Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en samarbejdsaftale (W81XWH-11-2-0174) mellem Henry M Jackson Foundation til fremme af militær medicin, Inc., og det amerikanske forsvarsministerium. Anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV-antistoffet blev modtaget fra Dr. Susan Zolla-Pazner gennem NIH AIDS-reagens programmet.

<ol>
	<li>Karch, C. P., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+technologies:+From+whole+organisms+to+rationally+designed+protein+assemblies.">Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies.</a> Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).</li><li>Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Immunologic+Properties+of+Soluble+Versus+Particulate+Antigens.">Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens.</a> Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).</li><li>Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+basis+for+enhanced+immunity+of+nanoparticle+vaccines.">Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).</li><li>Yeates, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Principles+for+Designing+Highly+Symmetric+Self-Assembling+Protein+Nanomaterials.">Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).</li><li>Marcandalli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Potent+Neutralizing+Antibody+Responses+by+a+Designed+Protein+Nanoparticle+Vaccine+for+Respiratory+Syncytial+Virus.">Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus.</a> Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decorating+Self-Assembled+Peptide+Cages+with+Proteins.">Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins.</a> ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).</li><li>Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembling+Protein+Nanoparticles:+implications+for+HIV-1+vaccine+development.">Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development.</a> Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).</li><li>Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+design+of+peptides+that+self-assemble+into+regular+polyhedral+nanoparticles).">Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles).</a> Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+displaying+HIV-1+Env+V1V2+loop+in+a+native-like+trimeric+conformation+as+vaccine+antigen.">Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen.</a> Nanomedicine. , (2018).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+P.+falciparum+specific+coiled-coil+domain+to+construct+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+to+prevent+malaria.">The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-adjuvanted+nanoparticle+based+vaccine+against+infectious+bronchitis+virus.">A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus.</a> PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).</li><li>Wahome, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+display+of+4E10+and+2F5+epitopes+on+self-assembling+protein+nanoparticles+as+a+potential+HIV+vaccine.">Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+novel+immunogenic+nanoparticle+platform+for+Toxoplasma+peptide+vaccine+in+HLA+transgenic+mice.">Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice.</a> Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonadjuvanted+polypeptide+nanoparticle+vaccine+confers+long-lasting+protection+against+rodent+malaria.">A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria.</a> Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibody+and+CD8++T-cell+responses+to+the+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+protein+induced+by+a+nanoparticle+vaccine.">Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine.</a> PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).</li><li>Seth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+targeting+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+delivered+in+three+Army+Liposome+Formulation+adjuvants.">Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants.</a> Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+nanoparticles+with+built-in+flagellin+domains+increases+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+falciparum+based+vaccine.">Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine.</a> Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanovaccine+confers+robust+immunity+against+Toxoplasma.">Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma.</a> NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+self-adjuvanted+protein+nanoparticles+provides+protection+against+lethal+influenza+challenge.">Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge.</a> Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).</li><li>Haynes, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-correlates+analysis+of+an+HIV-1+vaccine+efficacy+trial.">Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial.</a> New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).</li><li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand.">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).</li><li>O&#39; Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+gp120+V1V2+loop:+structure,+function+and+importance+for+vaccine+development.">The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development.</a> Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).</li><li>Babapoor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Vaccine+Using+Nanoparticle+Platform+to+Present+Immunogenic+M2e+against+Avian+Influenza+Infection.">A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection.</a> Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).</li><li>Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+self-assembling+protein+nanoparticle+architectures+for+applications+in+vaccine+design.">Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design.</a> Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).</li><li>Indelicato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+Governing+the+Self-Assembly+of+Coiled-Coil+Protein+Nanoparticles.">Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles.</a> Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).</li><li>Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+assemblies+and+their+biomedical+applications.">Nanoscale assemblies and their biomedical applications.</a> Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).</li><li>Rey, F. A., Lok, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Features+of+Enveloped+Viruses+and+Implications+for+Immunogen+Design+for+Next-Generation+Vaccines.">Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines.</a> Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Endotoxins.">Bacterial Endotoxins.</a> United States Pharmacopeia (USP). , (2011).</li><li>. Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/media/76255/download">https://www.fda.gov/media/76255/download</a> (1993)</li></ol>

De udtrykte synspunkter er forfatternes og bør ikke opfattes som værende udtryk for den amerikanske hærs eller forsvarsministeriets holdninger. Peter Burkhard har en interesse i selskabet kaldet Alpha-O Peptides AG og har patenter på teknologien. De andre forfattere har intet tilhørsforhold eller økonomisk engagement med nogen virksomhed med en finansiel interesse i det emne, der præsenteres i dette dokument.

Nanoteknologi giver mange fordele og løsninger for udvikling af under enheds vaccine. Nanovaccines kan gentagne gange præsentere antigener som partikler til værts immunsystemet stigende immunogenicitet26. Mens der er mange forskellige typer af Nanovaccines, vi mener, at dem, der består af de Novo designet protein synes at være den stærkeste tilgang til vaccine udvikling1. De kan konstrueres uden nogen sekvenshomologi til værten proteiner og præsentere antigenet af interesse i tæt på indfødte-lignende kropsbygning samtidig give lave produktionsomkostninger og høje produkt udbytter. Et glimrende eksempel på denne fremgangsmåde er SAPN-teknologien, som vi har anvendt på vacciner mod flere smitsomme sygdomme7. Håndtering af vanskelighederne i HIV-1 vaccine udvikling, har vi konstrueret en unik SHB-SAPN kerne til effektivt at præsentere V1V2 antigen i en indfødt-lignende trimert kropsbygning9. Mange vaccine mål, især for virussygdomme, er til stede som trimere27. Dette fænomen indikerer, at vores sapn-design har store konsekvenser for udviklingen af underenhed vacciner.
I denne metode demonstrerer vi, hvordan man producerer SHB-SAPNs i et E. coli -udtryks system. Vi udtrykte høje udbytter af protein (ca. 6 mg/100 mL kultur). Proteinet indeholdt 10 histidiner og blev let renset ved hjælp af en immobiliseret metalaffinitets kromatografi med ni2 + kolonne. Denne længde af hans-tag blev fundet at være den optimale for den højeste proteinudbytte. Det rensede protein indeholdt den fulde længde af det designede protein, som indikeret ved tilstedeværelsen af både N-terminal HisTag og C-terminalen heptad REPEAT. Vi udnyttede bredt accepterede teknikker og optimeret dem til udtryk, produktion og karakterisering af SHB-SAPN kerne. Manglende produktion af fuld længde protein under udviklingen af en sapn indeholdende en ny protein epitop kunne indikere et udtryk problem med genet i værtscellen. Hvis det sker, skal genet og udtryks systemet redesignet og tilpasses til den beskrevne protokol. Ændring af sonikering tid eller intensitet kan også øge koncentrationen af den forventede fuld længde protein.
Refoldede partikler var i det forventede størrelsesinterval (20 til 100 nm)8,24,25 som bestemt af DLS og nanopartikel tracking analyse. Disse resultater blev yderligere bekræftet ved anvendelse af TEM. Hvis der er problemer i dette trin, er det normalt på grund af et problem med pH eller ionisk styrke af refolding buffer. Når store størrelse partikler detekteres på partikel størrelses teknikker, det indikerer aggregering, som kan undgås ved at øge pH af refolding buffer. Hvis partiklerne ikke detekteres af DLS, kontrollere koncentrationen af proteinet og kontrollere pH af bufferen. Den endelige proteinkoncentration for DLS bør være mindst 100 μg/mL. Hvis koncentrationen ikke er problemet, indikerer det overflod af små, ufuldstændigt dannede partikler, hvis koncentration kan reduceres ved at sænke pH. Alternativt kan natriumklorid koncentrationen justeres til det optimale område for at minimere tilstedeværelsen af partikler med uønsket størrelse.
Endelig, ved hjælp af en isopropanol vask trin under rensning var vi i stand til at reducere kontaminerende LPS fra værten E. coli til 0,01 EU/ΜG sapn, som er under Food and Drug Administration (FDA) grænse på 5 EU/kg legemsvægt for injicerbare produkter 28. dette niveau kan reduceres yderligere ved hjælp af en anion-udvekslings kolonne, også kendt som Q-kolonne. Hvis der stadig er høje niveauer af endotoksin, bør du kontrollere alle materialer, som blev brugt til buffer fremstilling. Husk at bruge kun depyrogenated glas og endotoksin gratis plasticware i denne metode.
Disse resultater indikerer, at vi med succes har udviklet en metode til at producere SHB-SAPN kerne, der kan anvendes til prækliniske immuniserings undersøgelser. Denne metode med kun små ændringer, hvis nogen, kan anvendes til rensning af SHB-SAPNs, når et antigen af interesse tilsættes. Ved hjælp af denne metode som udgangspunkt er en af de store ændringer i elueringstrinnet. Forskellige proteiner elueret ved forskellige imidazolkoncentrationer, der skal bestemmes eksperimentelt. Den anden store forskel kan være sammensætningen af den genfoldnings buffer. Optimering ville kræve afprøvning af forskellige pH-forhold samt Ioniske styrker.
I betragtning af det fremtidige arbejde er der kun behov for to små ændringer for at tillade anvendelse af SHB-SAPN på mennesker. Den første er, at udtrykket vektor skal ændres til en kanamycin resistens valgbar markør på grund af ampicillin allergi i mennesker29. Det andet store krav til protein fremstilling til human brug er at fremstille SHB-SAPN i animalske produkt frie medier. En undersøgelse i mindre målestok viste allerede et rimeligt udbytte af protein i et plantebaseret medie. Det arbejde, der præsenteres her, er let skalerbar til ultimativ GMP-produktion som demonstreret med en malariavaccine kandidat, FMP01416. Denne store FMP014-SAPN-produktion omfattede både anionbytningen og kation udvekslings trinnene for yderligere at reducere LPS-og ni2 + -indholdet fra det endelige produkt. Denne bakterielle-udtrykte SAPN er allerede blevet opskaleret til et kommende fase 1/2A klinisk forsøg.

Mens den traditionelle vaccine udvikling har fokuseret på de inaktiverede eller svækkede patogener, er fokus for moderne vacciner flyttet mod underenhed vacciner1. Denne tilgang kan føre til en mere målrettet respons, og potentielt mere effektive vaccinekandidater. En af de største ulemper er imidlertid, at under enheds vacciner ikke er partikler som hele organismer, hvilket kan resultere i nedsat immunogenicitet2. En nanopartikel som et gentaget antigen display system kan have fordelene ved både den målrettede underenhed vaccine tilgang samt partikel karakter af hele organismen1,3.
Blandt de eksisterende typer af nanovacciner giver rationelt designede protein samlinger mulighed for udformning og udvikling af vaccinekandidater, der kan præsentere flere eksemplarer af antigen potentielt i en indfødt-lignende kropsbygning1,4 ,5,6. Et eksempel på disse protein samlinger er de selvsamlende protein nanopartikler (SAPNs)7. SAPNs er baseret på coiled-Coil domæner og er traditionelt udtrykt i Escherichia coli8. Sapn vaccinekandidater er blevet udviklet til en række forskellige sygdomme som malaria, SARS, influenza, Toxoplasmose, og HIV-19,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. hver sapn-kandidats udformning er specifik for det patogen, der er interesse, men produktions-, rensnings-og refoldnings teknikken er generelt alment anvendelig.
En af vores nuværende interesser er en effektiv HIV-1 vaccine. I RV144 — det eneste kliniske fase III-forsøg med en hiv 1-vaccine, der udviste beskeden effekt — var den reducerede infektionsrisiko korreleret med IgG-antistoffer mod V1V2-løkken i konvolut proteinet20,21. Den indfødte-lignende trikemeje præsentation af denne region menes at være vigtigt for beskyttende immunogenicitet22. For at præsentere V1V2 loop i så tæt på Native-lignende konstellation som muligt, vi udviklet et bevis på princippet SAPN vaccinekandidat, der indeholdt HIV-1 konvolut post-fusion Six-Helix Bundle (SHB) at præsentere V1V2 loop i den korrekte kropsbygning9 . Denne kandidat blev anerkendt af kendte monoklonale antistoffer mod HIV-1 konvolut protein. Mus immuniseret med V1V2-SHB-sapn rejst V1V2 specifikke antistoffer, at, vigtigst, bundet til gp70 V1V2, den korrekte konformationelle epitoper9. SHB-SAPN kernen kunne have andre funktioner ud over rollen som en bærer til HIV-1 V1V2 loop. Her beskriver vi en detaljeret metode til ekspression, oprensning, genfoldning og validering af SHB-SAPN kernen. Sekvens valget, nanoparti design, Molekylær kloning og omdannelse af E. coli er tidligere beskrevet9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

Selvsamlende protein nanopartikler (SAPNs) fungerer som gentagne antigen displays og kan bruges til at udvikle en bred vifte af vacciner til forskellige smitsomme sygdomme. I denne artikel viser vi en metode til at producere en SAPN kerne, der indeholder en seks-Helix Bundle (SHB) samling, der er i stand til at præsentere antigener i en trimert kropsbygning. Vi beskriver udtrykket af SHB-SAPN i et E. coli -system, samt de nødvendige protein rensning trin. Vi inkluderede et isopropanol vaske trin for at reducere rest bakterien lipopolysaccharid. Som en indikation af protein identitet og-renhed reagerede proteinet med kendte monoklonale antistoffer i Western blot-analyser. Efter at have refoldet, faldt størrelsen af partiklerne i det forventede interval (20 til 100 nm), som blev bekræftet af dynamisk lysspredning, nanopartikel tracking analyse, og transmission elektronmikroskopi. Den beskrevne metode er optimeret til SHB-SAPN, men med kun små modifikationer kan den anvendes på andre SAPN konstruktioner. Denne metode er også let overføres til storstilet produktion til GMP fremstilling for humane vacciner.

Den fuldt samlede SHB-SAPN vist her er bygget på protein sekvenser (figur 1a), der forventes at folde ind i en partikel, der indeholder 60 kopier af monomer (figur 1b). Figur 2 indeholder en skitse over metoden til produktion, rensning og identifikation af SHB-sapn-kernen. E. coli fra en glycerol bestand, der indeholdt en Ppep-T ekspressions vektor med gensekvens af SHB-sapn-kernen, blev INDUCERET i BL21 (DE3) E. coli. Bakterielle celler blev med succes dyrket og lyseres under Denaturerings-og reduktions betingelser.
Total Cell lysat blev brugt til at rense SHB-sapn monomerer af fplc ved hjælp af en ni2 + kolonne (figur 3a). FPLC-kromatografen viser, at protein elueres både ved 150 mM og 500 mM imidazol (figur 3a). Kromatogrammet viser også to andre toppe ved 185 mL og 210 mL total volumen svarende til isopropanol-vask og imidazolfri vask. Brøkdele og renhed af det rekombinante protein blev identificeret ved gradient SDS-PAGE gels (figur 3b). Det protein af interesse var primært placeret i fraktioner 68 \ u201279 (278 \ u2012300 mL samlede volumen). Disse fraktioner blev kombineret til yderligere analyser. Western blot med anti-antistof (N-terminal) og 167-D-IV antistof (C-Terminus) indikerede, at de poolede fraktioner faktisk var protein af interesse (figur 4a, B). Disse blots også demonstreret tilstedeværelsen af SHB-SAPN multimere. Tidligere vaske og elueringsfraktioner havde en tendens til at indeholde en højere koncentration af multimeriseret protein og blev derfor udelukket.
De prøver, der indeholdt de protein monomerer af interesse blev foldet ind i fuldt samlet SHB-SAPN ved dialyse. Partikelstørrelsesfordelingen blev bestemt af DLS og nanoparti sporings analyse (figur 5a, B). DLS identificerede partikler med en Z-gennemsnitlig Hydrodynamisk diameter på 67 nm, mens NTA-systemet målte en gennemsnitsstørrelse på 81 nm. De små størrelsesforskelle skyldtes partikel størrelses teknikken, men størrelsen fra begge analyser var i det forventede interval på 20 \ u2012100 nm8,24,25. SHB-SAPNs blev visualiseret ved TEM og billederne viste velformede individuelle partikler med størrelsesfordelingen opnået fra de to partikel størrelses teknikker (figur 5c).
Under rensningen af proteinet blev søjlen vasket med isopropanol for at nedsætte LPS-forureningen i det endelige SHB-SAPN-produkt. For at kontrollere, om endotoksin niveauet var acceptabelt til immunisering, blev koncentrationen af LPS i SHB-SAPN-prøver renset med eller uden isopropanol-skylle trinnet bestemt af en kinetisk LAL-analyse. Resultaterne viste, at isopropanol-vasken reducerede endotoksin niveauerne fra > 0,25 EU/μg til 0,010 EU/μg SHB-SAPN-protein (tabel 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> Figur 1: SHB-SAPN protein sekvens og struktur. A) aminosyresekvensen af SHB-sapn monomer. B) computer model for strukturen af den fuldt monterede SHB-sapn-kerne bestående af 60 protein monomerer. Farveskema for aminosyre sekvenser: grå = HisTag; Grøn = pentamer; Mørkeblå = de Novo designet trimer; Lyseblå = Six-Helix bundt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> Figur 2: rutediagram over protokol for SHB-SAPN-produktion. Farveskema: sort = udtryk for protein monomer i E. coli; Mørkegrå = monomer rensning; Medium grå = monomer identifikation; Lysegrå = refolning og karakterisering; Hvid = fuldt samlet SHB-SAPN produkt. I trin mærket med mørk og medium grå, er proteinet under denaturering og reducere forholdene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> Figur 3: protein rensning af SHB-SAPN monomerer. A) kromatograf fra fplc-rensning. Den grønne linje over kromatogrammet angiver rensnings trinene. Blå linje i kromatogrammet repræsenterer den optiske densitet af fraktioner ved 280 nm bølgelængde. Den sorte linje viser, hvilken procentdel af buffer B (8 M urinstof, 20 mM Tris, 50 mM natriumphosphat monobasic, 5 mM TCEP, 500 mM imidazol, pH 8,5), der blev anvendt i hver fase af rensningen. B) SDS-side geler af de samlede fraktioner fra Lysatet (L), gennemstrømning (ft), første vask (w1), isopropanol vask (w2), tredje vask (W3) og individuelle fraktioner fra 150 mm imidazol (E150) og 500 mm imidazol (E500) elueringstrin i Rensning. Molekylære markører i den første vognbane (M) identificerer bånd mellem 10 og 250 kDa. Målprotein er indikeret med en sort pil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> Figur 4: identifikation af proteinet af Western blot. Alle baner er fyldt med 100 ng protein. (A) resultater af en Western blot med anti-6X histag. B) resultater af et Western blot med et 167-D-IV HIV 1-monoklonalt antistof. Banerne er mærket som: M = molekylvægt markør; 1 = lysat; 2 = gennemstrømning; 3 = første vask; 4 = isopropanol vask (anden vask); 5 = tredje vask; 6 = samlede volumen fraktioner 56 \ u201261 (første elueringsspids), 7 = poolede volumen fraktioner 62 \ u201267 (mellem de to toppe), 8 = poolede volumen fraktioner 68 \ u201278 (anden elueringsspids). Målprotein med den forventede bånd størrelse på 18,07 kDa, da det monomeriske SHB-SAPN-bånd er angivet med en sort pil. Ekstra banding i Lanes 7 og 8 er dimere, trimers og multimere af SHB-SAPN (rød pil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> Figur 5: karakterisering af den genfoldede SHB-SAPN. (A). partikelstørrelsesfordeling som bestemt af DLS. (B) partikelstørrelse som bestemt af nanopartikel tracking (system). C) visualisering af SHB-sapn-partiklerne efter tem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Prøve</td>
			<td>Endotoxin (EU/mL)</td>
			<td>Endotoxin (EU/μg protein)</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN med isopropanol vask</td>
			<td>2,02</td>
			<td>0,01</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN uden isopropanol vask</td>
			<td>> 50</td>
			<td>> 0,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Negativ kontrol</td>
			<td>Under detekteringsniveau</td>
			<td>Nielsen</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: endotoksin niveauer af refoldede SHB-SAPNs. Endotoksin i SHB-sapn-prøver, der er renset med eller uden en isopropanol-vask, frembydes både som endotoksin-enheder/ml og endotoksin enheder/μg SHB-sapn-protein.

Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

En detaljeret metode er givet her beskriver rensning, refolkning, og karakterisering af selvsamlende protein nanopartikler (SAPNs) til brug i vaccine udvikling.

Produktion af E. coli-udtrykte selvsamlende protein nanopartikler til vacciner, der kræver Trikemeje Epitope præsentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Selvsamlende protein nanopartikler, eller SAPNs, kan bruges til at udvikle vacciner mod forskellige smitsomme sygdomme. Denne metode, som vi beskriver her, kan bruges til at rense, omfolde og karakterisere SAPN'er, der indeholder en seks-helix bundt. Denne nanopartikel kan præsentere trimeriske antigener i en indfødt-lignende kropsbygning.Med mindre ændringer, denne metode kan anvendes til andre innovative SAPN vaccine konstruktioner. Desuden kan det let overføres til storstilet produktion til kliniske forsøg. For lysis af høstet E.coli udtrykke seks-helix bundt SAPN, bruge en sonde med sonikering output på 150 watt med fire sekunders sonikering og seks sekunders hvile, at sonikere resuspended bakterielle pellets i 40 milliliter imidazol-fri buffer på is i fem minutter.Centrifuge cellulære lysate til at generere en afklaret supernatant og overføre supernatant til en steril 150-milliliter kolbe. Prøven bringes derefter op på et endeligt volumen på 100 milliliter med frisk imidazolfri buffer. Hvis du vil isolere det protein af interesse, skal du åbne FPLC-softwaren og klikke på indstillingen Ny metode.Åbn rullemenuen Kolonneplacering i menuen Metodeindstillinger, og vælg C1 Port 3. Vælg Affinitet i rullemenuen Vist efter teknik. Vælg Andre, HisTrap HP og fem milliliter i rullemenuen Kolonnetype.Søjlevolumen og trykboksene indstilles automatisk til de relevante værdier. Klik på Metodekontur, og træk knapperne Ækvibrering og Eksempelprogram, tre kolonnevaskknapper og knappen Elution fra pop op-menuen Fasebibliotek ud for pilen, før du lukker menuen Fasebibliotek. Klik på Ækvibrering, og angiv de værdier, der er angivet i tabellen, til Startbuffer B, 4%Endelig buffer B, 4 % og Kolonnevolumen, fem.Klik på Eksempelprogram. Klik på alternativknappen for Injicer eksempelprøve på kolonne med eksempelpumpe i feltet Eksempelindlæsning, og bekræft, at feltet ud for Brug flowhastighed fra metodeindstillinger er markeret i feltet Eksempelinjektion med systempumpe. Rediger værdien for feltet Lydstyrke til 100 milliliter og det brøksamlingskema, der skal aktiveres.Unclick feltet Brug brøkstørrelse fra metodeindstillinger, og skift brøkstørrelsen til fire milliliter. Klik på den første kolonnevask-knap, angiv værdierne i tabellen til Initial Buffer B, 4%Final Buffer B, 4% og Kolonnevolumen, 10. Klik på feltet Aktivere for brøksamlingskema, og afklik på brug brøkstørrelse fra metodeindstillinger.Skift brøkstørrelsen til fire milliliter, og klik på den anden kolonnevask.-knap. Angiv værdierne i tabellen til Initial Buffer B, 0%Final Buffer B, 0% og Kolonnevolumen, fem. Klik på feltet Aktivere for brøksamlingskema, og afklik på brug brøkstørrelse fra metodeindstillinger.Skift brøkstørrelsen til fire milliliter, og klik på den tredje kolonnevask. Angiv værdierne i tabellen til Initial Buffer B, 0%Final Buffer B, 0% og Kolonnevolumen, 10. Klik på knappen Aktiver for brøksamling, og klik på feltet Brug brøkstørrelse fra metodeindstillinger.Skift derefter brøkstørrelsen til fire milliliter. Klik på knappen Elution, og højreklik på oplysningerne i tabellen. Klik på Slet trin i pop op-menuen, og træk knappen Isokratisk forløb til tabellen to gange, så der er to poster.Angiv værdien for den første post til Initial Buffer B, 30%Final Buffer B, 30% og Kolonnevolumen, 10. Angiv værdien for den anden post til Initial Buffer B, 100%Final Buffer B, 100% og Kolonnevolumen, 10. Klik på knappen Aktivere til brøksamlingskema, og klik på feltet Brug brøkstørrelse fra metodeindstillinger.Klik derefter på Gem som, og navn på filrensningen. Pumpen En slange af FPLC i den imidazolfri vaskebuffer og pumpen B-slangen ind i 500-millimolar imidazolbufferen. Prøvepumpeslangen anbringes i prøven på 100 milliliter, og rensningsprogrammet køres.Når 60% isopropanol vask er nødvendig, pause programmet, flytte pumpen En slange fra imidazol-fri vask i 60% isopropanol vask, og genstarte programmet. I slutningen af vasken, pause programmet igen, returnere pumpen A slanger til imidazol-fri vask buffer, og genstarte rensningsprogrammet. For at vurdere renheden af det rensede protein, først kombinere fraktioner fra strømmen gennem, vask en, vask to, og vask tre trin, i individuelle 50-milliliter koniske rør.Derefter blandes 15 mikroliter fra hvert prøverør med 15 mikroliter 2X Laemmli buffer i individuelle 0,5 milliliter mikrocentrifugerør og protese prøverne ved 95 grader Celsius i 10 minutter. Ved inkubationens afslutning skal der oprettes et gel kørende apparat med tre pletfri fire til 20% præfabrikerede polyarylamidgeler i Tris-Glycine SDS-PAGE løbebuffer. Læg otte mikroliter af molekylvægtmarkør til den første brønd af hver gel og 30 mikroliter denatureret prøve til de andre brønde.Kør gelerne ved 200 volt, indtil farvestoffet foran rammer bunden af gelen og kort skylle gelerne med deioniseret vand, før straks billeddannelse med en plet-fri billeddannelse system. Derefter identificere de fraktioner, der indeholder proteinbånd med den korrekte størrelse og pool disse fraktioner. For seks-helix bundt SAPN genfoldning, tilføje 10 til 20 milliliter poolet protein til en 10 kilodalton molekylvægt cut-off dialyse kassette.Dialyze kassetten i otte molar urea, 20-millimolar Tris, 5% glycerol, og fem-millimolar TCEP ved stuetemperatur natten over. Næste morgen nedsættes urinstofkoncentrationen i dialysebufferen trinvist med to molar hver anden time for langsomt at dialysere urinstofet fra prøven. Når urinstofkoncentrationen når to molar, flyttes dialyseapparatet til fire grader Celsius og dialysere prøven i 120 millimolarurea, 20-millimolar Tris og 5% glycerol natten over for at afslutte genfoldingen.Den næste morgen, fjerne den genfoldede protein fra kassetten og filtrere seks-helix bundt SAPN gennem en 0,22-mikrometer polyvinylidene fluorid sprøjte filter. For at måle den gennemsnitlige partikelstørrelse af seks-helix bundt SAPN, tilføje 45 mikroliter af seks-helix bundt SAPN til en engangs cuvette og placere cuvette i DLS maskinen. Dernæst skal du oprette en ny målefil og køre en forudskrevet standard procedure for protein i 120-millimolar urea, 20-millimolar Tris, og 5% glycerol buffer ved 25 grader Celsius.Start derefter målingen. Z-gennemsnitsstørrelsen, PDI og fordelingsresultaterne beregnes for hver kørsel. Maskinen aflæser prøven fem gange.Denne fuldt samlede seks-helix bundt SAPN er bygget på protein sekvenser, der forventes at folde ind i en partikel, der indeholder 60 kopier af monomer. Totalcellelyt blev brugt til at rense de seks-helix bundt SAPN monomerer ved FPLC ved hjælp af en nikkel kolonne, der viser, at proteinet eluted på både 150 og 500-millimolar imidazol. Kromatogrammet viser også to andre toppe ved 185 og 210 milliliters samlede volumen svarende til isopropanolvasken og den imidazolfrie vask.Fraktionerne og renheden af det rekombinant protein kunne identificeres ved gradient SDS-PAGE geler med protein af interesse primært placeret i fraktion 68 til 79. Western blot analyse med anti-hans og anti-167D4 antistoffer viste, at de samlede fraktioner faktisk var protein af interesse. Blots viste også tilstedeværelsen af de seks-helix bundt SAPN multimers.De prøver, der indeholdt protein monomerer af interesse blev foldet ind i fuldt samlet seks-helix bundt SAPN ved dialyse og partikelstørrelse distribution blev bestemt af DLS og nanopartikel tracking analyse. Visualisering ved transmission elektron mikroskopi afslørede velformede individuelle seks-helix bundt SAPN partikler med størrelsesfordelingen fra de to partikel dimensionering teknikker. Det vigtigste skridt i denne protokol er omfoldning af seks-helix bundt SAPN.Den korrekte pH og ioniske styrke af omfoldning buffer er afgørende. Ved hjælp af en isopropanol vask under rensning, vi var i stand til at reducere forurenende LPS til et meget lavt niveau. LPS kan dog reduceres yderligere ved hjælp af en anionudvekslingskolonne efter behov.Denne teknologi kan nemt tilpasses til menneskelig anvendelse. En bakteriel-udtrykt SAPN er allerede blevet skaleret op til en kommende fase 1/2a malaria kliniske forsøg.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Dyrkning af humane neurale stamceller i en 3-dimensionel selvsamlende peptid Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Analyse af målrettet Viral Protein Nanopartikler Leveret til HER2 + tumorer

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonisk Nanopartikler for regenerativ Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Fremstilling af metal nanopartikler ved pulserende laserablation i væsker: Et værktøj til at studere de antibakterielle egenskaber ved nanopartikler

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generisk protokol for optimering af heterolog Protein produktion ved hjælp af automatiserede Microbioreactor teknologi

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Overflade Functionalization af Hepatitis E Virus nanopartikler ved hjælp af kemiske konjugation metoder

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Produktionen af Elastin-lignende Protein Hydrogels til indkapsling og immunfarvning af celler i 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...