Name: ion mobility-mass spectrometry techniques for determining the structure and mechanisms of metal ion recognition and redox activity of metal binding oligopeptides
Uploaded: 2019-09-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopepti

Этот материал основан на работе, поддерживаемой Национальным научным фондом в соответствии с 1764436, поддержкой инструментов NSF (MRI-0821247), Фондом Уэлча (T-0014) и вычислительными ресурсами Министерства энергетики (TX-W-20090427-0004-50) и L3 Communications . Мы благодарим группу Бауэра Калифорнийского университета - Санта-Барбара за то, что они поделились программой Sigma и Айобами Илесанми за демонстрацию техники в видео.

1. Подготовка реагентов
<ol><li>Культура Метилосинус трихоспорий OB3b, изолировать Cu (I) бесплатно mb-OB3b18,22,23, заморозить сухой образец и хранить при -80 градусов по Цельсию до использования.</li>
	<li>Синтезировать амб пептиды (ямт;98% чистоты д?...

Критические шаги: сохранение поведения на фазе решения для обследования через ESI-IM-MS Родные инструментальные настройки ESI должны быть использованы, которые сохраняют пептид ытоихиометрии, состояние заряда и конформационную структуру. Для местных условий необходимо оптимиз?...

Ионы меди и цинка имеют важное значение для живых организмов и имеют решающее значение для процессов, включая окислительную защиту, рост тканей, дыхание, холестерин, метаболизм глюкозы и чтение генома1. Для обеспечения этих функций, такие группы, как тиолат Cys, имидазол его2,3, (более редко) тиоэтер метионина, и карбоксилат глю и Асп выборочно включать металлы в качестве кофакторов в активных местах металлургии. Сходство этих координационных групп поднимает интригующий вопрос о том, как Его и Кис лиганды выборочно включать либо Cu (I/II) или N (II) для обеспечения правильного функционирования.
Селективная привязка часто достигается путем приобретения и оборота пептидов, которые контролируют концентрации ионов Cu (I/II)4. Cu(I/II) является высокореактивной и вызывает окислительный ущерб или приключений связывания с ферментами, так что его свободная концентрация жестко регулируется медных сопровождающих и медно-регулирующих белков, которые транспортируют его безопасно в различные места в клетке и плотно контролировать свой гомеостаз5,6. Нарушение метаболизма меди или гомеостаза непосредственно связано с болезнью Менкеса и Уилсона7, а также рак7 и нервные расстройства, такие как прион8 и болезнь Альцгеймера9.
Болезнь Уилсона связана с повышением уровня меди в глазах, печени и участках мозга, где редокс-реакции Cu (I/II) производят реактивные виды кислорода, вызывая гепатомлентику и неврологическую дегенерацию. Существующие хелатотерапии являются небольшой тиол аминокислоты пеницилламин и триэтиленетрамин. Кроме того, метанотрофных медь приобретения пептиды метанобатактина (мб)10,11 экспонат терапевтический потенциал из-за их высокой связывающей сродство cu (I)12. Когда метанобактин (mb-OB3b) из трихоспория Methylosinus OB3b был изучен в животной модели болезни Вильсона, медь была эффективно удалена из печени и выводится через желчь13. Эксперименты in vitro подтвердили, что mb-OB3b может хеляции меди из медного металлотионеина, содержащегося в цитозоле печени13. Лазерная абляция индуктивно связаны плазменной массой спектрометрии визуализации методы исследовали пространственное распределение меди в болезни Вильсона образцы печени14,15,16 и показали, что mb-OB3b удаляет медь с короткими периодами лечения только 8 дней17.
MB-OB3b также будет связываться с другими ионами металла, включая Ag (I), Au(III), Pb (II), Mn (II), Co (II), Fe (II), Ni (II), и Зн(II)18,19. Конкуренция за физиологические Cu (I) связывания сайт выставлен ag (I), потому что он может вытеснить Cu (I) из комплекса MB-OB3b, как с Ag (I) и Ni (II) также показывает необратимые связывания мб, которые не могут быть смещены Cu (I)19. В последнее время серия альтернативных метаноактина (амб) олигопептиды с 2His-2Cys связывающий мотив были изучены20,21, и их N (II) и Cu (I/II) связывающие свойства характеризуется. Их первичные аминокислотные последовательности похожи, и все они содержат мотив 2His-2Cys, Pro и ацетилированный N-терминус. Они в основном отличаются от mb-OB3b, потому что мотив 2His-2Cys заменяет два энетиола оксазолон связывания сайтов mb-OB3b.
Ионизация электроспрея в сочетании с ионно-массовой спектрометрией (ESI-IM-MS) обеспечивает мощную инструментальную технику для определения металлосвязывающих свойств пептидов, поскольку она измеряет их массу к заряду(м/з)и столкновение поперечное сечение (CCS) при сохранении их массы, заряда и конформационной формы от фазы решения. М/з и CCS относятся к пептидам стоихиометрии, состоянию протонации и конформации. Stoichiometry определяется потому, что личность и количество каждого элемента, присутствуют в видов явно определены. Общий заряд пептидного комплекса связан с состоянием протонации кислых и основных участков и состоянием окисления металлического иона (ы). CCS дает информацию о конформиционной форме пептидного комплекса, поскольку она измеряет вращенный средний размер, который относится к третичной структуре комплекса. Общее состояние заряда комплекса также является функцией рН и влияет на металлическую ионную сродство пептида, потому что депротонированные основные или кислые участки, такие как карбоксил, его, Cys и Tyr, также являются потенциальными местами связывания металлического иона. Для анализа пептид и ион металла готовятся в водных растворах с рН, скорректированным разбавленной aqueous уксусной кислотой или гидроксидом аммония. Это позволяет определить зависимость от рН и селективность ионов металла для пептида. Кроме того, м/з и CCS, определенные ESI-IM-MS, могут быть использованы с помощью молекулярного моделирования B3LYP/LanL2D, чтобы обнаружить тип координации ионов металла и третичной структуры комплекса. Результаты, приведенные в этой статье, показывают, как ESI-IM-MS может охарактеризовать селективную хелатную производительность набора пептидов amb и сравнить их с медно-связывающим пептидом mb-OB3b.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetonitrile HPLC-grade</td>
			<td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td>
			<td>A998SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide (trace metal grade)</td>
			<td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td>
			<td>A512-P500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>255599-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper(II) chloride 99.999%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>203149-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper(II) nitrate hydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>229636-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides</td>
			<td>Neo BioLab (neobiolab.com)</td>
			<td></td>
			<td>designed peptides were synthized by order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>designed amb5B,C,D,E,F peptides</td>
			<td>PepmicCo (www.pepmic.com)</td>
			<td></td>
			<td>designed peptides were synthized by order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Driftscope 2.1 software program</td>
			<td>Waters (www.waters.com)</td>
			<td></td>
			<td>software analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&#38;M-Commerce)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glacial acetic acid (Optima grade)</td>
			<td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td>
			<td>A465-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+</td>
			<td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td>
			<td>12357-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lead(II) nitrate ACS grade</td>
			<td>Avantor (www.avantormaterials.com)</td>
			<td>128545-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>203734-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx 4.1</td>
			<td>Waters (www.waters.com)</td>
			<td></td>
			<td>software analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nickel chloride hexahydrate 99.99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>203866-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-DL-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>P9003-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silver nitrate 99.9%+</td>
			<td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td>
			<td>11414-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Synapt G1 HDMS</td>
			<td>Waters (www.waters.com)</td>
			<td></td>
			<td>quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zinc chloride anhydrous</td>
			<td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td>
			<td>A16281</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ion mobility-mass spectrometry techniques for determining the structure and mechanisms of metal ion recognition and redox activity of metal binding oligopeptides

Ионизация электроспрея (ESI) может передавать пептидный или пептидный комплекс в газофазный комплекс, сохраняя при этом его массу, общий заряд, металлосвязывающие взаимодействия и конформационную форму. Соединение ESI с ионной массой-спектрометрией (IM-MS) обеспечивает инструментальную технику, которая позволяет одновременно измерять массу пептида к заряду (м/з) и сечение столкновения (CCS), которые относятся к его стойхиометрии, состоянию протонации, и конформационная форма. Общий заряд пептидного комплекса контролируется протонацией 1) кислой пептидной и основных участков пептида и 2) состояния окисления металлического иона (ы). Таким образом, общее состояние заряда комплекса является функцией рН раствора, который влияет на пептиды металлических ионных связывающих сродства. Для анализа ESI-IM-MS решения пептида и ионов металла готовятся из растворов только для водных, при этом рН регулируется с разбавленной aqueous уксусной кислотой или гидроксидом аммония. Это позволяет определить зависимость от рН и селективность ионов металла для конкретного пептида. Кроме того, м/з и CCS пептидного комплекса могут быть использованы с помощью молекулярного моделирования B3LYP/LanL2D, чтобы различить связывающие участки координации иона металла и третичной структуры комплекса. Результаты показывают, как ESI-IM-MS может охарактеризовать селективное хелатирование работы набора альтернативных пептидов метанобактина и сравнить их с медно-связывающим пептидным метанобактином.

Металлический переплетамб1 IM-MS исследование20 из amb1 (Рисунок 1A) показали, что как медь и цинк ионов связаны с amb1 в рН-зависимым образом (Рисунок 2). Тем не менее, медь и цинк связаны с amb1 через различные ...

Watch this Scientific Journal Video about Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopepti

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Ионно-массовая спектрометрия и методы молекулярного моделирования могут характеризовать селективное металлическое хелативирование производительности разработанных металлосвязывающих пептидов и медно-связывающего пептида метанобактина. Разработка новых классов металлических хелатных пептидов поможет привести к терапии заболеваний, связанных с дисбалансом ионов металла.

Ионная мобильность-массовая спектрометрия Методы для определения структуры и механизмов распознавания ионов металла и Redox деятельности металлических связывая олигопептиды

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Ионная мобильность-масс-спектрометрия, или IM-MS, идентифицируют различные ионы продуктов из рН-зависимой редокса и метилобязательной реакции пептидов. При молекулярном моделировании их третичной структуры можно определить корреляцию металла. IM-MS может решить каждый из ионов продукта и определить их молекулярный состав путем одновременно измерять их время масс-к-заряда и прибытия и relating to их stoichiometry, положение протонации, и конформациальная структура.Разработка классов металлических хелатирующих пептидов поможет привести к терапевтическим заболеваниям, связанным с дисбалансом ионов металла, таким как болезнь Менкеса и Уилсона, рак и болезнь Альцгеймера. Для начала тщательно очистите входные трубки ESI и капилляр иглы примерно с 500 микролитров 0,1 молярной ледниковой уксусной кислоты, 0,1 гидроксида молярного аммония и, наконец, деионизированной воды. Используйте родные условия ESI-IM-MS, описанные в текстовом протоколе, для сбора отрицательных и положительных ионных спектров IM-MS 10 ppm поли-DL-аланина решения в течение 10 минут каждый.Пипетка 200.0 микролитров 0,125 миллимолярный альтернативный метанобактин, или амб раствор, в 1,7 миллилитров флакона. Разбавить 500 микролитров деионизированной воды и тщательно перемешать раствор. Отрегулируйте рН образца до 3,0, добавив 50 микролитров раствора 1,0 молярной уксусной кислоты.Добавьте 200,0 микролитров иона металла 0,125 миллимолара в скорректированный рН образец. Затем добавьте деионизированную воду, чтобы получить окончательный объем в 1,00 миллилитров образца. Тщательно перемешайте и дайте образцу равноденствие в течение 10 минут при комнатной температуре.Используя тупой шприц носа, возьмите 500 микролитров образца и соберите отрицательные и положительные ионные спектры ESI-IM-MS в течение пяти минут каждый. Используйте оставшиеся 500 микролитров образца для записи его окончательного рН с помощью откалиброванного микро-электрода рН. Повторите эти шаги, за исключением корректировки рН до рН четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или 10, добавив новые объемы уксусной кислоты или гидроксида аммония решений.Соберите отрицательные и положительные ионные спектры ESI-IM-MS полученных решений в течение 10 минут каждый. Из спектра IM-MS определите, какие заряженные виды альтернативного метанобактина присутствуют, сопоставляя их с их теоретическими изотопами массы к зарядке. Для этого откройте MassLynx и нажмите на хроматограмму, чтобы открыть окно Хроматограммы.Перейдите в меню File и Откройте, чтобы найти и открыть файл данных IM-MS. Извлекайте спектр IM-MS, нажимая правой кнопкой мыши, перетаскивая хроматограмму и выпуская. Откроется окно спектра, показывающее спектр IM-MS.В окне спектра нажмите на инструменты и изотопную модель. В окне моделирования Isotope введите молекулярную формулу вида амб, проверьте заряженную ионовую коробку Show и введите состояние заряда. Нажмите OK. Повторите этот процесс, чтобы идентифицировать все виды в спектре IM-MS и зафиксировать их диапазон изотопов массы до заряда.Для каждого вида амб, отделить любые случайные массы к зарядке видов и извлечь их распределения времени прибытия, или ATDs, используя их массы к зарядке изотопов моделей для их идентификации. Откройте DriftScope и нажмите на файл и откройте, чтобы найти и открыть файл данных IM-MS. Используйте мышь и левым щелчком мыши, чтобы увеличить масштаб массы до зарядки изотопного узора вида амб.Используйте инструмент выбора и левую кнопку мыши, чтобы выбрать изотопный шаблон. Нажмите кнопку Приемлемого текущего выбора. Чтобы отделить любые случайные виды массы к зарядке, используйте инструмент выбора и левую кнопку мыши, чтобы выбрать время ATD, приведенную в соответствие с изотопным рисунком вида амб.Нажмите кнопку Приемлемого текущего выбора. Для экспорта ATD, перейдите на файл, экспорт в MassLynx. Затем выберите Сохранить время дрейфа и сохранить файл в соответствующую папку.В окне Chromatogram MassLynx откройте сохраненный экспортируемый файл. Нажмите на process, Интегрируйте из меню, проверьте поле ApexTrack Peak Integration и нажмите OK. Запись центроида и интегрированной области ATD. После повторения этого процесса для всех сохраненных файлов данных amb и poly-DL-alanine IM-MS, используйте интегрированный ATD для всех извлеченных видов amb или положительных или отрицательных ионов на каждом пункте титрования для того чтобы нормализовать к относительной шкале процента.Для этого введите идентичности вида амб и их интегрированного ATD при каждом рН в электронную таблицу. Для каждого рН используйте сумму интегрированных ПДД для нормализации отдельных amb species'ATD в процентном соотношении. Участок процент интенсивности каждого вида амб по сравнению с рН, чтобы показать, как популяция каждого вида варьируется в зависимости от функции рН.Используя электронную таблицу, преобразуете поперечные сечения поли-DL-аланина отрицательные и положительные ионы, измеренные в буферном газе гелия, в исправленные поперечные сечения столкновения. Затем преобразуем среднее время прибытия поли-DL-аланин-калибрантов и амб видов в дрейф раз. Подключите поли-DL-аланин calibrants'drift раз по сравнению с их исправлены столкновения поперечных сечений.Затем, используя наименее квадратную регрессию, определите значения A prime и B, где прайм является коррекцией параметров температуры, давления и электрического поля, а B компенсирует нелинейный эффект устройства чата. Используя эти значения A prime и B с значением времени дрейфа центроидов, определите их исправленные поперечные сечения столкновения и поперечные сечения столкновения. Этот метод обеспечивает столкновение поперечных сечений для пептидных видов с оценками абсолютных ошибок около 2%Использование Gaussian с GaussView, и Уровень теории B3LYP LanL2D, найти геометрии оптимизированных конформеров для всех возможных типов координации наблюдаемых масс-к-заряда амб видов.Теория теории B3LYP LanL2D состоит из трех гибридных функциональных элементов периметра Becke, набора основ Даннинга и потенциалов электронного ядра. Извлекайте термохимический анализ каждого из оптимизированных конформеров из гауссийского выходного файла и вычисляйте их теоретические поперечные сечения столкновений с помощью ионно-масштабного метода Леннарда-Джонса из программы Sigma. От самых низких свободных конформеров энергии, определить, какой конформист экспонатов Леннард-Джонс столкновения поперечного сечения, что согласен с IM-MS измеряется столкновения поперечного сечения.Этот процесс определяет третичную структуру и тип координации для конформистов, наблюдаемых в эксперименте. Молекулярное моделирование требует сравнения свободной энергии и столкновения поперечных сечений конформеров с различными металлическими хелатирующими участками, cis и транс-пептидными связями, соляными мостами, водородными связями и пи-катионом взаимодействий. Исследование альтернативного метанобактина, проведенное IM-MS, показало, что он хелатировал ионы меди и цинка в зависимости от рН образом, но с помощью различных механизмов реакции и координационных участков.Связывание цинка (II) наблюдалось при рН более шести, в основном образуя единый отрицательно заряженный комплекс, указывающий на то, что цинк (II) был тетрагедрально скоординирован двумя имидазолами и двумя тиолатами. Медь (II) связывание сопровождалось тиолами, образующими дисульфидный мост. При рН более шести образовался единый отрицательно заряженный медный (II) комплекс, указывающий на то, что имидазол и два депротонированных амидных азота координировали медь (II)Однако, ниже рН шесть, добавив медь (II), также образовался единый положительно заряженный медный (I)комплекс, а также единый положительно заряженный медный (II)комплекс выше рН шесть.Im-MS исследования амб два и амб четыре также показывают, что медные реакции дали продукты, которые отличаются по количеству меж- или внутримолекулярных дисульфидных мостов, количество меди (I) или меди (II) ионов, а также количество сайтов депротонации, которые изменились в зависимости от функции рН. Результат IM-MS с молекулярным моделированием показал, что альтернативные метанобактины могут координировать до трех медных (I) ионов через тиолат, имидазолы и карбоксилатные группы. Инструментальные настройки IM-MS должны быть тщательно подобраны для сохранения пептидов'stoichiometry, распределения заряда, и конформации структур, как описано в тексте.Сочетание более широкого диапазона размеров, которые будут влиять на координацию металла, таких как тирозин на аспарагиновой кислоты позволит лучше понять взаимосвязь между структурой и функцией. IM-MS с молекулярным моделированием стали альтернативными методами ускорения кристаллографии и спектроскопии ЯМР для определения конформативных структур белков, ДНК, липидов и их комплексов.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Atoms and Elements

SCIENTISTS IN ACTION

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Противоопухолевые комплексы металлов: синтез и цитотоксичности оценка по методу МТТ-анализ

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Analyzing the Photo-oxidation of 2-propanol at Indoor Air Level Concentrations Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry

Анализируя фотоокисления 2-пропанол уровня концентраций воздуха с помощью поля асимметричной ионной подвижности спектрометрии

We demonstrate a versatile protocol to be used for determining the effectiveness of photocatalysts in degrading indoor air concentration (ppb) volatile ...

Determining the Chemical Composition of Corrosion Inhibitor/Metal Interfaces with XPS: Minimizing Post Immersion Oxidation

Определение химического состава ингибитора коррозии / Metal Интерфейсы с XPS: Минимизация Сообщение Погружение Окисление

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

Лиганд опосредованной зарождения и роста наночастиц металла палладия

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Функционализация поверхности металлоорганических рамок для улучшения влагостойкости

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Коррозионная обработка изображений в интерфейсе Metal-краски с использованием вторичной спектрометрии "время полета"

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

Количественная оценка металлоизмов в иммобилизованной хроматографии сродства металла

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Identification and Quantification of Decomposition Mechanisms in Lithium-Ion Batteries; Input to Heat Flow Simulation for Modeling Thermal Runaway

Идентификация и количественная оценка механизмов разложения в литий-ионных батареях; Входные данные для моделирования теплового потока для моделирования теплового разбега

The risks and possible accidents related to the normal use of lithium-ion batteries remain a serious concern. In order to get a better understanding of ...