Name: ion mobility-mass spectrometry techniques for determining the structure and mechanisms of metal ion recognition and redox activity of metal binding oligopeptides
Uploaded: 2019-09-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopepti

この資料は、1764436、NSF機器サポート(MRI-0821247)、ウェルチ財団(T-0014)、エネルギー省(TX-W-20090427-0004-50)およびL3コミュニケーションズの下で国立科学財団が支援する作業に基づいています。.私たちは、シグマプログラムを共有するためのカリフォルニア大学サンタバーバラのバウアーのグループに感謝し、ビデオで技術を実証するためのアヨバミ・イレサンミ。

1. 試薬の調製
<ol><li>培養メチロシヌストリコスポリウムOB3bは、Cu(I)フリーmb-OB3b 18、22、23を分離し、使用するまで-80°Cで試料を凍結乾燥し、保存する。</li>
	<li>アンブペプチド(アンブ1、アンブ2、アンブ4、>70%純度)を合成し、サンプルを凍結乾燥させ、使用するまで-80°Cで保存しま?...

重要なステップ:ESI-IM-MSを介した検査のためのソリューションフェーズの動作の保存 ネイティブESIインストゥルメンタル設定は、ペプチオメトリー、電荷状態、および立体構造を保存するために使用する必要があります。ネイティブ条件の場合、コーン電圧、温度、ガスフローなどのESIソースの条件を最適化する必要があります。また、ソース、トラップ、イオンモビリティ、...

銅イオンと亜鉛イオンは、生物に不可欠であり、酸化保護、組織成長、呼吸、コレステロール、グルコース代謝、ゲノム読み取り1を含むプロセスに不可欠です。これらの機能を有効にするために、シスのチオレート、彼の2、3のイミダゾール、(よりまれに)メチオニンのチオエーテル、およびGluとAspのカルボキシレートは、選択的に金属を活性化部位に組み込む。メタロエンザイム。これらのコーディネーショングループの類似性は、HisおよびCysリガンドが正しい機能を確保するためにCu(I/II)またはZn(II)のいずれかを選択的に組み込む方法に関する興味深い疑問を提起する。
選択的結合は、多くの場合、Zn(II)またはCu(I/II)イオン濃度4を制御するペプチドの獲得および密売によって達成される。Cu(I/II)は反応性が高く、酵素に酸化的損傷や急激な結合を引き起こすため、その自由濃度は、細胞内の様々な場所に安全に輸送する銅シャペロンおよび銅調節タンパク質によって厳しく調節される。その恒常主義を制御する 5,6.銅代謝または恒常性の破壊は、メンケスおよびウィルソン病7ならびに癌7およびプリオン8およびアルツハイマー病9などの神経疾患に直接関与する。
ウィルソン病は、目、肝臓、脳のセクションの銅レベルの増加に関連しており、Cu(I/II)の酸化還元反応が活性酸素種を産生し、肝無胞および神経変性を引き起こす。既存のキレート療法は、小さなチオールアミノ酸ペニシラミンおよびトリエチレネテトラミンである。あるいは、メタノトロフィー系銅獲得ペプチドメタノバクチン(mb)10、11はCu(I)12に対する高い結合親和性のために治療可能性を示す。メチロシヌス・トリコスポリウムOB3bのメタノバクチン(mb-OB3b)がウィルソン病の動物モデルで研究された場合、銅は肝臓から効率的に除去され、胆汁13を通して排泄された。インビトロ実験では、mb-OB3bが肝臓サイトゾル13に含まれる銅メタロチオネインから銅をキレートできることを確認した。レーザーアブレーション誘導結合血漿質量分析イメージング技術は、ウィルソン病肝サンプル14、15、16における銅の空間分布を調査し、mb-OB3bであることを示した。わずか8日17の短い処理期間で銅を除去します。
mb-OB3bはまた、Ag(I)、Au(III)、Pb(II)、Mn(II)、Co(II)、Fe(II)、Ni(II)、およびZn(II)18、19を含む他の金属イオンと結合する。生理的Cu(I)結合部位に対する競争は、mb-OB3b複合体からCu(I)を置き換えることができるためAg(I)によって示され、Ag(I)およびNi(II)の両方もCu(I)19によって置き換えることができないMbへの不可逆的な結合を示す。近年、2His-2Cys結合モチーフを有する一連の代替メタノバクチン(amb)オリゴペプチドが20、21、及びそのZn(II)およびCu(I/II)結合特性を特徴とする。彼らの一次アミノ酸配列は類似しており、それらはすべて2His-2Cysモチーフ、Proおよびアセチル化N終産を含有する。2His-2Cysモチーフはmb-OB3bの2つのエネチオールオキサゾロン結合部位を置き換えるため、主にmb-OB3bとは異なります。
イオンモビリティ質量分析(ESI-IM-MS)と組み合わせたエレクトロスプレーイオン化は、質量電荷(m/z)と衝突を測定するため、ペプチドの金属結合特性を決定するための強力な計測器技術を提供します。断面(CCS)を使用しながら、溶液相から質量、電荷、立体形状を保存します。m/zおよびCCSは、ペプチオメトリー、プロトネーション状態、および立体構造形状に関連する。種に存在する各要素の同一性および数が明示的に同定されるため、ストイチオメトリーが決定される。ペプチド複合体の全体的な電荷は、酸性および塩基部位の原発状態および金属イオンの酸化状態に関する。CCSは、複合体の三次構造に関連する回転平均サイズを測定するので、ペプチド複合体の立体形状の情報を提供する。複合体の全体的な電荷状態はまた、pHの機能であり、カルボキシル、His、CysおよびTyrなどのデプロトン化された基本部位または酸性部位が金属イオンの潜在的な結合部位でもあるため、ペプチドの金属イオン結合親和性に影響を与える。分析のために、ペプチドおよび金属イオンは希希水性酢酸または水酸化アンモニウムによって調整されたpHと水溶液で調製される。これにより、pH依存性および金属イオン選択性がペプチドに対して決定され始める。さらに、ESI-IM-MSによって決定されたm/zおよびCCSをB3LYP/LanL2DZ分子モデリングと共に使用して、複合体の金属イオン協調および三次構造の種類を発見することができる。この記事に示す結果は、ESI-IM-MSが一連のアンブペプチドの選択的キレート性能を特徴付け、銅結合ペプチドmb-OB3bと比較する方法を明らかにする。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetonitrile HPLC-grade</td>
			<td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td>
			<td>A998SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide (trace metal grade)</td>
			<td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td>
			<td>A512-P500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>255599-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper(II) chloride 99.999%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>203149-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper(II) nitrate hydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>229636-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides</td>
			<td>Neo BioLab (neobiolab.com)</td>
			<td></td>
			<td>designed peptides were synthized by order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>designed amb5B,C,D,E,F peptides</td>
			<td>PepmicCo (www.pepmic.com)</td>
			<td></td>
			<td>designed peptides were synthized by order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Driftscope 2.1 software program</td>
			<td>Waters (www.waters.com)</td>
			<td></td>
			<td>software analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&#38;M-Commerce)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glacial acetic acid (Optima grade)</td>
			<td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td>
			<td>A465-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+</td>
			<td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td>
			<td>12357-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lead(II) nitrate ACS grade</td>
			<td>Avantor (www.avantormaterials.com)</td>
			<td>128545-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>203734-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx 4.1</td>
			<td>Waters (www.waters.com)</td>
			<td></td>
			<td>software analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nickel chloride hexahydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>203866-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-DL-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>P9003-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silver nitrate 99.9%+</td>
			<td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td>
			<td>11414-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Synapt G1 HDMS</td>
			<td>Waters (www.waters.com)</td>
			<td></td>
			<td>quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zinc chloride anhydrous</td>
			<td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td>
			<td>A16281</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ion mobility-mass spectrometry techniques for determining the structure and mechanisms of metal ion recognition and redox activity of metal binding oligopeptides

エレクトロスプレーイオン化(ESI)は、質量、全体的な電荷、金属結合相互作用、および立体形状を節約しながら、水相ペプチドまたはペプチド複合体をガス相に移すことができる。ESIとイオンモビリティ質量分析(IM-MS)の結合は、その状態測定、プロトネーション状態に関連するペプチドの質量対電荷(m/z)および衝突断面(CCS)の同時測定を可能にする器械的な技術を提供し、そして立体形状。ペプチド複合体の全体的な電荷は、1)ペプチドの酸性および塩基部位および2)金属イオンの酸化状態のプロトン化によって制御される。したがって、複合体の全体的な電荷状態は、ペプチド金属イオン結合親和性に影響を与える溶液のpHの関数である。ESI-IM-MS分析では、ペプチドおよび金属イオン溶液は水性のみの溶液から調製され、pHは希希水性酢酸または水酸化アンモニウムで調整されます。これにより、pH依存性および金属イオン選択性を特定のペプチドに対して決定することができる。さらに、ペプチド複合体のm/zおよびCCSは、B3LYP/LanL2DZ分子モデリングと共に、複合体の金属イオン協調および三次構造の結合部位を識別するために使用することができる。結果は、ESI-IM-MSが一連の代替メタノバクチンペプチドの選択的キレート性能を特徴付け、銅結合ペプチドメタノバクチンと比較する方法を示した。

amb1の金属結合 amb1(図1A)のIM-MS研究20は、銅イオンと亜鉛イオンの両方がpH依存様式でamb1に結合していることを示した(図2)。しかし、銅と亜鉛は、異なる協調部位における異なる反応機構を介してamb1に結合した。例えば、Amb1にCu(II)を加えると、ジスルフィドブリ?...

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Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

イオンモビリティ質量分析および分子モデリング技術は、設計された金属結合ペプチドおよび銅結合ペプチドメタノバクチンの選択的金属キレート性能を特徴付けることができる。金属キレートペプチドの新しいクラスを開発することは、金属イオンの不均衡に関連する疾患の治療につながるのに役立ちます。

金属イオン認識の構造とメカニズムを決定するイオン移動質量分析技術と金属結合オリゴペプチドの酸化還元活性

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

イオン移動性質量分析(IM-MS)は、ペプチドのpH依存性レドックスおよびメチル結合反応から様々な生成物イオンを同定する。三次構造の分子モデリングにより、金属相関を決定することができます。IM-MSは、質量電荷と到着時間を同時に測定し、そのストイチオメトリー、プロトネーション状態、および立体構造に関連して、各製品イオンを解決し、その分子組成を同定することができます。金属キレートペプチドのクラスを開発することは、メンケスやウィルソン病、癌、アルツハイマー病などの金属イオンのミスバランスに関連する疾患の治療につながる。まず、ESI入口チューブと針キャピラリーを約500マイクロリットルの0.1モル氷酢酸、0.1モル水酸化アンモニウム、そして最後に脱イオン水で十分に洗浄します。テキストプロトコルに記載されているネイティブ ESI-IM-MS 条件を使用して、10 ppm ポリ DL-アラニン溶液の陰イオンおよび正イオン IM-MS スペクトルをそれぞれ 10 分間収集します。ピペット200.0マイクロリットルの0.125ミリモル代替メサノブラクチン、またはアンブ溶液を1.7ミリリットルバイアルにする。500マイクロリットルの脱イオン水で希釈し、溶液を十分に混ぜます。サンプルのpHを3.0に調整し、50マイクロリットルの1.0モル酢酸溶液を添加します。pH調整サンプルに0.125ミリモル金属イオンの200.0マイクロリットルを加えます。次に、脱イオン水を加え、サンプルの最終体積を1.00ミリリットルにします。十分に混ぜ合わせ、室温で10分間平衡させます。鈍い鼻の注射器を使用して、サンプルの500マイクロリットルを取り、それぞれ5分間の陰性および正のイオンESI-IM-MSスペクトルを収集する。サンプルの残りの500マイクロリットルを使用して、校正されたマイクロpH電極を使用して最終pHを記録します。これらの手順を繰り返しますが、pHをpH 4、5、6、7、8、9、または10に調整する以外に、新しい量の酢酸または水酸化アンモニウム溶液を添加します。結果として得られる溶液の陰性イオンおよび正イオンESI-IM-MSスペクトルをそれぞれ10分間収集します。IM-MSスペクトルから、代替メサノブラクチンの荷電種が理論的な質量電荷同位体パターンに一致させることによって存在する荷電種を特定する。これを行うには、MassLynxを開き、クロマトグラムをクリックしてクロマトグラムウィンドウを開きます。[ファイル] メニューの [開く] をクリックして、IM-MS データ ファイルを見つけて開きます。右クリックしてクロマトグラムをドラッグし、解放して IM-MS スペクトルを抽出します。スペクトラムウィンドウが開き、IM-MSスペクトルが表示されます。スペクトル ウィンドウで、[ツール]および[同位体モデル]をクリックします。同位体のモデリングウィンドウで、amb種の分子式を入力し、荷電イオンボックスを表示するチェックボックスをオンにして、電荷状態を入力します。[OK] をクリックします。このプロセスを繰り返して、IM-MSスペクトル内のすべての種を同定し、質量電荷同位体範囲を記録します。各アンブ種について、偶然の質量電荷種を分離し、質量電荷同位体パターンを使用して到着時間分布(ATD)を抽出します。DriftScope を開き、[ファイル] と [開く] をクリックして、IM-MS データ ファイルを見つけて開きます。マウスを使用し、左クリックして、アンブ種の質量電荷同位体パターンを拡大します。選択ツールとマウスの左ボタンを使用して、同位体パターンを選択します。[現在の選択を受け入れる] ボタンをクリックします。偶然の質量電荷種を分離するには、選択ツールとマウス左ボタンを使用して、アンブ種の同位体パターンに合わせて ATD 時間を選択します。[現在の選択を受け入れる] ボタンをクリックします。ATD をエクスポートするには、[ファイル]、[MassLynx へのエクスポート] に移動します。次に、[ドリフト時間を保持]を選択し、ファイルを適切なフォルダに保存します。MassLynxのクロマトグラムウィンドウで、保存されたエクスポートされたファイルを開きます。[プロセス]をクリックし、メニューから統合し、[ApexTrack ピーク統合]ボックスをオンにして、[OK]をクリックします。ATDの中心と統合領域を記録します。保存されたすべてのアンブおよびポリDL-アラニンIM-MSデータファイルに対してこのプロセスを繰り返した後、各滴定点で抽出されたアンブ種すべてについて統合ATDを使用して、相対的なパーセンテージスケールに正規化します。これを行うには、アンブ種のアイデンティティと各pHでの統合ATDをスプレッドシートに入力します。各 pH に対して、統合された ATD の合計を使用して、個々の Amb 種の ATD をパーセンテージスケールに正規化します。各アンブ種対pHのパーセント強度をプロットして、各種の集団がpHの関数としてどのように変化するかを示す。スプレッドシートを使用して、ヘリウム緩衝ガスで測定されたポリDL-アラニン負イオンと正イオンの衝突断面を補正された衝突断面に変換します。次に、ポリDL-アラニンキャリブラントとアンブ種の平均到着時間をドリフトタイムに変換します。ポリDL-アラニンキャリブラントのドリフト時間と修正された衝突断面を差し込みます。次に、最小二乗回帰適合を使用して、A素数とB値を決定し、ここでA素数は温度、圧力、および電界パラメータの補正であり、BはIMデバイスの非線形効果を補正します。これらの A 素数と B の値を中心のドリフト時間値を使用して、修正された衝突の断面と衝突の断面を決定します。この方法は、ガウスビューを使用して約2%の推定絶対誤差を有するペプチド種の衝突断面を提供し、B3LYP LanL2DZレベルの理論は、観察された質量電荷amb種のすべての可能なタイプの調整のための幾何学的最適化された適合体を見つける。B3LYP LanL2DZレベルの理論は、ベッケの3つの境界ハイブリッド機能、ダニング基準セット、電子コア電位で構成されています。ガウス出力ファイルから最適化された適合者の熱化学分析を抽出し、シグマプログラムのイオンスケールのレナード・ジョーンズ法を用いて、その理論的衝突断面を計算します。最も低い自由エネルギーの適合者から、IM-MS測定された衝突断面に同意するLennard-Jones衝突断面を示すコンフォーマを決定する。このプロセスは、実験で観察された適合者の三次構造と協調の種類を特定する。分子モデリングでは、異なる金属キレート部位、シスおよびトランスペプチド結合、塩橋、水素結合、およびpi-cation相互作用を有する適合者の自由エネルギーおよび衝突断面を比較する必要があります。代替メタナロバクチンのIM-MS研究は、それがpH依存的な方法で銅イオンと亜鉛イオンの両方をキレートすることを示したが、異なる反応機構および協調部位を通じて。亜鉛(II)結合は6より大きいpHで観察され、主に単一の負電荷複合体を形成し、亜鉛(II)が2つのイミダゾールと2つのチオラ化によって四面的に調整されたことを示す。銅(II)結合はジスルフィド橋を形成するチオールを伴った。6を超えるpHで、単一の負帯電銅(II)複合体が形成され、イミダゾールと2つの脱プロトン化されたアミド窒素が銅(II)を配位していたことを示す(II)しかし、pH6以下では銅(II)を加えて、単一正に帯電した銅(I)複合体とpH6以上の単一の正電荷銅(II)錯体を形成した。また、A00m2とamb 4のIM-MS研究では、銅反応によって、分子間または分子内ジスルフィド橋の数、銅(I)または銅(II)イオンの数、およびpHの関数として変化した脱プロトン化部位の数が異なる製品が与え出されたことも示されています。分子モデル化によるIM-MSの結果から、代わりのメサロバクチンは、チオレート、イミダゾール、カルボキシレート基を介して最大3個の銅(I)イオンを調整できることが示されました。IM-MSインストゥルメンタルの設定は、テキストに記載されているように、ペプチドのストイチオメトリー、電荷分布、および立体構造構造を保存するために慎重に選択する必要があります。アスパラギン酸のチロシンのような金属の配位に影響を与えるより広いサイズの組合せは構造および機能間の関係のより大きい理解を可能にする。分子モデリングを用いたIM-MSは、タンパク質、DNA、脂質、およびそれらの複合体の立体構造構造を決定するための結晶学とNMR分光法を加速する代替技術となっています。

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