Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door een coöperatieve overeenkomst (W81XWH-11-2-0174) tussen de Henry M Jackson Foundation voor de vooruitgang van militaire geneeskunde, Inc. en het Amerikaanse ministerie van defensie. De anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV antilichaam werd ontvangen van Dr. Susan Zolla-Pazner via de NIH AIDS-reagens programma.

<ol>
	<li>Karch, C. P., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+technologies:+From+whole+organisms+to+rationally+designed+protein+assemblies.">Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies.</a> Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).</li><li>Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Immunologic+Properties+of+Soluble+Versus+Particulate+Antigens.">Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens.</a> Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).</li><li>Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+basis+for+enhanced+immunity+of+nanoparticle+vaccines.">Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).</li><li>Yeates, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Principles+for+Designing+Highly+Symmetric+Self-Assembling+Protein+Nanomaterials.">Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).</li><li>Marcandalli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Potent+Neutralizing+Antibody+Responses+by+a+Designed+Protein+Nanoparticle+Vaccine+for+Respiratory+Syncytial+Virus.">Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus.</a> Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decorating+Self-Assembled+Peptide+Cages+with+Proteins.">Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins.</a> ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).</li><li>Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembling+Protein+Nanoparticles:+implications+for+HIV-1+vaccine+development.">Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development.</a> Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).</li><li>Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+design+of+peptides+that+self-assemble+into+regular+polyhedral+nanoparticles).">Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles).</a> Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+displaying+HIV-1+Env+V1V2+loop+in+a+native-like+trimeric+conformation+as+vaccine+antigen.">Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen.</a> Nanomedicine. , (2018).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+P.+falciparum+specific+coiled-coil+domain+to+construct+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+to+prevent+malaria.">The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-adjuvanted+nanoparticle+based+vaccine+against+infectious+bronchitis+virus.">A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus.</a> PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).</li><li>Wahome, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+display+of+4E10+and+2F5+epitopes+on+self-assembling+protein+nanoparticles+as+a+potential+HIV+vaccine.">Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+novel+immunogenic+nanoparticle+platform+for+Toxoplasma+peptide+vaccine+in+HLA+transgenic+mice.">Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice.</a> Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonadjuvanted+polypeptide+nanoparticle+vaccine+confers+long-lasting+protection+against+rodent+malaria.">A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria.</a> Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibody+and+CD8++T-cell+responses+to+the+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+protein+induced+by+a+nanoparticle+vaccine.">Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine.</a> PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).</li><li>Seth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+targeting+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+delivered+in+three+Army+Liposome+Formulation+adjuvants.">Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants.</a> Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+nanoparticles+with+built-in+flagellin+domains+increases+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+falciparum+based+vaccine.">Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine.</a> Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanovaccine+confers+robust+immunity+against+Toxoplasma.">Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma.</a> NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+self-adjuvanted+protein+nanoparticles+provides+protection+against+lethal+influenza+challenge.">Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge.</a> Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).</li><li>Haynes, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-correlates+analysis+of+an+HIV-1+vaccine+efficacy+trial.">Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial.</a> New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).</li><li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand.">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).</li><li>O&#39; Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+gp120+V1V2+loop:+structure,+function+and+importance+for+vaccine+development.">The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development.</a> Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).</li><li>Babapoor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Vaccine+Using+Nanoparticle+Platform+to+Present+Immunogenic+M2e+against+Avian+Influenza+Infection.">A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection.</a> Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).</li><li>Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+self-assembling+protein+nanoparticle+architectures+for+applications+in+vaccine+design.">Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design.</a> Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).</li><li>Indelicato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+Governing+the+Self-Assembly+of+Coiled-Coil+Protein+Nanoparticles.">Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles.</a> Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).</li><li>Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+assemblies+and+their+biomedical+applications.">Nanoscale assemblies and their biomedical applications.</a> Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).</li><li>Rey, F. A., Lok, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Features+of+Enveloped+Viruses+and+Implications+for+Immunogen+Design+for+Next-Generation+Vaccines.">Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines.</a> Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Endotoxins.">Bacterial Endotoxins.</a> United States Pharmacopeia (USP). , (2011).</li><li>. Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/media/76255/download">https://www.fda.gov/media/76255/download</a> (1993)</li></ol>

De meningen zijn die van de auteurs en mogen niet worden opgevat als representeren van de standpunten van het Amerikaanse leger of het ministerie van defensie. Peter Burkhard heeft interesse in het bedrijf alpha-O peptides AG en heeft patenten op de technologie. De andere auteurs hebben geen relatie of financiële betrokkenheid met enig bedrijf met een financieel belang over de materie die in dit document wordt gepresenteerd.

Nanotechnologie biedt vele voordelen en oplossingen voor de ontwikkeling van subeenheid vaccins. Nanovaccines kunnen herhaaldelijk antigenen presenteren als deeltjes aan het gastheer immuunsysteem die de immunogeniciteit verhogen26. Hoewel er veel verschillende soorten nanovaccines zijn, geloven we dat degenen die bestaan uit de Novo ontworpen eiwitten de sterkste aanpak lijken te zijn voor vaccin ontwikkeling1. Ze kunnen worden ontworpen zonder een sequentie homologie aan de gastheer eiwitten en presenteren het antigeen van belang in dicht bij inheemse-achtige conformatie terwijl het verstrekken van lage productiekosten en hoge product opbrengsten. Een uitstekend voorbeeld van deze aanpak is de SAPN-technologie, die we hebben toegepast op vaccins tegen meerdere besmettelijke ziekten7. Om de moeilijkheden bij de ontwikkeling van HIV-1-vaccins aan te pakken, hebben we een unieke SHB-SAPN-kern ontwikkeld om het V1V2 antigen effectief te presenteren in een native-achtige trimeric-conformatie9. Veel vaccin doelen, met name voor virale ziekten, zijn aanwezig als trimeren27. Dit fenomeen geeft aan dat ons SAPN-ontwerp brede implicaties heeft voor de ontwikkeling van subeenheid vaccins.
Bij deze methode laten we zien hoe u SHB-SAPNs produceert in een E. coli -expressie systeem. We hebben hoge opbrengsten van eiwitten uitgedrukt (ongeveer 6 mg/100 mL cultuur). Het eiwit bevatte 10 histidines en werd gemakkelijk gezuiverd met behulp van een geïmmobiliseerde metaal affiniteits chromatografie met ni2 + kolom. Deze lengte van de his-tag bleek de optimale te zijn voor de hoogste eiwitopbrengst. Het gezuiverde eiwit bevatte de volledige lengte van het ontworpen eiwit, zoals aangegeven door de aanwezigheid van zowel de N-terminale HisTag als de C-Terminal heptad REPEAT. We gebruikten algemeen aanvaarde technieken en optimaliseerde ze voor de expressie, productie en karakterisering van de SHB-SAPN core. Gebrek aan de productie van het volledige eiwit tijdens de ontwikkeling van een SAPN met een nieuwe proteïne-epitoop kan duiden op een expressie probleem van het gen in de hostcel. Als dat gebeurt, moeten het gen en het expressie systeem opnieuw worden ontworpen en aangepast aan het beschreven protocol. Wijziging van sonicatie tijd of-intensiteit kan ook de concentratie van het voorspelde volledige eiwit verhogen.
Hergevouwen deeltjes waren in het verwachte groottebereik (20 tot 100 nm)8,24,25 zoals bepaald door DLS en nano artikel tracking analyse. Deze resultaten werden verder bevestigd door het gebruik van TEM. Als er problemen zijn in deze stap, is dit normaalgesproken het gevolg van een probleem met de pH-of Ionische sterkte van de hervouwende buffer. Wanneer grote deeltjes worden gedetecteerd op de deeltjes dimensionerings technieken, geeft dit aan aggregatie, die kan worden vermeden door het verhogen van de pH van de hervouwende buffer. Als de deeltjes niet worden gedetecteerd door DLS, controleer dan de concentratie van het eiwit en controleer de pH van de buffer. De uiteindelijke eiwitconcentratie voor DLS moet ten minste 100 μg/mL zijn. Als de concentratie niet het probleem is, duidt dit op de overvloed aan kleine, niet volledig gevormde deeltjes, waarvan de concentratie kan worden verminderd door de pH te verlagen. Als alternatief kan de natriumchloride-concentratie worden aangepast aan het optimale bereik om de aanwezigheid van deeltjes met ongewenste grootte te minimaliseren.
Tot slot, door het gebruik van een isopropanol Wash stap tijdens zuivering waren we in staat om contaminerende LP'S te verminderen van de gastheer E. coli naar 0,01 EU/ΜG van SAPN die onder de Food and Drug ADMINISTRATION (FDA) limiet van 5 EU/kg lichaamsgewicht voor injecteerbare producten 28. dit niveau kan verder worden verminderd door gebruik te maken van een anion Exchange-kolom, ook wel Q-kolom genoemd. Als er nog steeds hoge niveaus van endotoxine aanwezig zijn, controleer dan alle materialen die zijn gebruikt voor de buffer voorbereiding. Vergeet niet om alleen depyrogenated glaswerk en endotoxine gratis plasticware te gebruiken in deze methode.
Deze resultaten geven aan dat we met succes een methode hebben ontwikkeld om de SHB-SAPN-kern te produceren die kan worden gebruikt voor preklinische immunisatie studies. Deze methode met slechts kleine wijzigingen, indien van toepassing, kan worden toegepast op de zuivering van SHB-SAPNs wanneer een antigeen van belang wordt toegevoegd. Het gebruik van deze methode als uitgangspunt is een van de belangrijkste veranderingen in de elutie-stap. Verschillende eiwitten Elueer bij verschillende imidazol concentraties die experimenteel moeten worden bepaald. Het andere belangrijke verschil kan de samenstelling van de hervouwende buffer zijn. Optimalisatie zou moeten testen verschillende pH-omstandigheden en Ionische sterktes.
Met het oog op toekomstig werk zijn slechts twee kleine aanpassingen nodig om de toepassing van de SHB-SAPN mogelijk te maken. De eerste is dat de expressie vector moet worden gewijzigd in een kanamycine weerstand selecteerbare marker als gevolg van de ampicilineallergie bij de mens29. De andere belangrijke eis van de eiwitproductie voor menselijk gebruik is het produceren van de SHB-SAPN in dierlijke product-vrije media. Een kleinschalige studie wees al op een redelijk rendement van eiwitten in een plantaardige media. Het hier gepresenteerde werk is gemakkelijk schaalbaar voor de ultieme GMP-productie, zoals aangetoond met een malaria vaccin kandidaat, FMP01416. Deze grootschalige FMP014-SAPN-productie omvatte zowel de anion-uitwisseling als de Cation Exchange-stappen om LPS en ni2 + -inhoud van het eindproduct verder te verminderen. Deze bacterie-uitgedrukt SAPN is al opgeschaald voor een aanstaande klinische studiefase 1/2a.

Terwijl de traditionele vaccin ontwikkeling gericht is op de geïnactiveerde of verzwakte pathogenen, is de focus van moderne vaccins verschoven naar subeenheid vaccins1. Deze aanpak kan leiden tot een gerichter antwoord en mogelijk meer werkzame vaccin kandidaten. Een van de grootste nadelen is echter dat subeenheid vaccins geen deeltjes zijn zoals hele organismen die kunnen resulteren in verminderde immunogeniciteit2. Een nano artikel als repetitief antigeen display systeem kan zowel de voordelen van de beoogde subeenheid vaccin benadering als de deeltjes aard van het hele organisme1,3hebben.
Onder de bestaande soorten nanovaccines, rationeel ontworpen eiwit assemblages zorgen voor het ontwerp en de ontwikkeling van vaccin kandidaten die meerdere kopieën van het antigeen potentieel in een inheemse-achtige conformatie kan presenteren1,4 ,5,6. Een voorbeeld van deze eiwit assemblages zijn de zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes (SAPNs)7. Sapn's zijn gebaseerd op gekrulde spoel domeinen en worden traditioneel uitgedrukt in Escherichia coli8. SAPN-vaccin kandidaten zijn ontwikkeld voor een verscheidenheid aan ziekten zoals malaria, SARS, influenza, toxoplasmose en HIV-19,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. het ontwerp van elke SAPN-kandidaat is specifiek voor het pathogeen van belang, maar de productie-, zuiverings-en hervouw technieken zijn doorgaans algemeen toepasbaar.
Een van onze huidige interesses is een effectief HIV-1-vaccin. In RV144 — de enige fase III klinische studie van een HIV-1-vaccin dat een bescheiden werkzaamheid vertoonde — was het verminderde risico op infectie gecorreleerd met IgG-antilichamen tegen de V1V2-lus van de envelop eiwitten20,21. De inheemse-achtige trimeric presentatie van deze regio wordt beschouwd als belangrijk voor de beschermende immunogeniciteit22. Om de V1V2-lus in zo dicht mogelijk bij inheems-achtige conformatie te presenteren, ontwikkelden we een bewijs van principe SAPN-vaccin kandidaat dat de HIV-1-envelop post-Fusion Six-Helix Bundle (SHB) bevatte om de V1V2 lus in de juiste conformatie te presenteren9 . Deze kandidaat werd erkend door bekende monoklonale antilichamen tegen HIV-1-envelop eiwitten. Muizen geïmmobiliseerd met V1V2-SHB-SAPN verhoogd V1V2 specifieke antilichamen, dat, belangrijker nog, gebonden aan gp70 V1V2, de juiste conformationele epitopen9. De SHB-SAPN core kan andere functies hebben dan de rol als drager voor de HIV-1 V1V2-lus. Hier beschrijven we een gedetailleerde methodologie voor de expressie, zuivering, refolding en validatie van de SHB-SAPN kern. De sequentie selectie, het ontwerp van nanodeeltjes, het moleculaire klonen en de transformatie van E. coli zijn eerder beschreven9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

Zelfmondende eiwit nanodeeltjes (Sapn's) functioneren als repetitieve antigeen displays en kunnen worden gebruikt om een breed scala aan vaccins voor verschillende infectieziekten te ontwikkelen. In dit artikel laten we een methode zien om een SAPN-kern te produceren met een Six-Helix Bundle (SHB)-assemblage die in staat is om antigenen in een trimere conformatie te presenteren. We beschrijven de uitdrukking van de SHB-SAPN in een E. coli -systeem, evenals de nodige stappen voor het zuiveren van eiwitten. We hebben een isopropanol Wash-stap opgenomen om de resterende bacteriële lipopolysaccharide te verminderen. Als indicatie van de eiwit identiteit en-zuiverheid reageerde het eiwit met bekende monoklonale antilichamen in Western Blot-analyses. Na het revouwen viel de grootte van de deeltjes in het verwachte bereik (20 tot 100 nm), wat werd bevestigd door Dynamische lichtverstrooiing, nanodeeltjes-traceer analyse en transmissie elektronenmicroscopie. De hier beschreven methodologie is geoptimaliseerd voor de SHB-SAPN, echter, met slechts lichte wijzigingen kan worden toegepast op andere SAPN constructies. Deze methode is ook gemakkelijk overdraagbaar naar grootschalige productie voor GMP-productie voor menselijke vaccins.

De hier getoonde volledig geassembleerde SHB-SAPN is gebaseerd op eiwit sequenties (Figuur 1a) die naar verwachting in een deeltje worden gevouwen dat 60 exemplaren van het monomeer bevat (Figuur 1b). Figuur 2 geeft een overzicht van de methode voor de productie, zuivering en identificatie van de SHB-SAPN-kern. E. coli uit een glycerol kolf die een Ppep-T expressie vector bevatte met gensequentie van de SHB-SAPN kern werden geïnduceerd in BL21 (DE3) E. coli. Bacteriële cellen werden met succes geteeld en gelyseerd onder denaturering en vermindering van de voorwaarden.
Total Cell lysaat werd gebruikt om SHB-SAPN monomeren door fplc te zuiveren met behulp van een ni2 + kolom (Figuur 3a). De FPLC-chromatograaf demonstreert dat eiwitten zowel op 150 mM als op 500 mM imidazol (Figuur 3a) worden geellueerd. Het chromatogram toont ook twee andere pieken van respectievelijk 185 mL en 210 mL totaal volume overeenkomend met de isopropanol Wash en de imidazol-vrije wassing. De fracties en de zuiverheid van het recombinant eiwit werden geïdentificeerd door een gradiënt SDS-PAGE gels (Figuur 3b). Het eiwit van belang was voornamelijk gelegen in fracties 68 \ u201279 (278 \ u2012300 mL totaal volume). Deze fracties werden samengevoegd voor verdere analyses. Western Blot met anti-his antilichaam (N-Terminal) en 167-D-IV antilichaam (C-Terminus) gaf aan dat de gepoolde fracties inderdaad het eiwit van belang waren (figuur 4a, B). Deze blots demonstreerden ook de aanwezigheid van de SHB-SAPN multimers. Eerdere wassing en elutie fracties hadden de neiging een hogere concentratie van multimerized proteïne te bevatten en werden daarom uitgesloten.
De monsters die de eiwit monomeren van belang bevatte, werden door dialyse in de volledig geassembleerde SHB-SAPN gevouwen. De deeltjesgrootteverdeling werd bepaald door de DLS-en nano artikel-traceer analyse (figuur 5a, B). De DLS identificeerden deeltjes met een Z-gemiddelde hydrodynamische diameter van 67 nm terwijl het NTA-systeem een gemiddelde grootte van 81 nm afgemeten. De geringe verschillen in grootte waren te wijten aan de deeltjes dimensionerings technieken, maar de grootte van beide analyses lag in het verwachte bereik van 20 \ u2012100 nm8,24,25. SHB-SAPNs werden gevisualiseerd door TEM en de beelden toonden goed gevormde individuele deeltjes met de grootteverdeling verkregen uit de twee deeltjes dimensionerings technieken (figuur 5c).
Tijdens de zuivering van het eiwit werd de kolom gewassen met isopropanol om de LPS-besmetting in het uiteindelijke SHB-SAPN-product te verminderen. Om na te gaan of het endotoxinegehalte aanvaardbaar was voor immunisatie, werd de concentratie van LPS in SHB-SAPN monsters gezuiverd met of zonder de reinigingsstap van het isopropanol bepaald door een kinetische LAL test. De resultaten gaven aan dat de productie van isopropanol de endotoxine spiegels heeft verlaagd van > 0,25 EU/μg tot 0,010 EU/μg SHB-SAPN-eiwit (tabel 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> Figuur 1: SHB-SAPN eiwitsequentie en structuur. A) de aminozuursequentie van het SHB-SAPN monomeer. B) computer model van de structuur van de volledig GEASSEMBLEERDE SHB-SAPN-kern, bestaande uit 60 eiwit monomeren. Kleurenschema voor aminozuur sequenties: grijs = HisTag; Groen = pentamer; Donkerblauw = de Novo ontworpen Trimer; Licht blauw = zeshelix bundel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> Figuur 2: stroomschema van de protocol voor de productie van SHB-SAPN. Kleurenschema: zwart = expressie van het eiwit monomeer in E. coli; Donker grijs = monomeer zuivering; Medium Grey = monomeer identificatie; Lichtgrijs = hervouwen en karakteriseren; Wit = volledig geassembleerd SHB-SAPN product. In stappen gelabeld met donker en medium grijs, het eiwit is onder denaturering en het verminderen van voorwaarden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> Figuur 3: Eiwit zuivering van de SHB-SAPN monomeren. A) chromatograaf van de fplc-zuivering. Groene lijn boven het chromatogram geeft de zuiveringsstappen aan. De blauwe lijn in het chromatogram vertegenwoordigt de optische dichtheid van de fracties bij een golflengte van 280 nm. De zwarte lijn laat zien welk percentage van buffer B (8 M ureum, 20 mM Tris, 50 mM natriumfosfaat monobasic, 5 mM TCEP, 500 mM imidazol, pH 8,5) werd gebruikt in elke fase van de zuivering. (B) SDS-page gels van de gepoolde fracties van het Lysaat (L), doorstroming (ft), First Wash (W1), isopropanol Wash (W2), derde was (w3) en afzonderlijke fracties van de 150 mm imidazol (E150) en 500 mm imidazol (E500) elutie stappen van de Zuivering. Moleculaire markers in de eerste rijstrook (M) identificeren banden tussen 10 en 250 kDa. Doel proteïne wordt aangegeven door een zwarte pijl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> Figuur 4: identificatie van het eiwit door Western Blot. Alle rijstroken is geladen met 100 ng eiwit. A) resultatenvan een Western Blot met anti-6X histag. B) resultaten van een Western-Blot met een 167-D-IV HIV-1 monoklonaal antilichaam. Lanes zijn gelabeld als: M = molecuulgewicht marker; 1 = lysaat; 2 = doorstroming; 3 = eerste was; 4 = het wassen van isopropanol (tweede spoeling); 5 = derde wasbeurt; 6 = gegroepeerde volume fracties 56 \ u201261 (eerste elutie piek), 7 = gepoolde volume facties 62 \ u201267 (tussen de twee pieken), 8 = gepoolde volume fracties 68 \ u201278 (tweede elutie piek). Doeleiwit met de verwachte band grootte van 18,07 kDa als de monomere SHB-SAPN band wordt aangegeven door een zwarte pijl. Extra banding in Lanes 7 en 8 zijn dimers, trimers en multimers van de SHB-SAPN (rode pijl). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> Figuur 5: karakterisering van de hergevouwen SHB-SAPN. A). verdeling van de deeltjesgrootte zoals bepaald door de DLS. B) deeltjesgrootte zoals bepaald door nanodeeltjes-tracking (systeem). C) visualisatie van de SHB-SAPN-deeltjes door tem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Monster</td>
			<td>Endotoxine (EU/mL)</td>
			<td>Endotoxine (EU/μg eiwit)</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN met isopropanol Wash</td>
			<td>2,02</td>
			<td>0,01</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN zonder isopropanol Wash</td>
			<td>> 50</td>
			<td>> 0,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Negatieve controle</td>
			<td>Onder detectieniveau</td>
			<td>N/a</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: endotoxine niveaus van hergevouwen SHB-SAPNs. Endotoxine spiegels in SHB-SAPN-monsters die met of zonder een isopropanolwas worden gezuiverd, worden gepresenteerd als endotoxine eenheden/mL en endotoxine eenheden/μg SHB-SAPN-eiwitten.

Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Hier wordt een gedetailleerde methode beschreven die de zuivering, refolding en karakterisering van zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes (Sapn's) beschrijft voor gebruik bij de ontwikkeling van vaccins.

Productie van E. coli-uitgedrukt zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes voor vaccins die een Trimere epitope presentatie vereisen

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Zelfassemblageeianodeeltjes, of SAPN's, kunnen worden gebruikt om vaccins tegen verschillende infectieziekten te ontwikkelen. Deze methode die we hier beschrijven, kan worden gebruikt om SAPN's met een zes-helix-bundel te zuiveren, opnieuw te vouwen en te karakteriseren. Dit nanodeeltje kan trimerïsche antigenen presenteren in een native-achtige conformatie.Met kleine wijzigingen kan deze methode worden toegepast op andere innovatieve SAPN-vaccinconstructies. Bovendien kan het gemakkelijk worden overgedragen op grootschalige productie voor klinische proeven. Voor de lysis van geoogste E.coli uitdrukken van de zes-helix bundel SAPN, gebruik maken van een sonde met de sonicatie output van 150 watt met vier seconden van sonicatie en zes seconden rust, om resuspended bacteriële pellets sonicate in 40 milliliter van imidazool-vrije buffer op ijs gedurende vijf minuten.Centrifugeer het cellulaire lysaat om een verduidelijkt supernatant te genereren en breng het supernatant over naar een steriele kolf van 150 milliliter. Breng het monster vervolgens naar een eindvolume van 100 milliliter met verse imidazoolvrije buffer. Als u het eiwit van belang wilt isoleren, opent u de FPLC-software en klikt u op de optie Nieuwe methode.Open in het menu Methode-instellingen het vervolgkeuzemenu Kolompositie en selecteer C1-poort 3. Selecteer Affiniteit in het vervolgkeuzemenu Getoond op techniek. Selecteer anderen, HisTrap HP en vijf milliliter in het vervolgkeuzemenu Kolomtype.Het kolomvolume en de drukvakken worden automatisch ingesteld op de juiste waarden. Klik op Methodeomtrek en sleep de knoppen Equilibratie en Voorbeeldtoepassing, drie kolomwasknoppen en de knop Elution in het pop-upmenu Fasebibliotheek naast de pijl voordat u het menu Fasebibliotheek sluit. Klik op Evenwicht en stel de waarden in de tabel in op Initiële Buffer B, 4%Eindbuffer B, 4% en Kolomvolume, vijf.Klik op Voorbeeldtoepassing. Klik in het vak Voorbeeldladen op de keuzerondje voor Voorbeeld injecteren op kolom met voorbeeldpomp en bevestig of het vakje naast de stroomsnelheid van methode-instellingen gebruiken is ingecheckt in het vak Voorbeeldinjectie met systeempomp. Wijzig de waarde van het vak Volume in 100 milliliter en het regeling voor het verzamelen van breuken in Enable.Klik het vak Fractiegrootte gebruiken uit methode-instellingen en wijzig de fractiegrootte in vier milliliter. Klik op de eerste kolomwasknop, stel de waarden in de tabel in op Initiële Buffer B, 4%Eindbuffer B, 4% en Kolomvolume, 10. Klik op het vak Regeling Groep verzameling breuken inschakelen en schakel de grootte van de breuk gebruiken uit methode-instellingen uit.Wijzig de fractiegrootte in vier milliliter en klik op de tweede kolomwasknop. Stel de waarden in de tabel in op Initiële Buffer B, 0%Eindbuffer B, 0% en Kolomvolume, vijf. Klik op het vak Regeling Groep verzameling breuken inschakelen en schakel de grootte van de breuk gebruiken uit methode-instellingen uit.Wijzig de fractiegrootte in vier milliliter en klik op de knop Derde kolomwasknop. Stel de waarden in de tabel in op Initiële Buffer B, 0%Eindbuffer B, 0% en Kolomvolume, 10. Klik op de knop Regeling Groep verzamelingen en schakel de grootte van de breuk gebruiken uit methode-instellingen uit.Verander vervolgens de fractiegrootte in vier milliliter. Klik op de knop Elution en klik met de rechtermuisknop op de informatie in de tabel. Klik in het pop-upmenu op Stap verwijderen en sleep de knop Isocratisch verloop twee keer naar de tabel, zodat er twee vermeldingen zijn.Stel de waarde voor de eerste vermelding in op Initiële Buffer B, 30%Eindbuffer B, 30% en Kolomvolume, 10. Stel de waarde voor de tweede vermelding in op Initiële Buffer B, 100%Eindbuffer B, 100% en Kolomvolume, 10. Klik op de knop Regeling Groepsverzameling inschakelen en klik op het vak Fractiegrootte gebruiken uit methode-instellingen.Klik vervolgens op Opslaan als en geef de bestandszuivering een naam. Plaats de pomp Een slang van de FPLC in de imidazoolvrije wasbuffer en de b-slang van de pomp in de 500-millimolar imidazool buffer. Plaats de buis van de monsterpomp in het monster van 100 milliliter en voer het zuiveringsprogramma uit.Wanneer de 60% isopropanol wassen nodig is, pauzeer het programma, verplaats de pomp Een slang van de imidazool-vrije wassen in de 60% isopropanol wassen, en start het programma opnieuw. Aan het einde van de was, pauzeer het programma opnieuw, breng de pomp Een slang terug naar de imidazool-vrije wasbuffer en start het zuiveringsprogramma opnieuw. Om de zuiverheid van het gezuiverde eiwit te beoordelen, combineert u eerst de fracties van de stroom door, wast u één, wast u twee en wast u drie stappen in afzonderlijke conische buizen van 50 milliliter.Meng vervolgens 15 microliter van elke monsterbuis met 15 microliters 2x Laemmli buffer in individuele 0,5 milliliter microcentrifugebuizen en ontatureer de monsters op 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Zet aan het einde van de incubatie een gelloopapparaat op met drie vlekvrije vier tot 20% prefab polyacrylamide gels in tris-Glycine SDS-PAGE loopbuffer. Laad acht microliter van moleculair gewicht marker aan de eerste put van elke gel en 30 microliter van gedenatureerd monster aan de andere putten.Laat de gels op 200 volt lopen tot de kleurstofvoorzijde de onderkant van de gel raakt en spoel de gels kort af met gedeïsized water voordat ze onmiddellijk met een vlekvrij beeldvormingssysteem worden weergegeven. Identificeer vervolgens de breuken die eiwitbanden met de juiste grootte bevatten en verpool deze fracties. Voeg voor zes-helixbundel SAPN refolding 10 tot 20 milliliter gepoold eiwit toe aan een 10 kilodalton moleculair gewicht cut-off dialysecassette.Dialyze de cassette in acht molaire ureum, 20-millimolar Tris, 5%glycerol en vijf millimolar TCEP bij kamertemperatuur 's nachts. De volgende ochtend, verlaag de ureumconcentratie in de dialysebuffer stapsgewijs met twee kies om de twee uur om langzaam dialyseren de ureum uit het monster. Wanneer de ureumconcentratie twee kiespunten bereikt, verplaatst u het dialyseapparaat naar vier graden Celsius en dialyseert u het monster in ureum van 120 millimolar, tris van 20 millimolar en 5%glycerol 's nachts om de refolding af te maken.Haal de volgende ochtend het omgevouwen eiwit uit de cassette en filter de zes-helixbundel SAPN door een 0,22 micrometer polyvinylidene fluoride spuitfilter. Om de gemiddelde deeltjesgrootte van de zes-helix-bundel SAPN te meten, voegt u 45 microliters van zes-helix-bundel SAPN toe aan een wegwerp cuvette en plaatst u de cuvette in de DLS-machine. Maak vervolgens een nieuw meetbestand en voer een vooraf geschreven standaardwerkprocedure uit voor eiwit in 120-millimolar ureum, 20-millimolar Tris en 5%glycerolbuffer bij 25 graden Celsius.Start vervolgens met de meting. De Z-gemiddelde grootte, de PDI en de distributieresultaten worden berekend voor elke run. De machine leest het monster vijf keer.Deze volledig geassembleerde zes-helix bundel SAPN is gebouwd op eiwit sequenties die naar verwachting vouwen in een deeltje dat 60 kopieën van de monomeer bevat. Het totale cellysaat werd gebruikt om de zes-helixbundel SAPN monomeren door FPLC te zuiveren met behulp van een nikkelkolom, waaruit bleek dat het eiwit zowel 150 als 500 millimolar imidazool ontlokte. Het chromatogram toont ook twee andere pieken op 185 en 210 milliliter totaal volume dat overeenkomt met de isopropanol was en de imidazool-vrije was respectievelijk.De fracties en de zuiverheid van het recombinant eiwit kunnen worden geïdentificeerd door gradiënt SDS-PAGE gels met het eiwit van belang voornamelijk gelegen in fractie 68 tot en met 79. Westerse vlekanalyse met anti-His en anti-167D4 antilichamen gaven aan dat de gepoolde fracties inderdaad het eiwit van belang waren. De vlekken toonden ook de aanwezigheid van de zes-helix bundel SAPN multimers.De monsters die de eiwitmonomers van belang bevatten, werden door dialyse- en deeltjesgrootteverdeling in de volledig geassembleerde six-helix-bundel SAPN gevouwen door dialyse- en deeltjesgrootteverdeling. Visualisatie door transmissie elektronenmicroscopie bleek goed gevormde individuele zes-helix bundel SAPN deeltjes met de grootte verdeling verkregen uit de twee deeltjes dimensionering technieken. De belangrijkste stap in dit protocol is het opnieuw vouwen van de zes-helix bundel SAPN.De juiste pH en ionische sterkte van de refolding buffer zijn essentieel. Met behulp van een isopropanolwas tijdens de zuivering konden we vervuilende LPS tot een zeer laag niveau reduceren. LPS kan echter verder worden verminderd met behulp van een anion uitwisseling kolom indien nodig.Deze technologie kan eenvoudig worden aangepast voor menselijke toepassing. Een bacterie-uitgedrukte SAPN is al opgeschaald voor een komende fase 1/2a malaria klinische studie.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Thermodynamica van membraaneiwit Folding Gemeten door fluorescentiespectroscopie

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulering van diblok polymere nanodeeltjes door middel van Nanoprecipitation Techniek

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Analyse van Gerichte Viral Eiwit Nanodeeltjes Geleverd aan HER2 + Tumoren

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonische Nanodeeltjes voor Regeneratieve Onderzoek

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Productie van Metaal Nanoparticles door Pulsed Laser Ablation in Liquids: Een Tool voor het bestuderen van de Antibacteriële Eigenschappen van Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generic-Protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde Microbioreactor technologie

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Oppervlakte Functionalization van Hepatitis E Virus nanodeeltjes met behulp van methoden voor chemische Woordherkomst en-opbouw

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Productie van elastine-achtige eiwitten Hydrogels voor inkapselen en immunokleuring van cellen in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...