 271 (5642), 282-284 (1978).</li><li>Dettmer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+protein+147+(TMEM147)+is+a+novel+component+of+the+Nicalin-NOMO+protein+complex.">Transmembrane protein 147 (TMEM147) is a novel component of the Nicalin-NOMO protein complex.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (34), 26174-26181 (2010).</li><li>Kimberly, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-secretase+is+a+membrane+protein+complex+comprised+of+presenilin,+nicastrin+Aph-1,+and+Pen-2.">Gamma-secretase is a membrane protein complex comprised of presenilin, nicastrin Aph-1, and Pen-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6382-6387 (2003).</li><li>Hong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+PIG-U+and+yeast+Cdc91p+are+the+fifth+subunit+of+GPI+transamidase+that+attaches+GPI-anchors+to+proteins.">Human PIG-U and yeast Cdc91p are the fifth subunit of GPI transamidase that attaches GPI-anchors to proteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1780-1789 (2003).</li><li>Van Damme, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+ATP6V1E1+or+ATP6V1A+Cause+Autosomal-Recessive+Cutis+Laxa.">Mutations in ATP6V1E1 or ATP6V1A Cause Autosomal-Recessive Cutis Laxa.</a> The American Journal of Human Genetics. 100 (2), 216-227 (2017).</li><li>Budenholzer, L., Cheng, C. L., Li, Y., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+Structure+and+Assembly.">Proteasome Structure and Assembly.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3500-3524 (2017).</li><li>Heusel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex-centric+proteome+profiling+by+SEC-SWATH-MS.">Complex-centric proteome profiling by SEC-SWATH-MS.</a> Molecular Systems Biology. 15 (1), e8438 (2019).</li><li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Forster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome.">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nature Methods. 9 (9), 907-919 (2012).</li></ol>

Författaren Uwe Schulte är anställd och delägare i Logopharm GmbH som producerar den komplexa 47 som används i denna studie. Företaget tillhandahåller Komplexitesmedel till akademiska institutioner på ideell basis.

Den presenterade studien bygger på csBN-MS teknik som tidigare riktats med en mitokondriell förberedelse11 och införlivas förbättringar i provberedning, gel bearbetning, och MS datautvärdering. Fokuserad analys av en del av den storskaliga separation BN-PAGE gel som en omfattande uppsättning data som visar kvalitetsmått jämförbara med studien med mitokondriella membran. Mass-och retentionstid fel samt Run-to-run variationer hölls mycket låg och som grund för att fastställa tillförlitliga protein överflöd profiler. Storleks upplösningen verkade vara bra, med halva maximala topp bredder så låga som sex skivor (motsvarande 1,5 mm, figur 4) och relativa storleksskillnader på mindre än 10% lösta (figur 3, figur 5A). Dessa värden uppfyllde inte helt kvalitets upplösningen för den tidigare csBN-MS-analysen av mitokona (trots den mindre stegstorleken för gel provtagning), men de är betydligt bättre än prestandan hos konventionella BN-MS-eller storleks uteslutnings MS närmar sig20 som nyligen har blivit populära.
Vikten av en hög effektiv komplex storlek upplösning är understryks av simulerings experiment i figur 3 (med hjälp av TPC1-associerade komplex) som knappast kan lösas genom 2D BN/SDS-Page Western blot-analys (figur 1B). Dessa resultat tyder på att 0,25 mm-skivning i detta fall resulterade i en del översampling, men det visade sig ändå vara användbart för eliminering av "kvantifieringsbrus" utan att kompromissa med effektiv storleks upplösning. Således, i linje med tidigare resultat11, en provtagning steg storlek på ~ 0,3 mm är i allmänhet rekommendabelt.
Särskilt, diskriminering av TPC1-associerade komplex är helt förlorad med 1 mm gel provtagning, som är den minsta steg storlek som tillhandahålls av manuell skivning i konventionella BN-MS5,6. Detta kan förklara det faktum att trots kraftfulla MS-teknik finns, mycket få proteinkomplex och subenheter har identifierats de Novo av complexome profilering. Förutom sin goda förmåga att lösa, erbjuder csBN-MS hög mångsidighet. Membranbundna komplex och lösliga proteinkomplex som sträcker sig från 50 kDa till flera MDa kan lösas effektivt i ett enda experiment med minsta bias11. Detta kontrasterar mot alternativa separations tekniker som används för complexome-profilering som storleks uteslutning eller jonbyteskromatografi, som fungerar med undergrupper av lösliga proteiner med vissa storleksintervall eller laddningsegenskaper. På nedåtsidan, csBN-MS är mindre skalbar (maximal belastning på ~ 3 mg protein per gel), kan vara tekniskt utmanande, och kan inte automatiseras.
Sammantaget visar resultaten att csBN-MS-baserad complexome-profilering framgångsrikt kan tillämpas på icke-mitokondriella mål, utan även på vissa associerade utmaningar. Sålunda, effektiv utvinning och biokemisk stabilitet av proteinkomplex kräver mer optimering, och rengöring steg och kan fortfarande vara begränsad. Inom den undersökta storleks fönster, antalet välfokuserade, monodisperse proteinkomplex var verkligen betydligt lägre (data som inte visas) jämfört med ett mitokondriellt prov. Det rekommenderas också att sänka BN-sidan prov laster för att få acceptabel gel separation. Högre laster kan kräva bredare gel banor som är svårare att bearbeta ordentligt för skivning (Se medföljande video). Dessutom var protein komplexiteten hos proverna högre (ungefär två gånger) än de mitokonshärledda segmentets sammandrag, vilket ledde till mer saknade PV-värden och ett reducerat dynamiskt omfång. Faktum är att vissa små proteiner som förväntas vara en del av komplexen som visas i figur 5 saknades i analyserna. Dessa problem kan lösas i framtiden genom att använda snabbare och känsligare MS-instrument eller data oberoende förvärvsmetoder.
Provberedning är mycket kritisk för proteinkomplex hämtning, stabilitet, och gel separation kvalitet. Parametrar och procedurer bör optimeras för varje källa vävnad, cell lysate, membran (fraktion), och proteinkomplex av intresse. Följande allmänna rekommendationer kan hjälpa till att förlänga ansökningarna från csBN-MS:
i förbereda prover som är färska och undvika uppvärmning/frysning, kraftiga utspädningar, förändringar i buffertförhållanden och onödiga förseningar,
II) användning av buffertar som i huvudsak saknar salter (Ersätt med 500-750 mm betain eller aminokapronsyra), om ett neutralt pH, och som innehåller upp till 1% (w/v) icke-denaturerande rengöringsmedel (protein: förhållandet mellan tvättmedel och 1:4-1:10 för att lösgöra membran proteinkomplex, inget tvättmedel krävs för lösliga proteinkomplex).
III) noggrann testning och justering av tvättmedels förhållandena genom analytisk BN-sida, eftersom dessa kan påverka effektiviteten av komplicerad solubilisering, representation av membranprotein komplex i provet, stabilitet och homogenitet hos miceller för protein tvättmedel. De senare är förutsättningar för proteiner att fokusera som distinkta band/komplexa populationer på BN-sida geler. Tidigare litteratur erbjuder ett brett sortiment av neutrala rengöringsmedel. Emellertid, DDM (n-dodecyl β-d-maltoside)1,2,4,5,6 och digitonin3,5,7,8, 9,10,13,18 har varit de mest populära valen för BN-MS analyser hittills. Det måste understrykas att alla tvättmedel villkor nödvändigtvis utgör en kompromiss mellan solubilisering effektivitet och bevarande av protein interaktioner och kanske inte lika lämpade för alla typer av målprotein och källmaterial;
(IV) ta bort laddade polymerer som fibriller, glödtrådar, polylysin, DNA, och riklig lägre molekylvikt komponenter (dvs, metaboliter, lipider, eller peptider). Detta kan åstadkommas genom ultracentrifugation, gelfiltrering, eller dialys. Detta är särskilt viktigt för totala cell-eller vävnads lysater;
v) tillsats av Coomassie G-250 (slutlig koncentration 0,05%-0,1%) och sackaros (för att öka densiteten för lastning, slutlig koncentration 10%-20% [w/v]) till provet strax före lastning, för att klara av kort ultracentrifugation, Ladda provet utan störning, och starta körningen omedelbart därefter.
Som ett framtidsperspektiv erbjuder csBN-MS-baserade complexome-profilering alternativ för multiplexering för att studera proteinkomplex dynamik eller förändringar relaterade till specifika biologiska förhållanden. Kombinerad separation av metaboliskt märkta prover som föreslagits för storleks uteslutnings baserad profilering21 förefaller okomplicerad, men den kan hämmas av spontan subenhet utbyte i komplex som förekommer oberoende av den använda separation Metod. Alternativt kan märkta prover lösas i angränsande gel körfält, som sedan kan samskivade eller kombinerade efter smälta för differential analys med hög känslighet och robusthet.

BN-PAGE separation var först direkt kopplad till LC-MS analys (BN-MS) av Majeran1 och Wessels2 forskargrupper med manuell skärning av BN-sida gel körfält. Deras analyser identifierade ett antal rikliga membranprotein komplex med känd subenhet sammansättning från växt plastids och HEK cell mitokona, respektive. Dessa analyser var dock långt ifrån heltäckande och tillät inte en opartisk identifiering av nya sammansättningar. Prestanda för masspektrometrar och märknings fria kvantifieringsmetoder har förbättrats avsevärt sedan dess, vilket har möjliggjort omfattande BN-MS-analyser. Detta har myntat termen "complexome profilering". Till exempel, Heide och medarbetare analyserade råtta hjärtat mitokondrien identifiera och klustring 464 mitokondriell proteiner, vilket bekräftar många kända sammansättningar. Dessutom fann de TMEM126B vara en roman och avgörande subenhet av en specifik församling komplex3. Jämförbara resultat (med 437 mitokondriella protein profiler) erhölls i en parallell studie av HEK-cellmitochondria4.
Trots dessa förbättringar har flera frågor förblivit att begränsa den fulla potentialen av BN-MS för complexome profilering. En stor begränsning är en effektiv storleks matchning av komplex som bestäms av två faktorer: (i) kvaliteten på BN-sidan separation, som beror på enhetlighet i gelmatrisen pore lutning samt stabilitet/löslighet av provet komplex, och (II) steg storlek på gel sampling, som är i bästa fall 1 mm vid användning av konventionella manuella skivning5,6. Dålig storlek upplösning inte bara missar subtila komplexa isoformer och heterolikteter, men det också negativt påverkar det dynamiska omfånget och förtroendet för opartisk, de Novo subenhet tilldelning och kvantifiering.
Andra utmaningar är precisionen för proteinkvantifiering och täckningen av det faktiska dynamiska omfånget av protein överflöd i provet genom masspektrometriska analyser. Därför har tillämpningen av BN-MS complexome-profilering i stort sett begränsats till biologiska prover med lägre komplexitet, högt uttryck för målkomplex och gynnsamma solubiliseringsegenskaper (dvs. plastider, mitokon mikroorganismer)6,7,8,9,10.
Vi introducerade nyligen cryomicrotome skivning-Assisted BN-MS (csBN-MS), som kombinerar exakt sub-millimeter provtagning av BN-sida gel körfält med omfattande MS-analys och utarbeta MS databehandling för bestämning av protein profiler med hög förtroende11. Ansökan till en mitokondriell membran beredning från råtta hjärnor visat tidigare otillfredsställda effektiv komplex storlek upplösning och maximal täckning av oxidativ respiratorisk kedja komplexa (oxfos) subenheter (dvs., 90 av 90 MS-tillgänglig). I detta exempel identifierades också ett antal nya protein sammansättningar.
Beskrivs här är optimerade procedurer för förberedande skala BN-sida separation av proteinkomplex (inte begränsat till en viss biologisk källa), gjutning av stora förberedande BN-sida geler, cryomicrotome skivning av breda gel körfält, och MS data Bearbetning. Prestanda för högupplöst profilering demonstreras för ett proteinkomplex beredning från mus njure endosome-berikade membran. Slutligen diskuteras fördelarna med ökad upplösning och precision i masspektrometriska kvantifieringen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>#1610158</td>
			<td>Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>#1610154</td>
			<td>Recommended for acrylamide gradient gel solutions &#62;13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby Protein Blot Stain</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>#1703127</td>
			<td>Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Serva</td>
			<td>no. 35050</td>
			<td>Centrifugate stock solutions prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ComplexioLyte 47</td>
			<td>Logopharm</td>
			<td>CL-47-01</td>
			<td>Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Medium / Tissue Freezing Medium</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14020108926</td>
			<td>Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>any supplier, important for making gel section embedding tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>broad razor blade</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal tube / cylinder, ca. 4 cm long</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>mold for embedding and freezing of gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Nr. 0030108116</td>
			<td>highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing-grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 &#181;m</td>
			<td>Dionex / Thermo Scientific</td>
			<td>P/N 160454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoTip emitter (i.d. 75 &#181;m; tip 8 &#181;m)</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>FS360-75-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 &#181;m)</td>
			<td>Dr. Maisch GmbH</td>
			<td>r13.93.</td>
			<td>columns packed manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-TPC1 antibody</td>
			<td>Gramsch Laboratories</td>
			<td>custom production</td>
			<td>described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>CY-1300</td>
			<td>described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>#B1325</td>
			<td>described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-microtome Leica CM1950</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047743905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean II Cell with wetblot unit</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penguin Midi Gel Electrophoresis System</td>
			<td>PeqLab</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>for BN-PAGE (not sold any more)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera</td>
			<td>Zeiss / Photometrics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump (IP high precision multichannel)</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM940</td>
			<td>for casting of gradient polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gradient mixer with stirring (two chambers)</td>
			<td>selfmade, alternatively Bio Rad</td>
			<td>1652000 or 1652001</td>
			<td>for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor</td>
			<td>Sorvall / Thermo Scientific</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>for sample preparation (not sold any more)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLCnano HPLC</td>
			<td>Dionex / Thermo Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Elite mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMAZQ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution complexome profiling by cryoslicing bn-ms analysis

Proteiner utövar i allmänhet biologiska funktioner genom interaktioner med andra proteiner, antingen i dynamiska protein sammansättningar eller som en del av stabilt bildade komplex. Den senare kan vara elegant lösas enligt molekylstorlek med hjälp av infödda polyakrylamid gel elektrofores (BN-sida). Koppling av sådana separationer till känslig masspektrometri (BN-MS) har varit väletablerad och teoretiskt möjliggör en uttömmande bedömning av extraherbara complexome i biologiska prover. Men, detta tillvägagångssätt är ganska mödosam och ger begränsad komplex storlek upplösning och känslighet. Också, dess tillämpning har förblivit begränsad till rikliga mitokondriella och plastida proteiner. För en majoritet av proteiner saknas det således fortfarande information om integration i stabila proteinkomplex. Presenteras här är en optimerad metod för complexome profilering består Preparative-skala BN-sida separation, sub-millimeter provtagning av breda gel körfält genom cryomicrotome skivning, och masspektrometriska analys med etikett-fri protein kvantifiering. Procedurerna och verktygen för kritiska steg beskrivs i detalj. Som ett program, beskriver rapporten complexome analys av en solubilized endosome-berikad membran fraktion från mus njurar, med 2 545 proteiner profilerade totalt. Resultaten visar identifiering av enhetliga, låg-överflöd membranproteiner såsom intracellulära jonkanaler samt hög upplösning, komplexa protein monteringsmönster, inklusive glykosylering isoformer. Resultaten är i samförstånd med oberoende biokemiska analyser. Sammanfattningsvis möjliggör denna metod för omfattande och opartisk identifiering av protein (Super) komplex och deras subenhet sammansättning, vilket ger en grund för att undersöka stökiometri, montering och interaktion dynamik av proteinkomplex i någon biologiska systemet.

De allra flesta konventionella BN-MS-studier samt den nyligen inrättade högupplöst csBN-MS-metoden har tillämpats på mitokondriella och plastida preparat som är (i) lätt tillgängliga, (II) har begränsad komplexitet, och (III) uttryckliga proteinkomplex vid höga densiteter. Detta protokoll utökar tillämpningen av högupplöst complexome-profilering till icke-mitokondriella membran som uttrycker låg-rikliga proteiner, om vilka lite information om deras integration i komplex finns tillgänglig. I demonstrationssyfte valde vi en endosome-berikad membran beredning från mus njure erhålls genom densitet gradient centrifugering.
Optimering av denna beredning har vägts av markör protein TPC1 som bildar intracellulära jonkanaler huvudsakligen lokaliserade till tidig och återvinning hos12. Det är också starkt uttryckt i renal proximala tubulär celler, som visas av immunohistokemisk analys av njure vävnad sektioner (figur 1A). Dessa membran var försiktigt solubilized (komplexitet 47 vid ett lågt protein: tvättmedel förhållandet 1:8) och koncentrerade på en sackaros kudde av ultracentrifugation. Den senare visade sig vara ett viktigt steg för att avlägsna överskott lägre molekylvikt komponenter (dvs., rengöringsmedel, lipider, salter, organiska polymerer, och metaboliter) som tenderar att negativt påverka upplösningen av förberedande BN-sida separationer.
Komplex separation på en infödd 1%-13% (w/v) polyakrylamid gradient gel (figur 1B, mellersta panelen) visade starkt färgade protein band med mycket lite migration artefakter. SDS-PAGE separation av en smal BN-PAGE gel remsa (figur 1b, ram förpackad i rött) som en andra dimension följt av Western blot-analys visade ett väl löst mönster av distinkta TPC1-associerade komplexa populationer (figur 1b , övre panelen, markerad med röda pilar), troligen till följd av Association med ytterligare proteinsubenheter och/eller posttranslationella modifieringar (såsom glykosylering12). En 3 cm del av intresset var excised, fast, och bearbetas för cryomicrotome skivning som beskrivs11. De enskilda stegen i detta förfarande (i synnerhet den exakta anpassningen av den breda gel sektionen), som är av avgörande betydelse för att bevara upplösningen under provtagning, dokumenteras i den medföljande videon. Den inbäddade gel sektionen var slutligen skuren i 101 gel skivor med en enhetlig tjocklek på 0,25 mm (figur 1B, nedre panelen), som var separat smält och analyseras med hög prestanda LC-kopplad masspektrometri.
Förutom storleks matchning är kvaliteten på proteinkvantifiering nyckeln för lyckad complexome-profilering. Med MS set-up och inställningar som används, analys av proverna var ganska omfattande, vilket resulterade i en genomsnittlig identifiering av mer än 1 000 proteiner och 10 000 peptider (8 200 av vilka var proteinspecifika) per skiva, och cirka 3 000 proteiner och 43 000 peptider (38 500 av vilka var proteinspecifika) totalt. På grund av den stokastiska karaktären hos data beroende MS/MS-sekvensering och dess begränsningar i dynamiskt omfång var intensitetsinformationen fortfarande fragmentarisk för mindre rikliga proteiner. Därför utfördes en utarbetad MS databehandling förfarande11som bygger på exakt tilldelning av peptid signaler (Peak volymer [PVS] = peptid-relaterade signal intensiteter integreras över m/z och tid) över hela serien av DataSet.
Som framgår av figur 2A, B, var avvikelser av peptid signaler i massa och retentionstid som återstod efter kalibreringen identiska för MS-sekvenserade och för indirekt tilldelade PVS (med mycket snäva toleranser för < 1 ppm och < 0,5 min för 95% av PVs), vilket indikerar en mycket låg skattesats för falskt positiv PV-tilldelning. Återstående avvikare filtrerades baserat på deras överensstämmelse med andra relaterade PVs. Eftersom alla MS-mätningar utfördes i följd på samma LC-MS-uppsättning utan ändringar i parametrar eller maskinvarukomponenter, kör-till-kör-variationer (bestäms som medianvärdet för alla PV-intensiteter i ett prov i förhållande till dem i de angränsande sektorerna) var små och enkelt elimineras genom omskalning av PV dataset (figur 2C). Den resulterande peptid intensitet information användes sedan för att rekonstruera 2 545 protein relativa överflöd profiler. Som framgår av figur 2Dbaserades mer än 75% av dessa protein profiler på minst tre oberoende proteinspecifika peptider.
Därefter bedömde protokollet relevansen av stegstorleken på BN-PAGE gel provtagning för upplösning av proteinkomplex. För detta ändamål förenades segment datauppsättningar genom att summera PV-informationen från två, tre eller fyra på varandra följande skivor, vilket simulerar resultatet för steg storlekar på 0,5 mm, 0,75 mm och 1 mm (jämfört med det ursprungliga urvalet på 0,25 mm). Figur 3 illustrerar de resulterande överflöd profiler för protein TPC1 som ett exempel (a-D). Vid 0,25 mm, relativa intensiteter och storlek separation av TPC1-associerade komplexa populationer (figur 3A) var fint överens med resultaten från Western blot analys (figur 1B, övre panelen); även om profilen visade en del buller, främst till följd av saknade värden ("luckor") i PV matris som används för kvantifiering.
Sammanfogning av två skivor motsvarande 0,5 mm upprätthöll rätt intensitet och separation av de TPC1-associerade komplexen och avlägsnat kvantifieringsbrus (figur 3B). Större steg storlekar på 0,75 mm och 1 mm (figur 3C, D) ledde däremot till en förlust av storleks upplösning och AVSKAFFADE diskrimineringen av TPC1 komplexa subpopulationer. Det bör noteras att de allra flesta publicerade konventionella BN-MS-analyser använder manuellt skurna 2 mm skivor (cirka 60 för att täcka hela gel Lane)7,8,9,10.
Omvandling av migrations avstånd eller segment index till molekylstorlek baseras i allmänhet på markörer, antingen kommersiellt tillgängliga inhemska standard proteiner eller välkarakteriserade endogena proteinkomplex med känd subenhet sammansättning (mestadels [Super] komplex av den mitokondriella oxidativa andningskedjan [OXFOS])13. Men eftersom BN-sida separation är baserad på den effektiva molekylära tvärsnitt som bestäms inte bara av den molekylära massan utan också av 3D-struktur och antal tillhörande lipider, tvättmedel, och Coomassie molekyler, kan enskilda proteiner Visa större avvikelser. Därför valdes det att använda större uppsättningar av proteinkomplex som markörer11. Handlingen i figur 4 visar 23 utvalda markörer med en representativ subenhet som visas som en svart cirkel, vilket indikerar de log10 värdena för dess förväntade molekylmassa (enligt UniProtKB/Swiss-prot-databasen) vs. segment indexet för motsvarande profil topp maximum. Den senare erhölls från automatiseras Gaussian passar till den relativa överflöd data, som visas i den inuppsättning av figur 4 som visar exemplet med förkläde BCS1. Linjär regression (röd linje) som en funktion för att omvandla segment indexvärden till uppenbara molekylära storlekar, som varierade från 160-630 kDa, längs den undersökta gel avsnitt.
Slutligen tillhandahöll analysen information om väl karakteriserade komplex och visade att det fanns nya subenheter och komplexa sammansättningar. Exempel som belyser de olika aspekterna av komplexomen visas i figur 5 (a-C: proteiner uttryckta eller företrädesvis placerade i endosomala utrymmen; D-F: komplex från andra subcellulära lokaliseringar). Järn transportproteinet ferritin är känt för att bilda komplex från 24 ljus (FRIL1) och/eller tunga (FRIH) subenheter, med en total molekylvikt på 440 kDa14 (figur 5a, fylld pil). Under enhetsprofilerna (figur 5A) tyder på att det finns minst två mindre former av komplexet (med en skenbar massa på 360 kDa och 340 kDa; öppna pilar) med distinkta tunga/lätta kedje stoichiometrier (bättre synliga efter av figur 5A) som är rikligt närvarande i endosomer.
Nicalin-nomo1-komplex15 (figur 5D), gamma-secretase Core Complex16 (figur 5B) och GPI-transamidasmaskiner17 (figur 5E) visar fasta abundans av deras kärn subenheter över hela storleksintervallet och oberoende från Association med ytterligare proteiner. Detta indikerar att deras underordnade enheter är exklusiva för varandra. Vacuolar H+-atpases är multiproteinkomplex som monteras från en pool av mer än 20 subenheter på ett modulärt sätt med en total molekylvikt på cirka 900 kDa. I figur 5C avslöjas subkomplex med distinkta kompositioner från minst 17 subenheter, antingen motsvarande biologiska (DIS) monterings intermediärer eller subkomplex som genererats av försöks förhållandena, varav vissa också har observerades i en nyligen BN-MS-studie18. Ett annat multi-proteinkomplex exempel är proteasomen19 (figur 5F). Noggrann inspektion av överflöd profiler av alfa-och beta subenheter bildar 20s proteasom kärna föreslår två stora komplexa populationer med subtila skillnader i storlek (590 kDa och 575 kDa, indikeras med grå pilar) och integration av tre beta subenheter.
Sammanfattnings, csbn-MS complexome profilering av endosome-berikad njure membran ger omfattande och detaljerade resultat när det gäller (i) integrering av enhetliga, låg-rikliga målproteiner i komplex, (II) allmän komplex subenhet sammansättning och stoichiometri och (III) komplexa heterogen, understrukturer och (DIS) uppsamlings intermediärer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig1.jpg"> Figur 1: Preparative BN-sida separation av solubilized endosome-berikad membran från mus njure med intracellulära Channel TPC1 som en markör. (A) immunohistokemisk lokalisering av TPC1-protein i njurproximala tubuli av konfokalmikroskopi. Grön: anti-TPC1-antikropp12 -färgning visualiserad med sekundär Cy3-biotinylerad get-Antikanin-IgG; röd: en Lotus Tetragonolobus lektin (LTL, 10 μg/ml, FITC-konjugerat) som markerar den luminala ytan av proximala tubulus celler. Den infälld visar färgning av en motsvarande sektion från en TPC1-Ko njure som en negativ kontroll. Vita skalstreck är 20 μm. Även av NOTE är starkt TPC1 uttryck i intracellulära blåsor, känd från oberoende experiment för att representera tidigt och återvinning hos12. B) PREPARATIV BN-Page separation av 2,5 mg solubiliserade endosome-anrikade membran på en 1-13% (w/v) polyakrylamidgradient gel. En smal körfält (inramad i rött) klipptes för efterföljande SDS-PAGE/Western blot analys (övre panelen), lösa olika TPC1-associerade komplex och glykosylering mönster (röda pilar: anti-TPC1/anti-kanin HRP/ECL Prime; grön: positioner och förutspådde massor [MDa] av markörer proteinkomplex identifieras genom totalprotein färgning [SYPRO ruby blot Stain]) av blot. Från höger till vänster: na+/k+-transporterar ATPas, cytokrom b-C1 komplex dimer, ATP syntas, NADH: ubiquinone oxidoreduktas. En 3 cm del av intresset från gel Lane var excised, inbäddad i vävnad bädda medium, monterad, och skivade i 101 sektioner (0,25 mm) längs proteinet migration fronten med hjälp av en cryomicrotome (nedre panelen, se video länk). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig2.jpg"> Figur 2: nyckelparametrar som fastställer noggrannheten för MS-signaltilldelning och kvantifiering samt analys djup. A) fördelning av relativa Mass fel (i ppm) efter m/z-kalibrering av MS/MS sekvenserade (röda staplar) och indirekt tilldelad (dvs. baserat på nära matchande massa-och retentionstider, se protokoll; blå staplar) peptid signaler. Detta tyder på en slutlig massa fel på < 1 ppm (för 95% av signalerna/tilldelade PVs) och mycket låg frekvens av falskt positiva tilldelningar. B) distribution av tid avvikelser från nano-HPLC-retentionen från det totala genomsnittet efter uppslutning av peptid signaler med hjälp av Loess regression (se protokollet) och färgkodning som används i (a). Tidsfel är mindre än 30 s för > 95% av peptidsignalerna/tilldelade PVs.C) kör-till-kör-variation av de totala MS-intensiteter som ritas i förhållande till genomsnittet av de två angränsande proverna. Dessa skalningsfaktorer tillämpades på de råa PV-tabellerna för att minimera systematiska tekniska fel. D) peptid information som används för att beräkna proteiners relativa förekomst profiler. Efter filtrering proteinspecifika peptider för extremvärden, dåligt poäng, eller enstaka identifieringar (se protokollet), 2 545 protein överflöd profiler bestämdes, > 75% av dem baserades på minst tre peptider med rimligt förtroende. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig3.jpg"> Figur 3: kritisk effekt av steg storlek i gel sampling på complexome-upplösning på TPC1. Datauppsättningar sammanfogas genom att summera signalintensiteterna i grupper om 1, 2, 3 och 4 på varandra följande skivor (A-D, respektive) och bearbetas identiskt för att simulera olika steg storlekar i gel skivning som anges. TPC1 profilen visar några (översampling) buller på 0,25 mm men bra storlek upplösning på tre komplexa populationer (se även figur 1B), som till stor del bevaras på en 0,5 mm steg bredd. Diskrimineringen av dessa populationer blir förlorad när 1 mm närmar sig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig4.jpg"> Figur 4: bestämning av skenbar molekylvikt. 23 markerings komplex med definierad molekyl sammansättning (enligt UniProtKB/Swiss-prot) användes som storleks markörer. Logaritmiska värden för deras förväntade molekylvikter (i kDa) plottas mot profilens högsta maximala segment index för den indikerade representativa protein subenheten (fyllda cirklar i svart). Linjär Regressions anpassning till dessa data (röd linje) gav en funktion som omvandlar segment indexvärden till skenbara molekylvikter. Peak Maxima bestämdes av automatiserade Gaussian passar till protein profil toppar som visas i infälld (höger) för förkläde protein BCS1 (primärdata i blått, passar gränser som indikeras av orange linjer, Fit funktion i rött). Dessutom, dessa passar bestäms topp halv-maximal bredder (grön linje, 6,5 skivor, eller 1,6 mm för exemplet visas) med den skarpaste fokuserings komplex spänner runt en 1,5 mm gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60096/60096fig5.jpg"> Figur 5: exempel på del enhetsprofiler av proteinkomplex. Relativ proteinmängd kontra skenbar molekylvikt plottas för tung och lätt kedja av ferritin (a) som avslöjar molekylär heterogenitet av ferritin subenhet stoichiometri, tydligare synlig efter omskalning av överflöd (infällt). Fylld pil och öppna pilar betecknar hela komplexet (440 kDa) och två subkomplex, respektive. Den gamma-secretase (B) subenheter integreras kvantitativt i en enda kärna komplex population. Den subkomplex av vakuolär H+-atpases (C) uppvisade flera församlingar med distinkta subenhet sammansättning, alla uttryckta i endosomes. De nomo1 och nicalin proteiner (D) bildade en exklusiv komplex (den GPI-transamidase), som är en multi-subunit enzymatiska maskiner som bildar flera komplex. E) 20-talet proteasom Core Complex som visar (F) ett subkomplext mönster med två populationer som indikeras med pilar i grått och som alla kommer från andra subcellulära lokaliseringar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60096/60096fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis at JoVE.com

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

En mångsidig kryoslicing BN-MS protokoll med hjälp av en mikrotom presenteras för högupplöst complexome profilering.

Högupplöst Complexome-profilering genom att Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Det centrala målet för utvecklingen av csBN-MS-tekniken var att få omfattande tillgång till organisation och montering av proteinkomplex som ligger bakom signaltransduktion vid och över plasmamembranet av olika typer av vävnad och organ. csBN-MS ger för närvarande den högsta upplösningen mångsidighet för analys av inhemska proteinkomplex och deras subenhet sammansättning, särskilt med avseende på membranproteiner. Även om csBN-MS tekniken utvecklades för att analysera komplexa blandningar av membranprotein församlingar i gnagare hjärnan det lätt kan anpassas till analysen av någon typ av biologiska prov.Ett av de viktigaste stegen i vår metod är inbäddningen av gelbiten och dess korrekta anpassning till skärplanet innan skivning. Var noga med att inte riva eller att komprimera gelen och vara säker på att det inte lutas till skärplanet eftersom detta skulle minska upplösningen av analysen. Vår csBN-MS-teknik har flera praktiska steg som är avgörande för bra resultat.Det är lättare att visa hur de stegen ska utföras i detalj än genom att bara beskriva dem. För att börja detta förfarande använda en omrörning två-kammare gradient mixer drivs av en pump för att kasta en linjär eller en hyperbolisk por gradient gel. Förbered lösningar för den främre blandningskammaren och reservoarkammaren enligt textprotokollet.Starta omröraren och tillsätt 30 mikroliter av APS och 2,5 mikroliter temed till lösningen i den främre kammaren. Starta sedan pumpen och öppna den främre ventilen. Efter ungefär en minut, tillsätt 90 mikroliter aps och fem mikroliter av TEMED till reservoarkammaren och öppna kammarens anslutning.Låt gelen polymerisera långsamt och noggrant i minst 24 timmar vid rumstemperatur för att generera en homogen porstorleksgradient. Om den hålls fuktig kan den polymeriserade gelen förvaras upprätt vid fyra grader Celsius i upp till en vecka. Därefter förbereder lastningsplatserna genom att sätta in lämpliga utrymmen mellan glasplattorna för separering mellan 0,5 och 2,0 milligram protein.Springorna bör vara minst tre centimeter breda. För löpande buffertar, förbered en stående katodbuffert bestående av 50 millimolar tricine, 50 millimolar Bis-Tris, och 0,01%Coomassie G-250. Förbered en standardanodbuffert bestående av 50 millimolar Bis-Tris.Solubilize cirka 2,5 milligram membran och två milliliter solubilisering buffert som innehåller 1%icke-denaturering rengöringsmedel på is i 30 minuter. Sedan ultracentrifug vid 130, 000 gånger G i 11 minuter. Koncentrera solubilisatet på en kort 50%20%sackaros steggradient genom ultracentrifugeringen vid 400, 000 gånger G i en timme.Efter detta, skörda sackarosgradienten från botten av röret, tillsätt 0,05%Coomassie G-250 till solubilisate, och ladda provet på gelen. Kör en preparativ BN-SIDA vid 10 grader Celsius över natten med hjälp av ett trestegs spänningsprotokoll, som beskrivs i textprotokollet. Efter gelen har kört scanna gelerna i dokumentationssyfte och samtidigt hålla den mellan glasplattorna.Inspektera kvaliteten på gelseparationen. Därefter dissemble plattorna och punktskatt körfält avsnitt av intresse. Fixera banorna två gånger med 30%etanol och 15%ättiksyra i minst 30 minuter.Överför provet av inbäddningsmedium och låt det blötlägga och jämvikt i minst två timmar samtidigt som gelplattan förvaras i slow motion på en orbitalskak. Sedan skär den fasta gel körfält i sektioner exakt parallellt med protein migration front, eller band mönster. Placera varje sektion på ett plastfilmsstöd med lika mått för enklare hantering.Överför körfälten i ett öppet rör med proppar som är stängda på botten och centralt perforerade på ovansidan, både exakt i linje med gelsektionens övre och nedre ändarna. Doppa cylindern i det flytande kvävet kort för att snabbt initiera stelningen. Det genomskinliga inbäddningsmediet stelnar inom några sekunder och blir vitt i färg.Fyll kaviteten med inbäddningsmedium, doppa kort cylindern i flytande kväve och låt den sedan frysa ordentligt vid minus 20 grader Celsius i flera timmar. Efter demonteringen, ta bort plastfilmen och överför blocket med den inbäddade geldelen till en kyld metallcylinder. Cylindern är större i diameter och tätad på utsidan med inbäddningsmedium.Den är placerad på ett platt stöd. Fyll cylindern med inbäddningsmedium och frys ordentligt som tidigare nämnts. Upprepa denna procedur med cylinderns andra sida för att få ett fast block med en coplanar bottenyta.Ta sedan bort blocket från cylindern och använd inbäddningsmedium för att limma fast det på en förkyld metallhållare. Sätt in metallhållaren i kryoslikmaskinen. Innehavaren måste vara noggrant i linje med avseende på skivningsplanet.Låt blocket ekvilo till optimal temperatur för skivningsprocessen. Efter denna skörd skär gelen en efter en med en slutlig önskad tjocklek av 0,25 millimeters stegstorlek och överför dem individuellt till reaktionsrör med lågproteinbindande egenskaper. Sedan utsätts skivorna för tryptisk sammansmältning och masspektrometrisk analys.Detta protokoll utökar tillämpningen av hög upplösning complexome profilering till icke-mitokondriellt membran uttrycker låg-rikliga proteiner. Komplex separation visar starkt färgade proteinband med mycket lite migration artefakter. Avvikelser av peptidsignaler i massa och retentionstid indikerar en mycket låg hastighet för falskt positivt toppvolymtilldelning.Run-to-run-variationer elimineras enkelt genom omskalning av toppvolymdatauppsättningarna. Den resulterande peptidintensitetsinformationen används sedan för att rekonstruera 2545 proteinprofiler av relativ förekomst. Relevansen av gel provtagning stegstorlek för upplösning av proteinkomplex bedömdes genom att gå datauppsättningar av intilliggande skivor.Vid 0,25 millimeter, storlek separation av TPC1 associerade komplexa populationer är fint överens med resultaten från Western Blot analys. Att gå med i mer än två skivor avskaffar diskrimineringen av TPC1-komplexa delpopulationer. Slutligen ger analysen information om väl karakteriserade komplex och visar förekomsten av nya underenheter och komplexa församlingar.För ferritin tyder de subenhetsprofiler som justerats för deras relativa förekomst på att det finns minst tre komplexa isoformer med distinkta tung/lätta kedja stökiomer. Däremot nicalin-nomo1 komplex, gamma-sekretas kärna komplex, och GPI-transamidase maskineriet visar fasta överflöd nyckeltal av deras kärnunderenheter över hela storleksintervallet och oberoende från association med ytterligare proteiner. Nyckelparametern för CSBN-MS-analys är den effektiva upplösningen av komplex, som bestäms av provbiokemi, BN-gelkvalitet, korrekt anpassning under inbäddning och skivning samt kvaliteten på de förvärvade MS-data.Kamning csBN-MS med isotop märkning av proteiner och prover kommer att möjliggöra direkt jämförelse av complexomes vid olika patofysiologiska, biologiska, eller utvecklingsmässiga tillstånd. csBN-MS utförs på membran från gnagare hjärnan avslöjade den enorma mångfalden av receptorer, jonkanaler och transportörer med avseende på deras subenhet sammansättning och deras funktion, och det kommer att vara avgörande för att analysera 3D-strukturen i inhemska preparat.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Djupa proteomet profilering av isobariska märkning, omfattande vätskekromatografi, masspektrometri och programvara-assisted kvantifiering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sekvens erkännande av DNA-Primase med hög genomströmning Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Erhålla högkvalitativa transkriptom data från spannmål frön av en modifierad metod för genuttryck profilering

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Högupplöst neutronspektroskopi för att studera pikosekund-nanosekunddynamik hos proteiner och hydratiseringsvatten

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Bedömning av mitokondriell funktion i ischiasnerven med högupplöst respirometri

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...