Name: ion mobility-mass spectrometry techniques for determining the structure and mechanisms of metal ion recognition and redox activity of metal binding oligopeptides
Uploaded: 2019-09-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopepti

此材料基于国家科学基金会支持的工作，包括 1764436、NSF 仪器支持 （MRI-0821247）、韦尔奇基金会 （T-0014） 以及能源部的计算资源 （TX-W-20090427-0004-50） 和 L3 通信.我们感谢鲍尔的加州大学圣巴巴拉分校小组分享了西格玛计划，阿约巴米·伊莱桑米在视频中演示了这项技术。

1. 试剂制备
<ol><li>培养甲基肌酸三角性四氯环带，分离无Cu（I）的mb-OB3b 18，22，23，冷冻干燥样品，并储存在-80°C，直到使用。</li>
	<li>合成 amb 肽（>98% 纯度为 amb1，amb2，amb4;> 70% 纯度为 amb7），冷冻干燥样品，并将其储存在 -80°C 直到使用。</li>
	<li>购买 >98% 纯度氯化锰（II）氯化物、?...

关键步骤：通过 ESI-IM-MS 保存用于检查的解决方案阶段行为 必须使用本机 ESI 仪器设置来保存肽的化学测量、电荷状态和构象结构。对于原生条件，必须优化 ESI 源中的条件，如锥电压、温度和气体流量。此外，必须检查源、陷阱、电子移动性和传输移动波（尤其是控制注入电压进入 IM 单元的直流陷印偏置）中的压力和电压，以检查其对充电状态和电子移动分布的影响。
<p class="...

铜和锌离子对生物体至关重要，对包括氧化保护、组织生长、呼吸、胆固醇、葡萄糖代谢和基因组读数1在内的过程至关重要。为了启用这些功能，组，如Cys的硫酸盐，他的2，3，（更罕见）的硫丹，和Glu和Asp的甲苯选择性地将金属作为辅助因子到活动位点金属酶。这些协调小组的相似性提出了一个耐人寻味的问题，即他和Cys配体如何选择性地将Cu（I/II）或Zn（II）纳入，以确保正确的功能。
选择性结合通常通过获取和贩运肽来完成，这种肽控制锌（II）或Cu（I/II）的i/II）子浓度4。Cu（I/II）具有高度反应性，对酶造成氧化损伤或异化结合，因此其自由浓度受到铜伴和铜调节蛋白的严格调节，这些蛋白质安全地将其输送到细胞中的各个位置，并紧密地调节控制其平衡5，6。铜代谢或平衡的中断与门克斯和威尔逊的疾病7以及癌症7和神经紊乱直接相关，如普里昂8和阿尔茨海默氏病9。
Wilson 的疾病与眼睛、肝脏和大脑部分的铜含量增加有关，其中 Cu（I/II） 的氧化还原反应产生活性氧，导致肝神经退化。现有的包合疗法是小的三醇氨基酸阴西胺和三甲四胺。或者，甲抗凝铜采集肽甲酰沙棘素（mb）10，11表现出治疗潜力，因为它们对Cu（I）12具有高结合亲和力。当甲基三磷酸三甲杆菌OB3b的甲胺素（mb-OB3b）在威尔逊病的动物模型中被研究时，铜有效地从肝脏中取出，并通过胆汁13排泄。体外实验证实，mb-OB3b可以从肝细胞醇13中所含的铜金属醇素中洗去铜。激光消融电耦合等离子体质谱成像技术研究了威尔逊病肝样本14、15、16中铜的空间分布，并表明mb-OB3b去除铜与短处理期只有8天17。
mb-OB3b还将与其他金属离子结合，包括Ag（I）、Au（III）、Pb（II）、Mn（II）、Co（II）、Fe（II）、Ni（II）和Zn（II）18、19。Ag（I）展示的生理Cu（I）结合位点的竞争，因为它可以取代Cu（I）从mb-OB3b复合体，与Ag（I）和Ni（II）也表现出不可逆转的绑定Mb，不能取代Cu（I）19。最近，研究了一系列具有2His-2Cys结合图案的甲酰亚布辛（amb）寡肽，其锌（II）和Cu（I/II）结合特性具有特征。他们的主要氨基酸序列是相似的，他们都包含2His-2Cys主题，Pro和乙酰化N-总站。它们主要不同于mb-OB3b，因为2His-2Cys图案取代了mb-OB3b的两个enethiol牛酮结合位点。
电喷雾电位化与电力流动性质谱（ESI-IM-MS）相结合，为确定肽的金属结合特性提供了强大的工具技术，因为它测量其质量电荷（m/z）和碰撞横截面 （CCS），同时从溶液相中保存其质量、电荷和构象形状。m/z和 CCS 与肽体测定学、原形状态和构象形状有关。由于明确确定了物种中每个元素的身份和数量，因此确定骨化学计量。肽复合物的总体电荷与酸性和基本位点的原位和金属电的氧化状态有关。CCS提供了肽复合物的构象形状信息，因为它测量了与复体三级结构相关的旋转平均大小。复合物的整体电荷状态也是pH的函数，影响肽的金属电结合亲和力，因为脱质子的基本或酸性位点，如carboxyl、His、Cys和Tyr也是金属电的的潜在结合位点。在分析中，肽和金属离子在水溶液中制备，pH由稀水性醋酸或氢氧化铵调整。这允许为肽确定pH依赖性和金属电位选择性。此外，ESI-IM-MS测定的m/z和CCS可与B3LYP/LanL2DZ分子建模一起使用，以发现复合体金属电一致的类型和三级结构。本文中显示的结果揭示了ESI-IM-MS如何描述一组amb肽的选择性包合性能，并将其与铜结合肽mb-OB3b进行比较。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetonitrile HPLC-grade</td>
			<td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td>
			<td>A998SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide (trace metal grade)</td>
			<td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td>
			<td>A512-P500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>255599-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper(II) chloride 99.999%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>203149-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper(II) nitrate hydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>229636-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides</td>
			<td>Neo BioLab (neobiolab.com)</td>
			<td></td>
			<td>designed peptides were synthized by order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>designed amb5B,C,D,E,F peptides</td>
			<td>PepmicCo (www.pepmic.com)</td>
			<td></td>
			<td>designed peptides were synthized by order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Driftscope 2.1 software program</td>
			<td>Waters (www.waters.com)</td>
			<td></td>
			<td>software analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&#38;M-Commerce)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glacial acetic acid (Optima grade)</td>
			<td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td>
			<td>A465-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+</td>
			<td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td>
			<td>12357-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lead(II) nitrate ACS grade</td>
			<td>Avantor (www.avantormaterials.com)</td>
			<td>128545-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>203734-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx 4.1</td>
			<td>Waters (www.waters.com)</td>
			<td></td>
			<td>software analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nickel chloride hexahydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>203866-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-DL-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>P9003-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silver nitrate 99.9%+</td>
			<td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td>
			<td>11414-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Synapt G1 HDMS</td>
			<td>Waters (www.waters.com)</td>
			<td></td>
			<td>quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zinc chloride anhydrous</td>
			<td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td>
			<td>A16281</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ion mobility-mass spectrometry techniques for determining the structure and mechanisms of metal ion recognition and redox activity of metal binding oligopeptides

电喷雾电位化（ESI）可以将水相肽或肽复合物转移到气相，同时保存其质量、总电荷、金属结合相互作用和构象形状。ESI 与电子流动性质谱法 （IM-MS） 耦合提供了一种工具技术，允许同时测量肽的量位 （m/z） 和碰撞横截面 （CCS），和构象形状。肽复合物的总体电荷由肽的酸性和基本位点1）和2）金属电的氧化状态控制。因此，复合物的总体电荷状态是影响肽金属电结合亲和力的溶液的pH的函数。对于 ESI-IM-MS 分析，肽和金属离子溶液由仅水溶液制备，pHH 与稀水醋酸或氢氧化铵一起调整。这允许为特定的肽确定pH依赖性和金属电位选择性。此外，肽复合物的m/z和CCS可与B3LYP/LanL2DZ分子建模一起使用，以识别该复合物的金属电协调结合点位和三级结构。结果表明，ESI-IM-MS如何描述一组替代的美他可辛肽的选择性结合性能，并将其与铜结合肽美他可曲蛋白进行比较。

amb1的金属绑定 Amb1的 IM-MS 研究20（图 1A） 显示，铜离子和锌离子以 pH 依赖性的方式结合到 amb1（图 2）。然而，铜和锌通过不同协调部位的不同反应机制与amb1结合。例如，将Cu（II）添加到amb1中，通过二硫化物桥形成导致amb1（amb 1ox）氧化，在pH>6时?...

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Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Ion 流动性质谱和分子建模技术可以描述设计金属结合肽和铜结合肽美他可辛的选择性金属结合性能。开发新的金属包合肽类将有助于治疗与金属子失平衡相关的疾病。

用于测定金属结合寡聚肽的金属电子识别和机制的Ion流动性-质谱技术

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

离子流动性质谱仪（IM-MS）从肽的pH依赖氧化还原和甲基结合反应中识别出各种产品离子。通过三级结构的分子建模，可以确定金属相关性。IM-MS可以通过同时测量其质量充电和到达时间，并测量其与组学、质子状态和构象结构相关的同时测量其分子组成，并解析其分子组成。开发金属溷合肽类将有助于治疗与金属离子失衡相关的疾病，如门克斯和威尔逊氏病、癌症和阿尔茨海默病。首先，用约500微升0.1摩尔冰川醋酸、0.1摩尔氢氧化铵，最后去化水彻底清洁ESI入口管和针毛细管。使用文本协议中描述的本机 ESI-IM-MS 条件收集 10 ppm 聚 DL-丙氨酸溶液的负离子和正离子 IM-MS 光谱，每次 10 分钟。0.125毫摩尔替代甲醇替代甲烷蛋白或安布溶液的移液200.0微升进入1.7毫升小瓶中。用 500 微升的去维化水稀释，并彻底混合溶液。通过加入 50 微升 1.0 摩尔醋酸溶液，将样品的 pH 值调整为 3.0。将 0.125 毫摩尔金属离子的 200.0 微升添加到 pH 调整的样品中。然后，加入去维水，产生1.00毫升的样品的最终体积。彻底混合，让样品在室温下平衡10分钟。使用钝鼻注射器，取500微升样品，并收集阴离子和正离子ESI-IM-MS光谱，每次5分钟。使用样品的剩余 500 微升，使用校准的微 pH 电极记录其最终 pH 值。重复这些步骤，除了通过添加新的醋酸或氢氧化铵溶液来将pH调整为pH4、5、6、7、8、9或10。收集结果溶液的负离子和正离子 ESI-IM-MS 光谱，每次 10 分钟。从 IM-MS 光谱中，通过将它们与理论质量对电荷同位素模式进行匹配，确定存在替代甲醇素的电荷物种。为此，请打开 MassLynx 并单击色谱图以打开色度图窗口。转到"文件"菜单并打开以查找并打开 IM-MS 数据文件。通过右键单击、拖动色谱图和释放来提取 IM-MS 频谱。频谱窗口将打开，显示 IM-MS 频谱。在频谱窗口中，单击"工具和同位素模型"。在同位素建模窗口中，输入安布物种的分子公式，选中"显示带电离子盒"，然后进入充电状态。单击"确定"。重复此过程以识别 IM-MS 光谱中的所有物种，并记录其质量充电同位素范围。对于每个安布物种，分离任何重合质量电荷物种，并提取其到达时间分布，或 ATD，使用其质量电荷同位素模式来识别它们。打开漂移范围并单击"文件"并打开以查找并打开 IM-MS 数据文件。使用鼠标和左键单击放大 amb 物种的量电同位素模式。使用选择工具和鼠标左键选择同位素图案。单击"接受当前选择"按钮。要分离任何重合质量充电物种，请使用选择工具和鼠标左键选择与 amb 物种同位素模式对齐的 ATD 时间。单击"接受当前选择"按钮。要导出 ATD，请转到"文件"，导出到 MassLynx。然后选择"保留漂移时间"，将文件保存到相应的文件夹中。在 MassLynx 的色度图窗口中，打开保存的导出文件。单击"进程"，从菜单中集成，选中"顶点跟踪峰值集成"框，然后单击"确定"。记录 ATD 的质心和集成区域。对所有保存的安布和聚DL-丙氨酸 IM-MS 数据文件重复此过程后，对每个滴定点的所有提取的正离子或负离子的 amb 物种使用集成 ATD 来规范化为相对百分比比例。为此，请在每个 pH 输入安布物种及其集成的 ATD 的标识，并输入电子表格。对于每个 pH 值，使用集成 ATD 的总和将单个 amb 物种的 ATD 规范化为百分比比例。绘制每个安布物种与 pH 的百分比强度，以显示每个物种的种群随 pH 值的函数而变化。使用电子表格，将氦缓冲气体中测得的多DL-丙氨酸负离子和正离子的碰撞横截面转换为校正碰撞截面。然后，将聚DL-丙氨酸卡布里特和安布物种的平均到达时间转换为漂移时间。将聚DL-丙氨酸卡布里特的漂移时间与其校正的碰撞横截面相连接。然后，使用最低平方回归拟合，确定 A 素数和 B 值，其中 A 素数是温度、压力和电场参数的校正，B 补偿 IM 设备的非线性效果。使用这些 A 等正数值和 B 值以及质心漂移时间值，确定其校正碰撞横截面及其碰撞横截面。该方法为肽物种提供碰撞横截面，估计绝对误差约为2%，使用高斯与高斯视图，以及B3LYP LanL2DZ理论水平，为观测到的质量充电机种的所有可能协调类型定位几何优化的符合物。B3LYP LanL2DZ 理论水平由贝克三个周长混合函数、邓宁基础集和电子核心电位组成。从高斯输出文件中提取每个优化的构种的热化学分析，并使用西格玛程序的离子缩放伦纳德-琼斯方法计算其理论碰撞横截面。从最低的自由能量符合者中，确定哪些符合者表现出与 IM-MS 测量碰撞横截面一致的伦纳德-琼斯碰撞横截面。此过程确定了实验中观察到的符合者的第三级结构和协调类型。分子建模需要比较不同金属溷合点、cis和跨肽键、盐桥、氢键和 pi-cation 相互作用的符合物的自由能量和碰撞横截面。对替代甲烷素的 IM-MS 研究表明，它以pH依赖的方式将铜离子和锌离子同时进行，但通过不同的反应机制和协调站点。锌（II）结合在大于6的pH值下观察到，主要形成一个负电复合物，表明锌（II）由两个硫化和两个硫酸盐四节协调。铜（II）结合伴随着硫化物形成二硫化桥。在大于6的pH值时，形成了单负充电铜（II）复合物，表明二氮和两个过气的中含氮协调铜（II），但是，在pH6以下，添加铜（II）也形成了单正带铜（I）复合体，以及pH6以上的单正带铜（II）复合体。对安布二和安布四的 IM-MS 研究还表明，铜反应在分子间或分子内二硫化物桥的数量、铜（I）或铜（II）离子的数量以及作为 pH 函数而变化的引爆位点数量上，都有不同的结果。具有分子建模的 IM-MS 结果表明，替代甲醇蛋白可以通过硫酸盐、硫化物和碳酸盐组协调多达三个铜（I）离子。必须仔细选择 IM-MS 仪器设置，以保存肽的三位一体测量、电荷分布和构象结构，如本文所述。将影响金属协调（如阿斯巴酸的酪氨酸）的更广尺寸组合在一起，可以更好地了解结构和功能之间的关系。具有分子建模的 IM-MS 已成为加速晶体学和 NMR 光谱的替代技术，用于确定蛋白质、DNA、脂质及其复合物的构象结构。

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