Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من خلال اتفاقية تعاونية (W81XWH-11-2-0174) بين مؤسسة هنري إم جاكسون للنهوض بالطب العسكري، ووزارة الدفاع الأمريكية. تم تلقي الأجسام المضادة لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 gp41 mAb 167-D IV من الدكتورة سوزان زوللا-بازنر من خلال برنامج الكاشف للإيدز في المعاهد القومية للصحة.

<ol>
	<li>Karch, C. P., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+technologies:+From+whole+organisms+to+rationally+designed+protein+assemblies.">Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies.</a> Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).</li><li>Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Immunologic+Properties+of+Soluble+Versus+Particulate+Antigens.">Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens.</a> Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).</li><li>Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+basis+for+enhanced+immunity+of+nanoparticle+vaccines.">Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).</li><li>Yeates, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Principles+for+Designing+Highly+Symmetric+Self-Assembling+Protein+Nanomaterials.">Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).</li><li>Marcandalli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Potent+Neutralizing+Antibody+Responses+by+a+Designed+Protein+Nanoparticle+Vaccine+for+Respiratory+Syncytial+Virus.">Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus.</a> Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decorating+Self-Assembled+Peptide+Cages+with+Proteins.">Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins.</a> ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).</li><li>Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembling+Protein+Nanoparticles:+implications+for+HIV-1+vaccine+development.">Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development.</a> Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).</li><li>Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+design+of+peptides+that+self-assemble+into+regular+polyhedral+nanoparticles).">Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles).</a> Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+displaying+HIV-1+Env+V1V2+loop+in+a+native-like+trimeric+conformation+as+vaccine+antigen.">Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen.</a> Nanomedicine. , (2018).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+P.+falciparum+specific+coiled-coil+domain+to+construct+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+to+prevent+malaria.">The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-adjuvanted+nanoparticle+based+vaccine+against+infectious+bronchitis+virus.">A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus.</a> PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).</li><li>Wahome, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+display+of+4E10+and+2F5+epitopes+on+self-assembling+protein+nanoparticles+as+a+potential+HIV+vaccine.">Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+novel+immunogenic+nanoparticle+platform+for+Toxoplasma+peptide+vaccine+in+HLA+transgenic+mice.">Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice.</a> Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonadjuvanted+polypeptide+nanoparticle+vaccine+confers+long-lasting+protection+against+rodent+malaria.">A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria.</a> Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibody+and+CD8++T-cell+responses+to+the+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+protein+induced+by+a+nanoparticle+vaccine.">Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine.</a> PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).</li><li>Seth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+targeting+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+delivered+in+three+Army+Liposome+Formulation+adjuvants.">Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants.</a> Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+nanoparticles+with+built-in+flagellin+domains+increases+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+falciparum+based+vaccine.">Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine.</a> Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanovaccine+confers+robust+immunity+against+Toxoplasma.">Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma.</a> NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+self-adjuvanted+protein+nanoparticles+provides+protection+against+lethal+influenza+challenge.">Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge.</a> Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).</li><li>Haynes, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-correlates+analysis+of+an+HIV-1+vaccine+efficacy+trial.">Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial.</a> New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).</li><li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand.">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).</li><li>O&#39; Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+gp120+V1V2+loop:+structure,+function+and+importance+for+vaccine+development.">The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development.</a> Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).</li><li>Babapoor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Vaccine+Using+Nanoparticle+Platform+to+Present+Immunogenic+M2e+against+Avian+Influenza+Infection.">A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection.</a> Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).</li><li>Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+self-assembling+protein+nanoparticle+architectures+for+applications+in+vaccine+design.">Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design.</a> Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).</li><li>Indelicato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+Governing+the+Self-Assembly+of+Coiled-Coil+Protein+Nanoparticles.">Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles.</a> Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).</li><li>Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+assemblies+and+their+biomedical+applications.">Nanoscale assemblies and their biomedical applications.</a> Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).</li><li>Rey, F. A., Lok, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Features+of+Enveloped+Viruses+and+Implications+for+Immunogen+Design+for+Next-Generation+Vaccines.">Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines.</a> Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Endotoxins.">Bacterial Endotoxins.</a> United States Pharmacopeia (USP). , (2011).</li><li>. Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/media/76255/download">https://www.fda.gov/media/76255/download</a> (1993)</li></ol>

والآراء المعرب عنها هي آراء المؤلفين ولا ينبغي تفسيرها على أنها تمثل مواقف الجيش الأمريكي أو وزارة الدفاع. بيتر Burkhard لديه مصلحة في الشركة تسمى ألفا-O الببتيدات AG ولديه براءات الاختراع على التكنولوجيا. وليس للمؤلفين الآخرين أي انتماء أو مشاركة مالية مع أي شركة لها مصلحة مالية في الموضوع المعروض في هذه الورقة.

توفر تقنية النانو العديد من المزايا والحلول لتطوير اللقاحات الفرعية. اللقاحات النانوية يمكن أن تقدم مرارا وتكرارا مستضدات كجسيمات إلى الجهاز المناعي المضيف زيادة المناعة26. في حين أن هناك العديد من أنواع مختلفة من اللقاحات النانوية، ونحن نعتقد أن تلك التي تتألف من البروتين دي نوفو مصممة يبدو أن أقوى نهج لتطوير اللقاحات1. ويمكن هندستها دون أي تسلسل homology إلى البروتينات المضيفة وتقديم مستضد من الاهتمام في مقربة من المطابقة مثل السكان الأصليين مع توفير تكلفة الإنتاج منخفضة وارتفاع غلة المنتج. ومن الأمثلة الرئيسية على هذا النهج تكنولوجيا SAPN، التي طبقناها على اللقاحات ضد الأمراض المعدية المتعددة7. معالجة الصعوبات في تطوير لقاح فيروس نقص المناعة البشرية-1، قمنا بهندسة نواة فريدة من نوعها SHB-SAPN لتقديم فعال مستضد V1V2 في مطابقة تقليم الأصليمثل 9. العديد من أهداف اللقاحات، وخاصة بالنسبة للأمراض الفيروسية، موجودة كأجهزة تشذيب27. وتشير هذه الظاهرة إلى أن تصميمنا في شبكة سابن له آثار واسعة النطاق على تطوير لقاحات الوحدات الفرعية.
في هذه الطريقة، نقوم بتوضيح كيفية إنتاج SHB-SAPNs في نظام التعبير القولونية E. عبرنا عن غلة عالية من البروتين (حوالي 6 ملغ / 100 مل من الثقافة). يحتوي البروتين على 10 هيستيدينات وتم تنقيته بسهولة باستخدام الكروماتوغرافيا المعدنية المعطلة مع عمود Ni2+. تم العثور على هذا الطول من العلامة له ليكون الأمثل لأعلى عائد البروتين. يحتوي البروتين المنقى على طول كامل للبروتين المصمم كما يتضح من وجود كل من محطة N HisTag وتكرار heptad محطة C. لقد استخدمنا تقنيات مقبولة على نطاق واسع وقمنا بتحسينها للتعبير عن جوهر SHB-SAPN وإنتاجه وتوصيفه. عدم إنتاج البروتين كامل الطول أثناء تطوير SAPN التي تحتوي على epitope البروتين الجديد يمكن أن تشير إلى مشكلة التعبير عن الجين في الخلية المضيفة. وفي حالة حدوث ذلك، يجب إعادة تصميم الجين ونظام التعبير وتكييفه مع البروتوكول الموصوف. تعديل وقت sonication أو كثافة قد تزيد أيضا من تركيز البروتين الكامل طول المتوقعة.
وكانت الجسيمات المعاد طيها في نطاق الحجم المتوقع (20 إلى 100 نانومتر)8و24و25 على النحو الذي يحدده تحليل DLS وتتبع الجسيمات النانوية. وقد تأكدت هذه النتائج كذلك باستخدام TEM. إذا كانت هناك مشاكل في هذه الخطوة، عادة ما يرجع ذلك إلى مشكلة في درجة الحموضة أو قوة الأيونية من المخزن المؤقت إعادة طي. عندما يتم الكشف عن جزيئات كبيرة الحجم على تقنيات تغيير حجم الجسيمات، فإنه يشير إلى التجميع، والتي يمكن تجنبها عن طريق زيادة الحموضة من المخزن المؤقت إعادة طي. إذا لم يتم الكشف عن الجسيمات بواسطة DLS، تحقق من تركيز البروتين وتحقق من الحموضة في المخزن المؤقت. يجب أن يكون تركيز البروتين النهائي لـ DLS 100 ميكروغرام/مل على الأقل. إذا لم يكن التركيز هو المشكلة، فإنه يشير إلى وفرة الجسيمات الصغيرة، شكلت بشكل غير كامل، والتي يمكن تقليل تركيزها عن طريق خفض درجة الحموضة. بدلا من ذلك، يمكن تعديل تركيز كلوريد الصوديوم إلى النطاق الأمثل لتقليل وجود الجسيمات ذات الحجم غير المرغوب فيه.
وأخيرا، باستخدام خطوة غسل isopropanol خلال تنقية كنا قادرين على الحد من تلوث LPS من المضيف E. القولونية إلى 0.01 الاتحاد الأوروبي / ميكروغرام من SAPN الذي هو أقل من الحد الأقصى لإدارة الغذاء والدواء (FDA) من 5 الاتحاد الأوروبي / كجم من وزن الجسم للمنتجات عن طريق الحقن 28.ويمكن تخفيض هذا المستوى مرة أخرى باستخدام عمود تبادل anion المعروف أيضا باسم عمود Q. إذا كانت مستويات عالية من endotoxin لا تزال موجودة، تحقق من جميع المواد التي تم استخدامها لإعداد العازلة. تذكر أن تستخدم فقط الأواني الزجاجية depyrogenated والأواني البلاستيكية المبطنة الحرة في هذه الطريقة.
وتشير هذه النتائج إلى أننا نجحنا في تطوير طريقة لإنتاج نواة SHB-SAPN التي يمكن استخدامها في دراسات التحصين قبل السريرية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة مع تعديلات طفيفة فقط، إن وجدت، على تنقية SHB-SAPNs عند إضافة مستضد للاهتمام. استخدام هذا الأسلوب كنقطة بداية أحد التغييرات الرئيسية في خطوة elution. البروتينات المختلفة elute في تركيزات إيميدازول مختلفة التي يجب تحديدها تجريبيا. قد يكون الفرق الرئيسي الآخر تكوين المخزن المؤقت إعادة طي. وسيتطلب التحسين اختبار ظروف مختلفة من الحموضة فضلا عن نقاط القوة الأيونية.
وبالنظر إلى الأعمال المقبلة، لا يلزم سوى تعديلين طفيفين للسماح بالتطبيق البشري للخطة. الأول هو أن ناقلات التعبير يحتاج إلى تغيير إلى مقاومة كاناماسين علامة اختيار بسبب حساسية أمبيسلين في البشر29. والشرط الرئيسي الآخر لتصنيع البروتين للاستخدام البشري هو إنتاج SHB-SAPN في وسائل الإعلام الخالية من المنتجات الحيوانية. وقد أشارت دراسة صغيرة النطاق بالفعل إلى وجود عائد معقول من البروتين في وسائط الإعلام النباتية. العمل المعروض هنا قابل للتطوير بسهولة لإنتاج GMP النهائي كما هو موضح مع مرشح لقاح الملاريا، FMP01416. هذا الإنتاج FMP014-SAPN على نطاق واسع شملت كل من تبادل الأنيون وخطوات تبادل الموجبة لزيادة خفض LPS و Ni2+ المحتوى من المنتج النهائي. وقد تم بالفعل توسيع هذه SAPN التي تعبر عنها البكتيرية للمرحلة القادمة 1/2a التجربة السريرية.

وفي حين أن تطوير اللقاحات التقليدية قد ركز على مسببات الأمراض المعطلة أو المخففة، فقد تحول تركيز اللقاحات الحديثة نحو لقاحات الوحدات الفرعية1. ويمكن أن يؤدي هذا النهج إلى استجابة أكثر استهدافاً، وربما إلى مرشحين أكثر فعالية للقاحات. ومع ذلك، فإن أحد العيوب الرئيسية هو أن لقاحات الوحدات الفرعية ليست جسيمات مثل الكائنات الحية الكاملة التي يمكن أن تؤدي إلى انخفاض المناعة2. يمكن أن يكون للجسيمات النانوية كنظام عرض مستضد متكرر فوائد كل من نهج لقاحالوحدة الفرعية المستهدفة وكذلك الطبيعة الجسيمية للكائن الحي بأكمله 1،3.
من بين الأنواع الموجودة من اللقاحات النانوية، تسمح مجموعات البروتين المصممة بشكل رشيد بتصميم وتطوير المرشحين للقاحات التي يمكن أن تقدم نسخ متعددة من المستضد المحتمل في مطابقة مثل السكان الأصليين1،4 ،5،6. ومن الأمثلة على هذه التجمعات البروتينية الجسيمات النانوية البروتينية ذاتية التجميع (SAPNs)7. وتستند SAPNs على المجالات لفائف لفائف ويتم التعبير عنها تقليديا في الإشريكية القولونية8. تم تطوير المرشحين للقاح SAPN لمجموعة متنوعة من الأمراض مثل الملاريا والسارس والأنفلونزا وداء المقوسات وفيروس نقص المناعة البشرية-19و10و11و12و13 , 14 سنة , 15 , 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19-وتصميم كل مرشح من مرشحي شبكة سابن خاص بمسببات الأمراض ذات الأهمية، غير أن تقنيات الإنتاج والتنقية وإعادة الطي قابلة للتطبيق عموماً على نطاق واسع.
وأحد مصالحنا الحالية هو لقاح فعال لفيروس نقص المناعة البشرية-1. في RV144 - المرحلة الثالثة الوحيدة من التجارب السريرية للقاح فيروس نقص المناعة البشرية-1 التي أظهرت فعالية متواضعة - كان يرتبط انخفاض خطر العدوى مع الأجسام المضادة IgG إلى حلقة V1V2 من البروتين المغلف20،21. ويعتقد أن العرض الذي يشبه العرض التريمريك الأصلي لهذه المنطقة مهم للمناعة الوقائية22. لتقديم حلقة V1V2 في أقرب ما يمكن إلى المطابقة مثل السكان الأصليين، وضعنا دليلا على مبدأ SAPN مرشح لقاح التي تحتوي على فيروس نقص المناعة البشرية-1 مغلف ما بعد الانصهار حزمة ستة الحلزون (SHB) لتقديم حلقة V1V2 في المطابقة الصحيحة9 . تم التعرف على هذا المرشح من قبل الأجسام المضادة أحادية النسيلة المعروفة لبروتين المغلف HIV-1. الفئران المحصنة مع V1V2-SHB-SAPN أثار V1V2 الأجسام المضادة المحددة، وهذا الأهم من ذلك، ملزمة لgp70 V1V2، epitopes المطابقة الصحيح9. ويمكن أن يكون لجوهر SHB-SAPN وظائف أخرى تتجاوز الدور كناقل لحلقة فيروس نقص المناعة البشرية-1 V1V2. هنا نقوم بوصف منهجية مفصلة للتعبير، وتنقية، وإعادة طي، والتحقق من صحة الأساسية SHB-SAPN. وقد تم وصف اختيار تسلسل، وتصميم الجسيمات النانوية، والاستنساخ الجزيئي، وتحويل E. القولونية سابقا9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

تعمل جسيمات البروتين النانوية ذاتية التجميع (SAPNs) كشاشات مستضد متكررة ويمكن استخدامها لتطوير مجموعة واسعة من اللقاحات لمختلف الأمراض المعدية. في هذه المقالة نقوم بتوضيح طريقة لإنتاج نواة SAPN تحتوي على تجميع حزمة سداسية الحلزون (SHB) قادرة على تقديم مستضدات في مطابقة تريفيريك. نحن نصف التعبير عن SHB-SAPN في نظام القولونية E. ، فضلا عن خطوات تنقية البروتين اللازمة. أدرجنا خطوة غسل إيزوبروبانول للحد من الليبوبوليساكاريد البكتيري المتبقية. وكمؤشر على هوية البروتين ونقاءه، تفاعل البروتين مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المعروفة في تحليلات اللطخة الغربية. وبعد إعادة الطي، انخفض حجم الجسيمات في النطاق المتوقع (20 إلى 100 نانومتر)، وهو ما تأكد من خلال تشتت الضوء الديناميكي، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية، والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. ومع ذلك، فإن المنهجية الموصوفة هنا هي الأمثل بالنسبة لـ SHB-SAPN، مع إدخال تعديلات طفيفة فقط عليها. كما يمكن نقل هذه الطريقة بسهولة إلى الإنتاج على نطاق واسع لتصنيع GMP لللقاحات البشرية.

تم بناء SHB-SAPN المجمعة بالكامل الموضحة هنا على تسلسلات البروتين (الشكل1A)التي من المتوقع أن تطوي إلى جسيمات تحتوي على 60 نسخة من المونومر (الشكل1B). ويقدم الشكل 2 الخطوط العريضة لطريقة إنتاج وتنقية وتحديد نواة SHB-SAPN. E. القولونية من مخزون الجلسرين التي تحتوي على ناقلات التعبير pPep-T مع تسلسل جيني من جوهر SHB-SAPN تم حثها في BL21 (DE3) E. القولونية. نمت الخلايا البكتيرية بنجاح وتحلل تحت denaturing والحد من الظروف.
تم استخدام مجموع خلايا lysate لتنقية مونومرات SHB-SAPN من قبل FPLC باستخدام عمود Ni2+ (الشكل3A). وكروماتوغراف FPLC يوضح أن البروتين eluted على حد سواء في 150 mM و 500 mM إيميدازول (الشكل3A). كما يظهر الكروماتوغرام قمتين آخرين في 185 مل و 210 مل الحجم الإجمالي المقابل لغسل isopropanol وغسل خالية من إيميدازول، على التوالي. تم تحديد الكسور ونقاء البروتين المؤتلف بواسطة المواد الهلامية SDS-PAGE المتدرجة (الشكل3B). وكان البروتين موضع الاهتمام يقع في المقام الأول في الكسور 68\u201279 (278\u2012300 حجم إجمالي مل). وقد تم الجمع بين هذه الكسور لإجراء مزيد من التحليلات. اللطخة الغربية مع الأجسام المضادة له (N-المحطة الطرفية) و 167-D-IV الأجسام المضادة (C-تيرمينوس) أشار إلى أن الكسور المجمعة كانت في الواقع البروتين من الفائدة (الشكل4A، B). كما أظهرت هذه البقع وجود متعددات الـ SHB-SAPN. كانت الإذاة المنقالة السابقة وكسور الإنعلاث تميل إلى احتواء تركيز أعلى من البروتين متعدد المُميّز، وبالتالي تم استبعادها.
تم طي العينات التي تحتوي على مونومرات البروتين ذات الاهتمام في SHB-SAPN تجميعها بالكامل عن طريق غسيل الكلى. تم تحديد توزيع حجم الجسيمات من قبل DLS وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (الشكل5A،B). وحدد DLS الجسيمات التي يبلغ قطرها الهيدروديناميكي Z-المتوسط 67 نانومتر، بينما يقيس نظام NTA متوسط حجم 81 نانومتر. وكانت الاختلافات طفيفة في الحجم بسبب تقنيات تغيير حجم الجسيمات، ولكن حجم من كلا التحليلين كانت فيالنطاق المتوقع من 20\u2012100 نانومتر 8،24،25. وقد تصورت الشبكات الصحية المضادة للتلوث SHB-SAP من قبل TEM وأظهرت الصور جزيئات فردية جيدة التشكيل مع توزيع الحجم الذي تم الحصول عليه من تقنيات تغيير حجم الجسيمات اثنين (الشكل5C).
أثناء تنقية البروتين، تم غسل العمود مع إيزوبروبانول لتقليل التلوث LPS في المنتج النهائي SHB-SAPN. وللتحقق مما إذا كان مستوى الإندوتوكسين مقبولاً للتحصين، فإن تركيز LPS في عينات SHB-SAPN المنقية مع أو بدون خطوة غسل الإيزوبروبانول تم تحديده من خلال فحص لال حركي. وأشارت النتائج إلى أن غسل الإيزوبروبانول خفض مستويات الإندوتوكسين من > 0.25 EU/μg إلى0.010 EU/μg من بروتين SHB-SAPN (الجدول 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> الشكل 1: تسلسل البروتين وبنيته. (أ) تسلسل الأحماض الأمينية من مونومر SHB-SAPN. (ب) نموذج الكمبيوتر لهيكل الأساسية SHB-SAPN تجميعها بالكامل تتكون من 60 مونومرات البروتين. نظام الألوان لتسلسل الأحماض الأمينية: رمادي = HisTag; الأخضر = خماسي؛ الأزرق الداكن = دي نوفو مصممة الانتهازي؛ أزرق فاتح = حزمة سداسية الحلزون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> الشكل 2: المخطط الانسيابي لـ بروتوكول لإنتاج SHB-SAPN. نظام الألوان: أسود = تعبير مونومر البروتين في E. القولونية; الرمادي الداكن = تنقية مونومر؛ رمادي متوسط = تحديد مونومر؛ الرمادي الفاتح = إعادة الطي والتوصيف؛ أبيض = مجمعة بالكامل SHB-SAPN المنتج. في الخطوات المسماة مع الرمادي الداكن والمتوسط، والبروتين هو تحت denaturing والحد من الظروف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> الشكل 3: تنقية البروتين من مونومرات SHB-SAPN. (أ) كروماتوغراف من تنقية FPLC. يشير الخط الأخضر فوق الرسم البياني اللوني إلى خطوات التنقية. يمثل الخط الأزرق في الرسم البياني اللوني الكثافة البصرية للكسور عند الطول الموجي 280 نانومتر. يظهر الخط الأسود ما في المئة من العازلة B (8 M اليوريا، 20 MM تريس، 50 مل فوسفات الصوديوم أحادي ة، 5 MM TCEP، 500 MM إيميدازول، درجة الحموضة 8.5) التي استخدمت في كل مرحلة من مراحل التنقية. (B) SDS-PAGE هلام من الكسور المجمعة من lysate (L)، وتدفق من خلال (FT)، وغسل الأولى (W1)، غسل isopropanol (W2)، وغسل الثالث (W3)، والكسور الفردية من 150 mM imidazole (E150) و 500 mM imidazole (E500) خطوات الإلتاءب من تنقيه. العلامات الجزيئية في الممر الأول (M) تحديد العصابات بين 10 و 250 كيلودا. يشار إلى البروتين الهدف بواسطة سهم أسود. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> الشكل 4: تحديد البروتين بواسطة اللطخة الغربية. يتم تحميل جميع الممرات مع 100 نانوغرام من البروتين. (أ) نتائج وصمة عار الغربية مع المضادة ل6X HisTag. (ب) نتائج وصمة عار الغربية مع 167-D-IV فيروس نقص المناعة البشرية-1 الأجسام المضادة أحادية النسيلة. وتوصف الممرات على النحو: M = علامة الوزن الجزيئي; 1 = lysate; 2 = تدفق من خلال; 3 = غسل الأول؛ 4 = غسل إيزوبروبانول (غسل الثاني)؛ 5 = غسل الثالث؛ 6 = كسور حجم مجمعة 56\u201261 (ذروة الإلتبيلة الأولى)، 7 = فصائل وحدة التخزين المجمعة 62\u201267 (بين القمتين)، 8 = كسور حجم مجمعة 68\u201278 (ذروة الإلتبيلة الثانية). البروتين المستهدف مع حجم النطاق المتوقع من 18.07 كيلودا كما يشار إلى الفرقة SHB-SAPN أحادية اللون بواسطة سهم أسود. النطاقات الإضافية في الممرات 7 و 8 هي الخافتة، والانتهازي، ومتعددة من SHB-SAPN (السهم الأحمر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> الشكل 5: توصيف SHB-SAPN المعاد طيه. (A). توزيع حجم الجسيمات على النحو الذي تحدده DLS. (ب) حجم الجسيمات كما يحددها تتبع الجسيمات النانوية (النظام). (C) التصور من جزيئات SHB-SAPN من قبل TEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>عينه</td>
			<td>إندوتوكسين (الاتحاد الأوروبي / مل)</td>
			<td>إندوتوكسين (الاتحاد الأوروبي / ميكروغرام من البروتين)</td>
		</tr>
<tr>
<td>سابن مع غسول إيزوبروبانول</td>
			<td>2.02</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>سابن بدون غسول إيزوبروبانول</td>
			<td>> 50</td>
			<td>>0.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>التحكم السلبي</td>
			<td>تحت مستوى الكشف</td>
			<td>غير مأبو</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: مستويات التكسينات الإندوتكسمنة من شبكات SHB-SAPN المعاد طيها. مستويات الإندوتوكسين في عينات SHB-SAPN المنقية مع أو بدون غسل إيزوبروبانول المقدمة على حد سواء كوحدات endotoxin / وحدات الإندوتوكسين / ميكروغرام من بروتين SHB-SAPN.

Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

وترد هنا طريقة مفصلة تصف تنقية الجسيمات النانوية البروتينية ذاتية التجميع (SAPNs) وإعادة طيها وتوصيفها لاستخدامها في تطوير اللقاحات.

إنتاج E.القولونية - أعرب الذاتي تجميع البروتين الجسيمات النانوية لللقاحات التي تتطلب عرض الإبإبيلة الانتهازية

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

يمكن استخدام الجسيمات النانوية البروتينية ذاتية التجميع، أو SAPNs، لتطوير لقاحات ضد الأمراض المعدية المختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة التي وصفناها هنا لتنقية، إعادة مضاعفة، وتوصيف SAPNs تحتوي على حزمة سداسية الستة. يمكن لهذه الجسيمات النانوية تقديم مستضدات ثلاثية الميرك في شكل يشبه الأصلي.مع تعديلات طفيفة، يمكن تطبيق هذه الطريقة على غيرها من الأساليب المبتكرة لقاح SAPN. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون من السهل نقلها إلى الإنتاج على نطاق واسع للتجارب السريرية. لتحلل من حصاد E.coli التعبير عن حزمة ستة الحلزون SAPN، استخدم مسبار مع إخراج سونيكيشن من 150 واط مع أربع ثوان من sonication وست ثوان من الراحة، ل sonicate الكريات البكتيرية resuspended في 40 ملليلتر من العازلة إيميدازول خالية على الجليد لمدة خمس دقائق.الطرد المركزي الخلوية لتوليد sunatant أوضح ونقل فائقة إلى قارورة عقيمة 150 ملليلتر. ثم، إحضار العينة تصل إلى حجم النهائي من 100 ملليلتر مع عازلة خالية من imidazole جديدة. لعزل البروتين من الفائدة، افتح برنامج FPLC وانقر فوق الخيار طريقة جديدة.في القائمة إعدادات الأسلوب، افتح القائمة المنسدلة موضع العمود وحدد منفذ C1 3. في القائمة المنسدلة "إظهار بواسطة التقنية"، حدد التقارب. في القائمة المنسدلة نوع العمود، حدد الآخرين، HisTrap HP، وخمسة ملليلترات.سيتم تعيين حجم العمود ومربع الضغط تلقائياً إلى القيم المناسبة. انقر فوق مخطط الأسلوب واسحب أزرار "الإكسال" و"تطبيق العينة" وأزرار "غسل الأعمدة" الثلاثة وزر Elution من القائمة المنبثقة "مكتبة المرحلة" بجوار السهم قبل إغلاق القائمة "مكتبة المرحلة". انقر فوق "توازن" وتعيين القيم المسرودة في الجدول إلى "المخزن المؤقت الأولي" B، 4٪ المخزن المؤقت النهائي B، 4٪ و وحدة تخزين الأعمدة، خمسة.انقر فوق نموذج التطبيق. في المربع تحميل العينة، انقر فوق الزر الخيار لحقن عينة على عمود مع مضخة العينة، وتأكد من أن المربع الموجود بجوار معدل تدفق الاستخدام من إعدادات الأسلوب يتم تحديد في المربع حقن العينة باستخدام مضخة النظام. تغيير قيمة مربع وحدة التخزين إلى 100 ملليلتر، ونظام مجموعة الكسور إلى تمكين.Unclick استخدام حجم الكسور من إعدادات الأسلوب مربع ثم تغيير حجم الكسر إلى أربعة ملليلتر. انقر على زر غسل العمود الأول، تعيين القيم المدرجة في الجدول إلى المؤقت الأولي B، 4٪ المخزن المؤقت النهائي B، 4٪ وحجم العمود، 10. انقر فوق مربع تمكين نظام مجموعة الكسور ثم unclick ضغط استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب.تغيير حجم الكسر إلى أربعة ملليلتر، وانقر فوق الزر "غسل العمود" الثاني. تعيين القيم في الجدول إلى "المخزن المؤقت" الأولي B، 0٪ المخزن المؤقت النهائي B، 0٪ و وحدة تخزين الأعمدة، خمسة. انقر فوق مربع تمكين نظام مجموعة الكسور ثم unclick ضغط استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب.تغيير حجم الكسر إلى أربعة ملليلتر ثم انقر فوق الزر "غسل العمود" الثالث. تعيين القيم في الجدول إلى "المخزن المؤقت" الأولي B، 0٪ المخزن المؤقت النهائي B، 0٪ وحدة تخزين الأعمدة، 10. انقر فوق الزر تمكين نظام مجموعة الكسور ثم unclick ضغط استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب مربع.ثم قم بتغيير حجم الكسر إلى أربعة ملليلتر. انقر فوق الزر Elution وانقر بزر الماوس الأيمن فوق المعلومات في الجدول. في القائمة المنبثقة، انقر فوق حذف الخطوة واسحب الزر التدرج متساوي الراسمي إلى الجدول مرتين، بحيث يكون هناك إدخالين.تعيين قيمة الإدخال الأول إلى "المخزن المؤقت الأولي" B، 30٪ المخزن المؤقت النهائي B، 30٪ و وحدة تخزين الأعمدة، 10. تعيين قيمة الإدخال الثاني إلى B المخزن المؤقت الأولي، 100٪ المخزن المؤقت النهائي B، 100٪ و وحدة تخزين الأعمدة، 10. انقر فوق الزر تمكين نظام مجموعة الكسور ثم انقر فوق المربع استخدام حجم الكسر من إعدادات الأسلوب.ثم انقر فوق حفظ باسم وتسمية تنقية الملف. ضع المضخة A أنابيب FPLC في عازلة الغسيل الخالية من imidazole ، والمضخة B أنابيب في العازلة إيميدازول 500 ملليمولار. ضع أنابيب مضخة العينة في عينة 100 ملليلتر وادير برنامج التنقية.عندما يكون هناك حاجة إلى 60٪ غسل isopropanol، وقفة البرنامج، ونقل مضخة أنابيب من غسل imidazole خالية في غسل isopropanol 60٪، وإعادة تشغيل البرنامج. في نهاية الغسيل، وقفة البرنامج مرة أخرى، والعودة إلى أنابيب مضخة A إلى العازلة غسل imidazole خالية، وإعادة تشغيل برنامج تنقية. لتقييم نقاء البروتين النقي ، قم أولاً بدمج الكسور من التدفق ، وغسل واحد ، وغسل اثنين ، وغسل ثلاث خطوات ، في أنابيب مخروطية فردية 50 ملليلتر.المقبل, مزيج 15 ميكرولترات من كل أنبوب عينة مع 15 ميكرولترات من 2X Laemmli العازلة في أنابيب الفردية 0.5 ملليلتر microcentrifuge وdenature العينات في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة، اقامة هلام تشغيل الجهاز مع ثلاثة وصمة عار خالية من أربعة إلى 20٪ precast polyacrylamide المواد الهلاميد في Tris-Glycine SDS-PAGE تشغيل المخزن المؤقت. تحميل ثمانية ميكرولترات من علامة الوزن الجزيئي إلى البئر الأولى من كل هلام و 30 ميكرولترات من عينة التشويه إلى الآبار الأخرى.تشغيل المواد الهلامية في 200 فولت حتى الجبهة صبغ يضرب الجزء السفلي من هلام وشطف لفترة وجيزة المواد الهلامية مع المياه غير المؤينة قبل التصوير على الفور مع نظام التصوير خالية من وصمة عار. ثم، تحديد الكسور التي تحتوي على نطاقات البروتين مع الحجم الصحيح وتجمع هذه الكسور. لمدة ستة الحلزون حزمة SAPN إعادة التكتل، إضافة 10 إلى 20 ملليلتر من البروتين المجمع إلى 10 كيلودالتون الجزيئية الوزن قطع غسيل الكلى كاسيت.Dialyze كاسيت في ثمانية اليوريا الضرس, 20-ملليمولار تريس, 5٪ الجلسرين, وخمسة ملليمتر TCEP في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، تقليل تركيز اليوريا في عازلة غسيل الكلى متدرجة من قبل اثنين من الضرس كل ساعتين لـ تزد ببطء اليوريا قبالة العينة. عندما يصل تركيز اليوريا إلى اثنين من الضرس ، فانقل جهاز غسيل الكلى إلى أربع درجات مئوية واتى العينة إلى 120 ملليمولار يوريا ، وتريات 20 ملليمولار ، و 5 ٪ من الجلسرين بين عشية وضحاها لإنهاء إعادة الدمج.في صباح اليوم التالي، قم بإزالة البروتين الذي أعيد طيه من الكاسيت وتصفية حزمة الستة الحلزونية SAPN من خلال فلتر حقنة فلوريد فلوريد 0.22 ميكرومتر. لقياس حجم الجسيمات المتوسطة من حزمة ستة الحلزون SAPN، إضافة 45 ميكرولترات من حزمة ستة الحلزون SAPN إلى cuvette المتاح ووضع cuvette في آلة DLS. بعد ذلك، إنشاء ملف قياس جديد وتشغيل إجراء التشغيل القياسية المكتوبة مسبقا للبروتين في 120 ملليمولار يوريا، 20 ملليمولار تريس، و 5٪ عازلة الجلسرين في 25 درجة مئوية.ثم، بدء القياس. سيتم حساب حجم متوسط Z PDI ونتائج التوزيع لكل تشغيل. الآلة ستقرأ العينة خمس مراتبنيت هذه حزمة ستة الحلزون تجميعها بالكامل SAPN على تسلسل البروتين التي من المتوقع أن أضعاف في الجسيمات التي تحتوي على 60 نسخة من مونومر. تم استخدام الخلية الإجمالية لتنقية أحادية حزمة ستة حلزونية SAPN بواسطة FPLC باستخدام عمود النيكل ، مما يدل على أن البروتين مُلَح في كل من 150 و 500 ملليمولار إيميدازول. كما يُظهر الكروماتوغرام قمتين أخريين عند 185 و210 ملليلترات إجمالي حجم مقابل غسل الأيزوبروبانول والغسيل الخالي من الإيميدازول على التوالي.ويمكن تحديد الكسور ونقاء البروتين المؤتلف من قبل التدرج SDS-PAGE المواد الهلامية مع البروتين من الفائدة تقع أساسا في جزء 68 إلى 79. أشار تحليل البقعة الغربية مع الأجسام المضادة المضادة له ومكافحة 167D4 إلى أن الكسور المجمعة كانت في الواقع البروتين من الفائدة. كما أظهرت البقع وجود حزمة ستة الحلزونات SAPN multimers.تم طي العينات التي تحتوي على مونومرات البروتين ذات الأهمية في حزمة الستة الحلزونات المجمعة بالكامل SAPN عن طريق غسيل الكلى وتم تحديد توزيع حجم الجسيمات من قبل تحليل تتبع DLS والجسيمات النانوية. كشف التصور عن طريق المجهر الإلكتروني انتقال شكلت بشكل جيد الفردية ستة الحلزون حزمة الجسيمات SAPN مع توزيع الحجم التي تم الحصول عليها من تقنيات التحجيم الجسيمات اثنين. الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو إعادة إليها حزمة ستة الحلزون SAPN.إن درجة الـ PH و القوة الأيونية الصحيحة للمخزن المؤقت لإعادة التكفّل أمران أساسيان. باستخدام غسل الأيزوبروبانول أثناء التنقية، تمكنا من تقليل LPS الملوثة إلى مستوى منخفض للغاية. ومع ذلك، يمكن تقليل LPS أكثر باستخدام عمود تبادل أنيون حسب الضرورة.هذه التكنولوجيا يمكن تكييفها بسهولة للتطبيق البشري. وقد تم بالفعل توسيع نطاق SAPN البكتيرية التي تم التعبير عنها من أجل المرحلة القادمة 1/2a الملاريا التجارب السريرية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

الديناميكا الحرارية من البروتين للطي غشاء المقاسة بواسطة التحليل الطيفي الإسفار

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

صياغة النانوية Diblock البوليمر من خلال تقنيات Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

زراعة خلايا العصبية السلف في هيدروجيل 3 الابعاد الذاتي تجميع الببتيد

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

تحليل المستهدفة البروتين الفيروسي النانوية يسلم إلى HER2 + أورام

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

التوافقي النانوية للبحوث التجديدي

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

إنتاج الجسيمات النانوية المعدنية عن طريق نابض بالليزر في الاجتثاث في السوائل: أداة لدراسة خصائص مضادة للجراثيم من الجسيمات النانوية

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

بروتوكول عام للاستفادة المثلى إنتاج البروتين مغايرة باستخدام تقنية ميكروبيوريكتور الآلي

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

الروغان السطحية من جسيمات نانوية فيروس التهاب الكبد الوبائي ه استخدام أساليب تصريف المواد الكيميائية

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

إنتاج بروتين الايلاستين مثل الهلاميات المائية للتغليف وإيمونوستينينج من الخلايا في 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...