Name: ion mobility-mass spectrometry techniques for determining the structure and mechanisms of metal ion recognition and redox activity of metal binding oligopeptides
Uploaded: 2019-09-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopepti

Dieses Material basiert auf Arbeiten, die von der National Science Foundation unter 1764436, NSF-Instrumentenunterstützung (MRT-0821247), Welch Foundation (T-0014) und Rechenressourcen des Department of Energy (TX-W-20090427-0004-50) und L3 Communications unterstützt werden. . Wir danken der Bower-Gruppe der University of California - Santa Barbara für die gemeinsame Nutzung des Sigma-Programms und Ayobami Ilesanmi für die Demonstration der Technik im Video.

1. Herstellung von Reagenzien
<ol><li>Kultur Methylosinus trichosporium OB3b, isolieren Sie die Cu(I)-freie mb-OB3b18,22,23, gefrieren-trocknen Sie die Probe und lagern Sie bei -80 °C bis zum Gebrauch.</li>
	<li>Synthetisieren Sie die Amb-Peptide (>98% Reinheit für amb1, amb2, amb4; >70% Reinheit für amb7), gefrieren-trocknen Sie die Proben, und lagern Sie sie bei -80 °C...

Kritische Schritte: Erhaltung von Lösungsphasenverhalten zur Untersuchung über ESI-IM-MS Native ESI-Instrumenteinstellungen müssen verwendet werden, um die Peptide Stoichiometrie, Ladezustand und Konformationsstruktur zu erhalten. Für native Bedingungen müssen die Bedingungen in der ESI-Quelle wie Kegelspannungen, Temperaturen und Gasströme optimiert werden. Außerdem müssen die Drücke und Spannungen in der Quelle, Falle, Ionenmobilität und Übertragungs-Reisewellen (insbesondere die DC-Falle...

Kupfer- und Zinkionen sind für lebende Organismen unerlässlich und entscheidend für Prozesse wie oxidativen Schutz, Gewebewachstum, Atmung, Cholesterin, Glukosestoffwechsel und Genom-Lesung1. Um diese Funktionen zu ermöglichen, integrieren Gruppen wie das Thiolat von Cys, Imidazol seiner2,3, (seltener) Thioether von Methionin und Carboxylat von Glu und Asp selektiv Metalle als Kofaktoren in die aktiven Metalloenzyme. Die Ähnlichkeit dieser Koordinierungsgruppen wirft eine faszinierende Frage auf, wie die Seine und Cys-Liganden selektiv entweder Cu(I/II) oder Zn(II) integrieren, um ein korrektes Funktionieren zu gewährleisten.
Selektive Bindung erfolgt häufig durch Erwerb und Handel Peptide, die Zn(II) oder Cu(I/II) Ionenkonzentrationen steuern4. Cu(I/II) ist sehr reaktiv und verursacht oxidative Schäden oder zufällige Bindung an Enzyme, so dass seine freie Konzentration durch Kupferchaperones und kupferregulierende Proteine streng reguliert wird, die es sicher an verschiedene Stellen in der Zelle und fest transportieren. seine Homöostasekontrollieren 5,6. Störungen des Kupferstoffwechsels oder der Homöostase sind direkt in Menkes und Wilsons Krankheit7 sowieKrebserkrankungen 7 und neuronale Erkrankungen wie Prion8 undAlzheimer-Krankheit 9involviert.
Wilson-Krankheit ist verbunden mit erhöhten Kupferspiegeln in den Augen, Leber und Abschnitten des Gehirns, wo die Redox-Reaktionen von Cu(I/II) reaktive Sauerstoffspezies produzieren, was hepatolenticularundäre und neurologische Degeneration verursacht. Bestehende Chelationstherapien sind die kleine Thiol-Aminosäure Penicillamin und Triethylenetetramine. Alternativ weisen die methanotrophen Kupfer-Akquise-Peptide Methanobactin (mb)10,11 aufgrund ihrer hohen Bindungsaffinität zu Cu(I)12therapeutisches Potenzial auf. Als das Methanobactin (mb-OB3b) von Methylosinus trichosporium OB3b in einem Tiermodell der Wilson-Krankheit untersucht wurde, wurde Kupfer effizient aus der Leber entfernt und über die Galleausgeschieden 13. In-vitro-Experimente bestätigten, dass mb-OB3b das Kupfer aus dem kupfernen Metallothionein, das im Leberzytosolenthalten ist, chelatierenkonnte 13 . Laserablation induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie-Bildgebungstechniken haben die räumliche Verteilung von Kupfer in Wilsons Krankheitsleberproben14,15,16 untersucht und gezeigt, dass mb-OB3b entfernt das Kupfer mit kurzen Behandlungsperioden von nur 8 Tagen17.
Die mb-OB3b bindet auch mit anderen Metallionen, einschließlich Ag(I), Au(III), Pb(II), Mn(II), Co(II), Fe(II), Ni(II) und Zn(II)18,19. Der Wettbewerb um die physiologische Cu(I)-Bindungsstelle wird von Ag(I) ausgestellt, weil er Cu(I) aus dem mb-OB3b-Komplex verdrängen kann, wobei sowohl Ag(I) als auch Ni(II) eine irreversible Bindung an Mb aufweisen, die nicht durch Cu(I)19verdrängt werden kann. Kürzlich wurden eine Reihe alternativer Methanobactin (amb) Oligopeptide mit dem Bindungsmotiv 2His-2Cys20,21, und ihre Zn(II) und Cu(I/II) Bindungseigenschaften charakterisiert. Ihre primären Aminosäuresequenzen sind ähnlich, und sie alle enthalten das 2His-2Cys Motiv, Pro und einen acetylierten N-Terminus. Sie unterscheiden sich hauptsächlich von mb-OB3b, da das 2His-2Cys-Motiv die beiden Enethiol-Oxazolon-Bindungsstellen von mb-OB3b ersetzt.
Die Elektrospray-Ionisierung in Verbindung mit der Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie (ESI-IM-MS) sorgt für eine leistungsstarke Instrumentaltechnik zur Bestimmung der Metallbindungseigenschaften von Peptiden, da sie deren Massen-Zu-Ladung (m/z) und Kollisionmisst Querschnitt (CCS) unter Beibehaltung ihrer Masse, Ladung und Konformationsform aus der Lösungsphase. Die m/z und CCS beziehen sich auf die Peptide Stoichiometrie, Protonationszustand und Konformationsform. Die Stoichiometrie wird bestimmt, da die Identität und Anzahl jedes elements, das in der Art vorhanden ist, explizit identifiziert wird. Die Gesamtladung des Peptidkomplexes bezieht sich auf den Protonationszustand der sauren und grundlegenden Stellen und den Oxidationszustand der Metallionen. Das CCS gibt Auskunft über die konforme Form des Peptidkomplexes, da es die rotationsgemittelte Größe misst, die sich auf die tertiäre Struktur des Komplexes bezieht. Der Gesamtladungszustand des Komplexes ist auch eine Funktion des pH-Werts und wirkt sich auf die Metallionenbindungsaffinität des Peptids aus, da die deprotonierten Basis- oder Saurierstellen wie Carboxyl, His, Cys und Tyr auch die potenziellen Bindungsstellen für das Metallion sind. Für die Analysen werden Peptid und Metallion in wässrigen Lösungen mit dem pH-Wert durch verdünnte wässrige Essigsäure oder Ammoniumhydroxid eingestellt. Dadurch können die pH-Abhängigkeit und die Metallionenselektivität für das Peptid bestimmt werden. Darüber hinaus können die von ESI-IM-MS ermittelten m/z und CCS mit B3LYP/LanL2DZ molekularer Modellierung verwendet werden, um die Art der Metallionenkoordination und die tertiäre Struktur des Komplexes zu ermitteln. Die in diesem Artikel gezeigten Ergebnisse zeigen, wie ESI-IM-MS die selektive Chelaterfüllung eines Satzes von Amb-Peptiden charakterisieren und mit dem Kupferbindenden Peptid mb-OB3b vergleichen kann.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetonitrile HPLC-grade</td>
			<td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td>
			<td>A998SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide (trace metal grade)</td>
			<td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td>
			<td>A512-P500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>255599-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper(II) chloride 99.999%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>203149-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper(II) nitrate hydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>229636-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides</td>
			<td>Neo BioLab (neobiolab.com)</td>
			<td></td>
			<td>designed peptides were synthized by order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>designed amb5B,C,D,E,F peptides</td>
			<td>PepmicCo (www.pepmic.com)</td>
			<td></td>
			<td>designed peptides were synthized by order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Driftscope 2.1 software program</td>
			<td>Waters (www.waters.com)</td>
			<td></td>
			<td>software analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&#38;M-Commerce)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glacial acetic acid (Optima grade)</td>
			<td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td>
			<td>A465-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+</td>
			<td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td>
			<td>12357-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lead(II) nitrate ACS grade</td>
			<td>Avantor (www.avantormaterials.com)</td>
			<td>128545-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>203734-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx 4.1</td>
			<td>Waters (www.waters.com)</td>
			<td></td>
			<td>software analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nickel chloride hexahydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>203866-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-DL-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>P9003-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silver nitrate 99.9%+</td>
			<td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td>
			<td>11414-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Synapt G1 HDMS</td>
			<td>Waters (www.waters.com)</td>
			<td></td>
			<td>quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zinc chloride anhydrous</td>
			<td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td>
			<td>A16281</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ion mobility-mass spectrometry techniques for determining the structure and mechanisms of metal ion recognition and redox activity of metal binding oligopeptides

Die Elektrospray-Ionisation (ESI) kann einen wässrigen Peptid- oder Peptidkomplex in die Gasphase übertragen und gleichzeitig seine Masse, Gesamtladung, Metallbindungswechselwirkungen und Konformationsform erhalten. Die Kopplung von ESI mit der Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IM-MS) bietet eine instrumentelle Technik, die die gleichzeitige Messung des Masse-zu-Lade- (m/z) und des Kollisionsquerschnitts (CCS) eines Peptids ermöglicht, die sich auf seine Stoiximetrie, Protonationszustand, und konforme Form. Die Gesamtladung eines Peptidkomplexes wird durch die Protonierung von 1) den sauren und grundlegenden Stellen des Peptids und 2) dem Oxidationszustand des Metallions(en) gesteuert. Daher ist der Gesamtladungszustand eines Komplexes eine Funktion des pH-Werts der Lösung, die die Peptide MetallionenbindungAffinität beeinflusst. Für ESI-IM-MS-Analysen werden Peptid- und Metallionenlösungen aus wässrigen Lösungen hergestellt, wobei der pH-Wert mit verdünnter wässriger Essigsäure oder Ammoniumhydroxid eingestellt wird. Dadurch können pH-Abhängigkeit und Metallionenselektivität für ein bestimmtes Peptid bestimmt werden. Darüber hinaus können die m/z und CCS eines Peptidkomplexes mit B3LYP/LanL2DZ molekularer Modellierung verwendet werden, um Bindungsstellen der Metallionenkoordination und tertiären Struktur des Komplexes zu erkennen. Die Ergebnisse zeigen, wie ESI-IM-MS die selektive Chelaterfüllung einer Reihe alternativer Methanobactin-Peptide charakterisieren und mit dem kupferbindenden Peptid-Methanobactin vergleichen kann.

Metallbindung von amb1 Die IM-MS-Studie20 von amb1 (Abbildung 1A) zeigte, dass sowohl Kupfer- als auch Zinkionen, die auf pH-abhängige Weise an amb1 gebunden sind (Abbildung 2). Kupfer und Zink sind jedoch durch unterschiedliche Reaktionsmechanismen an verschiedenen Koordinationsstellen an amb1 gebunden. Das Hinzufügen von Cu(II) zu amb1 führte ...

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Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie und molekulare Modellierungstechniken können die selektive Metallchelating-Performance von entworfenen metallbindenden Peptiden und dem kupferbindenden Peptid-Methanobactin charakterisieren. Die Entwicklung neuer Klassen von Metallchelat-Peptiden wird dazu beitragen, Therapeutika für Krankheiten im Zusammenhang mit Metallionen-Misbalance.

Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie-Techniken zur Bestimmung der Struktur und Mechanismen der Metallionenerkennung und Redox-Aktivität von Metallbindungsoligopeptiden

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie, oder IM-MS, identifizieren die verschiedenen Produkte Ionen aus der pH-abhängigen Redox- und Methylbindungsreaktion von Peptiden. Mit der molekularen Modellierung ihrer tertiären Struktur kann die Metallkorrelation bestimmt werden. IM-MS kann jede der Produktionen auflösen und ihre molekulare Zusammensetzung identifizieren, indem sie gleichzeitig ihre Massen-Zu-Ladungund-Ankunftszeiten messen und sich auf ihre Stoiichiometrie, protonationszustandund Konformationsstruktur beziehen.Die Entwicklung von Klassen von Metallchelat-Peptiden wird dazu beitragen, Therapeutika für Krankheiten im Zusammenhang mit Metallionen-Misbalance, wie Menkes und Wilson-Krankheit, Krebs, und Alzheimer-Krankheit. Reinigen Sie zunächst die ESI-Eingangsschläuche und Nadelkapillare gründlich mit ca. 500 Mikrolitern 0,1 Molar-Gletscheressigsäure, 0,1 Molaren-Ammoniumhydroxid und schließlich entionisiertem Wasser. Verwenden Sie native ESI-IM-MS-Bedingungen, wie im Textprotokoll beschrieben, um die negativen und positiven Ionen-IM-MS-Spektren der 10 ppm Poly-DL-Alanin-Lösung für jeweils 10 Minuten zu sammeln.Pipette 200,0 Mikroliter der 0,125 Millimolaren alternative Methanobactin, oder Amb-Lösung, in eine 1,7 Milliliter Durchstechflasche. Mit 500 Mikroliter entionisiertem Wasser verdünnen und die Lösung gründlich vermischen. Stellen Sie den pH-Wert der Probe auf 3,0 ein, indem Sie 50 Mikroliter 1,0 Molessigsäurelösung hinzufügen.Fügen Sie der pH-angepassten Probe 200,0 Mikroliter des 0,125 Millimolaren Metallionen hinzu. Fügen Sie dann entionisiertes Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 1,00 Milliliter der Probe zu ergeben. Mischen Sie gründlich, und lassen Sie die Probe für 10 Minuten bei Raumtemperatur ausdemieren.Mit einer stumpfen Nasenspritze nehmen Sie 500 Mikroliter der Probe und sammeln die negativen und positiven Ionen-ESI-IM-MS-Spektren für jeweils fünf Minuten. Verwenden Sie die restlichen 500 Mikroliter der Probe, um ihren endgültigen pH-Wert mit einer kalibrierten Mikro-pH-Elektrode aufzuzeichnen. Wiederholen Sie diese Schritte, außer um den pH-Wert auf pH vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun oder zehn anzupassen, indem Sie neue Mengen an Essigsäure- oder Ammoniumhydroxidlösungen hinzufügen.Sammeln Sie die negativen und positiven Ionen-ESI-IM-MS-Spektren der resultierenden Lösungen jeweils 10 Minuten lang. Anhand der IM-MS-Spektren können Sie ermitteln, welche geladenen Arten des alternativen Methanobactin vorhanden sind, indem Sie sie mit ihren theoretischen Massen-zu-Ladungs-Isotopenmustern abgleichen. Um dies zu tun, öffnen Sie MassLynx und klicken Sie auf Chromatogramm, um das Chromatogramm-Fenster zu öffnen.Gehen Sie zum Menü Datei und Öffnen, um die IM-MS-Datendatei zu suchen und zu öffnen. Extrahieren Sie das IM-MS-Spektrum, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken, das Chromatogramm ziehen und loslassen. Das Spektrumfenster wird geöffnet und zeigt das IM-MS-Spektrum an.Klicken Sie im Spektrumfenster auf Werkzeuge und Isotope-Modell. Geben Sie im Fenster Isotope-Modellierung die Molekularformel der amb-Art ein, aktivieren Sie das Feld Geladenes Ionen anzeigen, und geben Sie den Ladezustand ein. Klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um alle Arten im IM-MS-Spektrum zu identifizieren, und zeichnen Sie deren Massen-zu-Lade-Isotopenbereich auf.Trennen Sie für jede Amb-Art alle zufälligen Massen-zu-Ladungs-Arten und extrahieren Sie ihre Ankunftszeitverteilungen oder ATDs, indem Sie ihre Massen-zu-Lade-Isotopenmuster verwenden, um sie zu identifizieren. Öffnen Sie DriftScope und klicken Sie auf Datei und Öffnen, um die IM-MS-Datendatei zu suchen und zu öffnen. Mit der Maus und dem Linksklick zoomen Sie das Massen-zu-Lade-Isotopenmuster der amb-Arten.Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug und die linke Maustaste, um das Isotopenmuster auszuwählen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Aktuelle Auswahl akzeptieren. Um zufällige Massen-zu-Ladungsarten zu trennen, verwenden Sie das Auswahlwerkzeug und die linke Maustaste, um die ATD-Zeit auszuwählen, die an dem Isotopenmuster der amb-Art ausgerichtet ist.Klicken Sie auf die Schaltfläche Aktuelle Auswahl akzeptieren. Um die ATD zu exportieren, gehen Sie zu Datei, Exportieren nach MassLynx. Wählen Sie dann Drift Time beibehalten aus, und speichern Sie die Datei im entsprechenden Ordner.Öffnen Sie im Chromatogramm-Fenster von MassLynx die gespeicherte exportierte Datei. Klicken Sie auf Prozess, Integrieren aus dem Menü, aktivieren Sie das Kontrollkästchen ApexTrack Peak Integration, und klicken Sie auf OK. Zeichnen Sie den Schwerpunkt und den integrierten Bereich des ATD auf. Nachdem Sie diesen Prozess für alle gespeicherten AMb- und Poly-DL-Alanin-IM-MS-Datendateien wiederholt haben, verwenden Sie die integrierte ATD für alle extrahierten Amb-Arten der positiven oder negativen Ionen an jedem Titrationspunkt, um sich auf eine relative prozentuale Skala zu normalisieren.Geben Sie dazu die Identitäten der amb-Arten und deren integrierte ATD bei jedem pH-Wert in eine Kalkulationstabelle ein. Verwenden Sie für jeden pH-Wert die Summe der integrierten ATDs, um die atD der einzelnen Amb-Arten auf eine prozentuale Skala zu normalisieren. Plotten Sie die prozentualen Intensitäten jeder Amb-Art im Vergleich zum pH-Wert, um zu zeigen, wie die Population jeder Art je nach pH-Wert variiert.Konvertieren Sie mithilfe einer Kalkulationstabelle die Kollisionsquerschnitte von Poly-DL-Alanin-negativen und positiven Ionen, die in Heliumpuffergas gemessen werden, in die korrigierten Kollisionsquerschnitte um. Konvertieren Sie dann die durchschnittlichen Ankunftszeiten der Poly-DL-Alanin-Kalibrame und amb-Arten in Driftzeiten. Stecken Sie die Driftzeiten der Poly-DL-Alanin-Kalibratoren im Vergleich zu ihren korrigierten Kollisionsquerschnitten.Bestimmen Sie dann mit einer Regressionsanpassung mit den kleinsten Quadraten die A-Primierung s. und B-Werte, wobei A prime die Korrektur der Temperatur-, Druck- und elektrischen Feldparameter ist und B den nichtlinearen Effekt des IM-Geräts kompensiert. Anhand dieser A-Prim- und B-Werte mit dem Wert für die Zentroiddriftzeiten bestimmen Sie deren korrigierte Kollisionsquerschnitte und ihre Kollisionsquerschnitte. Diese Methode bietet Kollisionsquerschnitte für die Peptidarten mit geschätzten absoluten Fehlern von etwa 2%Mit Gaußian mit GaußView und der B3LYP LanL2DZ Theorieebene, lokalisieren Geometrie-optimierte Konformer für alle möglichen Arten von Koordinationen der beobachteten Masse-zu-Ladung-Amb-Arten.Die Theorieebene B3LYP LanL2DZ besteht aus den drei Perimeter-Hybrid-Funktionen Becke, dem Dunning-Basissatz und elektronenkernigen Potentialen. Extrahieren Sie die thermochemischen Analysen der einzelnen optimierten Konformer aus der Gaußschen Ausgabedatei und berechnen Sie deren theoretische Kollisionsquerschnitte mit der ionenskalierten Lennard-Jones-Methode aus dem Sigma-Programm. Bestimmen Sie anhand der niedrigsten freien Energiekonformer, welcher Conformer den Lennard-Jones Kollisionsquerschnitt aufweist, der mit dem im-MS gemessenen Kollisionsquerschnitt übereinstimmt.Bei diesem Prozess werden die tertiäre Struktur und die Art der Koordination für die im Experiment beobachteten Konformatoren identifiziert. Die molekulare Modellierung erfordert den Vergleich der freien Energie- und Kollisionsquerschnitte von Konformatoren mit verschiedenen Metallchelatisierungsstellen, cis- und Transpeptidbindungen, Salzbrücken, Wasserstoffbindung und Pi-Kation-Wechselwirkungen. Die IM-MS-Studie des alternativen Methanobactinzeigte, dass es sowohl Kupfer- als auch Zinkionen in pH-abhängiger Weise chelatierte, jedoch durch unterschiedliche Reaktionsmechanismen und Koordinationsstellen.Zink(II)-Bindung wurde bei einem pH-Wert von mehr als sechs beobachtet, was in erster Linie einen einzigen negativ geladenen Komplex bildete, was darauf hindeutet, dass Zink(II) durch die beiden Imidazole und zwei Thiolate tetrahedrisch koordiniert wurde. Kupfer(II)Bindung wurde von den Thiolen begleitet, die eine Disulfidbrücke bildeten. Bei einem pH-Wert von mehr als sechs wurde der einzelne negativ geladene Kupfer(II)-Komplex gebildet, was darauf hindeutet, dass Imidazol und zwei deprotonierte Amidstickstoffe Kupfer(II) koordinierten.IM-MS-Studien an amb two und amb four zeigen auch, dass die Kupferreaktionen Produkte lieferten, die sich in der Anzahl der inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken, der Anzahl der Kupfer(I)- oder Kupfer(II)ionen und der Anzahl der Deprotonationsstellen unterschieden, die sich in Abhängigkeit vom pH-Wert änderten. Das IM-MS-Ergebnis mit molekularer Modellierung zeigte, dass die alternativen Methanobactine bis zu drei Kupfer(I)ionen über die Thiolate-, Imidazole- und Carboxylatgruppen koordinieren konnten. Die IM-MS-Instrumentatoren müssen sorgfältig ausgewählt werden, um die im Text beschriebene Stoichiometrie, Ladungsverteilungen und Konformationsstrukturen der Peptide zu erhalten.Die Kombination eines größeren Größenspektrums, das die Metallkoordination beeinflussen wird, wie z. B. das Tyrosin bei Assigsäure, ermöglicht ein besseres Verständnis der Beziehung zwischen Struktur und Funktion. IM-MS mit molekularer Modellierung sind zu alternativen Techniken zur Beschleunigung der Kristallographie und NMR-Spektroskopie zur Bestimmung der Konformationsstrukturen von Proteinen, DNA, Lipiden und deren Komplexen geworden.

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