Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par un accord de coopération (W81XWH-11-2-0174) entre la Fondation Henry M Jackson pour l'avancement de la médecine militaire, Inc., et le ministère de la Défense des États-Unis. L'anticorps anti-VIH-1 gp41 mAb 167-D IV a été reçu de la Dre Susan Zolla-Pazner dans le cadre du Programme de réactifs du sida des NIH.

<ol>
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Les opinions exprimées sont celles des auteurs et ne doivent pas être interprétées comme représentant les positions de l'armée américaine ou du ministère de la Défense. Peter Burkhard a un intérêt dans la société appelée Alpha-O Peptides AG et a des brevets sur la technologie. Les autres auteurs n'ont aucune affiliation ou implication financière avec une société ayant un intérêt financier sur le sujet présenté dans le présent document.

La nanotechnologie offre de nombreux avantages et solutions pour le développement de vaccins sous-unis. Les nanovaccins peuvent présenter à plusieurs reprises des antigènes comme particules au système immunitaire hôte augmentant l'immunogénicité26. Bien qu'il existe de nombreux types différents de nanovaccins, nous croyons que ceux composés de protéines de novo conçu semblent être l'approche la plus forte pour le développement de vaccins1. Ils peuvent être conçus sans aucune homologie de séquence aux protéines hôtes et présenter l'antigène d'intérêt dans près de conformation indigène-comme tout en fournissant le coût de production bas et les rendements élevés de produit. Un excellent exemple de cette approche est la technologie SAPN, que nous avons appliquée aux vaccins contre de multiples maladies infectieuses7. En abordant les difficultés dans le développement du vaccin CONTRE le VIH-1, nous avons conçu un noyau SHB-SAPN unique pour présenter efficacement l'antigène V1V2 dans une conformation trimérique indigène9. De nombreuses cibles vaccinales, en particulier pour les maladies virales, sont présentes en tant que trimestres27. Ce phénomène indique que notre conception SAPN a de vastes implications pour le développement de vaccins sous-unitaires.
Dans cette méthode, nous démontrons comment produire des SHB-SAPNs dans un système d'expression E. coli. Nous avons exprimé des rendements élevés de protéines (environ 6 mg/100 ml de culture). La protéine contenait 10 histidines et a été facilement purifiée à l'aide d'une chromatographie d'affinité métallique immobilisée avec la colonne Ni2. Cette longueur du His-Tag s'est avérée optimale pour le rendement protéique le plus élevé. La protéine purifiée contenait la pleine longueur de la protéine conçue comme indiqué par la présence du HisTag N-terminal et de la répétition de l'heptade terminal C. Nous avons utilisé des techniques largement acceptées et les avons optimisées pour l'expression, la production et la caractérisation du noyau SHB-SAPN. L'absence de la production de la protéine pleine longueur pendant le développement d'un SAPN contenant un nouvel épitope de protéine pourrait indiquer un problème d'expression du gène dans la cellule hôte. Si cela se produit, le gène et le système d'expression doivent être repensés et adaptés au protocole décrit. La modification du temps ou de l'intensité de la sonication peut également augmenter la concentration de la protéine pleine longueur prévue.
Les particules repliées se trouvaient dans la plage de taille prévue (20 à 100 nm)8,24,25 selon l'analyse du DLS et du suivi des nanoparticules. Ces résultats ont été confirmés par l'utilisation de TEM. S'il y a des problèmes dans cette étape, c'est normalement dû à un problème avec le pH ou la force ionique du tampon repliant. Lorsque des particules de grande taille sont détectées sur les techniques de dimensionnement des particules, il indique l'agrégation, qui peut être évitée en augmentant le pH du tampon de repliage. Si les particules ne sont pas détectées par DLS, vérifiez la concentration de la protéine et vérifiez le pH du tampon. La concentration finale de protéines pour le DLS devrait être d'au moins 100 g/mL. Si la concentration n'est pas le problème, elle indique l'abondance de petites particules incomplètement formées, dont la concentration peut être réduite en diminuant le pH. Alternativement, la concentration de chlorure de sodium peut être ajustée à la plage optimale pour minimiser la présence de particules de taille non désirée.
Enfin, en utilisant une étape de lavage de l'isopropanol pendant la purification, nous avons pu réduire la contamination du LPS de l'hôte E. coli à 0,01 UE / G de SAPN qui est en dessous de la limite de la Food and Drug Administration (FDA) de 5 UE / kg de poids corporel pour les produits injectables 28. Ce niveau peut être encore réduit en utilisant une colonne d'échange d'anion également connue sous le nom de colonne Q. Si des niveaux élevés d'endotoxine sont encore présents, vérifiez tous les matériaux qui ont été utilisés pour la préparation tampon. N'oubliez pas d'utiliser uniquement de la verrerie depyrogenated et de la plasticware sans endotoxine dans cette méthode.
Ces résultats indiquent que nous avons mis au point avec succès une méthode pour produire le noyau SHB-SAPN qui peut être utilisé pour des études de vaccination préclinique. Cette méthode avec seulement de légères modifications, le cas échéant, peut être appliquée à la purification des SHB-SAPNs lorsqu'un antigène d'intérêt est ajouté. L'utilisation de cette méthode comme point de départ l'un des changements majeurs est dans l'étape d'élution. Différentes protéines s'élipent à différentes concentrations d'imidazoles qui doivent être déterminées expérimentalement. L'autre différence majeure pourrait être la composition du tampon repliant. L'optimisation nécessiterait de tester différentes conditions de pH ainsi que des forces ioniques.
En compte tenu des travaux futurs, seules deux légères modifications sont nécessaires pour permettre l'application humaine du SHB-SAPN. La première est que le vecteur d'expression doit être changé en un marqueur sélectionnable de résistance à la kanamycine en raison de l'allergie à l'ampicilline chez l'homme29. L'autre exigence majeure de la fabrication de protéines à usage humain est de produire le SHB-SAPN dans les médias sans produits animaux. Une étude à petite échelle a déjà indiqué un rendement raisonnable de protéines dans un média à base de plantes. Les travaux présentés ici sont facilement évolutifs pour la production finale de GMP comme l'a démontré un candidat vaccin contre le paludisme, FMP01416. Cette production FMP014-SAPN à grande échelle comprenait à la fois l'échange d'anion et les étapes d'échange de cation pour réduire davantage le contenu LPS et Ni2 du produit final. Ce SAPN à exprime bactérienne a déjà été mis à l'échelle pour un prochain essai clinique de phase 1/2a.

Alors que le développement traditionnel des vaccins s'est concentré sur les agents pathogènes inactivés ou atténués, l'accent des vaccins modernes s'est déplacé vers les vaccins sous-unis1. Cette approche peut mener à une réponse plus ciblée et à des candidats vaccins potentiellement plus efficaces. Cependant, l'un des principaux inconvénients est que les vaccins sous-unis ne sont pas des particules comme des organismes entiers qui peuvent entraîner une immunogénicité réduite2. Une nanoparticule comme système répétitif d'affichage d'antigène peut avoir les avantages de l'approche ciblée de vaccin de sous-unité aussi bien que la nature particulaire de l'organisme entier1,3.
Parmi les types existants de nanovaccins, les assemblages de protéines conçus rationnellement permettent la conception et le développement de vaccins candidats qui peuvent présenter plusieurs copies de l'antigène potentiellement dans une conformation indigène1,4 ,5,6. Un exemple de ces assemblages de protéines sont les nanoparticules de protéines auto-assemblantes (SAPNs)7. Les SAPN sont basés sur des domaines enroulés et sont traditionnellement exprimés en Escherichia coli8. Les vaccins SAPN candidats ont été développés pour une variété de maladies telles que le paludisme, le SRAS, la grippe, la toxoplasmose, et le VIH-19,10,11,12,13 , 14 (en) , 15 Annonces , 16 Annonces , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19. La conception de chaque candidat SAPN est spécifique à l'agent pathogène d'intérêt, cependant, les techniques de production, de purification et de repliement sont généralement largement applicables.
L'un de nos intérêts actuels est un vaccin efficace contre le VIH-1. Dans RV144, le seul essai clinique de phase III d'un vaccin contre le VIH-1 qui a démontré une efficacité modeste, le risque réduit d'infection a été corrélé avec les anticorps IgG à la boucle V1V2 de la protéine enveloppe20,21. La présentation trimeric indigène-comme de cette région est pensée pour être importante pour l'immunogénicité protectrice22. Pour présenter la boucle V1V2 dans la conformation native aussi proche que possible, nous avons développé une preuve de principe du vaccin SAPN candidat qui contenait l'enveloppe VIH-1 paquet de six hélices (SHB) pour présenter la boucle V1V2 dans la conformation correcte9 . Ce candidat a été identifié par les anticorps monoclonaux connus à la protéine d'enveloppe de HIV-1. Les souris immunisées avec V1V2-SHB-SAPN ont soulevé des anticorps spécifiques V1V2, qui, plus important encore, liés au gp70 V1V2, l'épitopes conformationnelle correcte9. Le noyau SHB-SAPN pourrait avoir d'autres fonctions au-delà du rôle de porteur de la boucle V1V2 VIH-1. Nous décrivons ici une méthodologie détaillée pour l'expression, la purification, le repliement et la validation du noyau SHB-SAPN. La sélection de la séquence, la conception des nanoparticules, le clonage moléculaire et la transformation d'E. coli ont déjà été décrits9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

Les nanoparticules de protéines auto-assemblantes (SAPN) fonctionnent comme des écrans d'antigènes répétitifs et peuvent être utilisées pour développer un large éventail de vaccins pour différentes maladies infectieuses. Dans cet article nous démontrons une méthode pour produire un noyau de SAPN contenant un ensemble de faisceau de six-helix (SHB) qui est capable de présenter des antigènes dans une conformation trimeric. Nous décrivons l'expression du SHB-SAPN dans un système d'E. coli, ainsi que les étapes nécessaires de purification de protéine. Nous avons inclus une étape de lavage d'isopropanol pour réduire le lipopolysaccharide bactérien résiduel. Comme indication de l'identité et de la pureté de protéine, la protéine a réagi avec les anticorps monoclonaux connus dans les analyses occidentales de tache. Après le repli, la taille des particules est tombée dans la plage prévue (20 à 100 nm), ce qui a été confirmé par la diffusion dynamique de la lumière, l'analyse du suivi des nanoparticules et la microscopie électronique de transmission. La méthodologie décrite ici est optimisée pour le SHB-SAPN, cependant, avec seulement de légères modifications, il peut être appliqué à d'autres constructions SAPN. Cette méthode est également facilement transférable à la production à grande échelle pour la fabrication de GMP pour les vaccins humains.

Le SHB-SAPN entièrement assemblé ici est construit sur des séquences protéiques (Figure 1A) qui sont prévues pour se plier en une particule qui contient 60 copies du monomère (Figure 1B). La figure 2 fournit un aperçu de la méthode de production, de purification et d'identification du noyau SHB-SAPN. E. coli d'un stock de glycérol qui contenait un vecteur d'expression pPep-T avec la séquence génétique du noyau SHB-SAPN ont été induits dans BL21 (DE3) E. coli. Des cellules bactériennes ont été avec succès cultivées et lysées sous des conditions dénaturantes et de réduction.
Le lysate total des cellules a été utilisé pour purifier les monomères SHB-SAPN par le FPLC à l'aide d'une colonne Ni2 ( Figure 3A). Le chromatographe FPLC démontre que les protéines ont élifié à 150 mm et 500 mM d'imidazole (figure 3A). Le chromatogramme montre également deux autres pics à 185 ml et 210 ml de volume total correspondant au lavage d'isopropanol et au lavage sans imidazole, respectivement. Les fractions et la pureté de la protéine recombinante ont été identifiées par les gels SDS-PAGE de gradient (figure3B). La protéine d'intérêt était principalement située en fractions 68-u201279 (278-u2012300 mL volume total). Ces fractions ont été combinées pour d'autres analyses. Western blot with anti-His antibody (N-terminal) and 167-D-IV antibody (C-terminus) indicated that the pooled fractions were indeed the protein of interest (Figure 4A,B). Ces taches ont également démontré la présence des multimères SHB-SAPN. Les lavages et les fractions d'élution antérieurs avaient tendance à contenir une concentration plus élevée de protéines multimerisées et étaient donc exclus.
Les échantillons qui contenaient les monomères protéiques d'intérêt ont été pliés dans le SHB-SAPN entièrement assemblé par dialyse. La distribution de la taille des particules a été déterminée par l'analyse du dLS et du suivi des nanoparticules (figure5A,B). Le DLS a identifié des particules d'un diamètre hydrodynamique moyen De 67 nm, tandis que le système NTA a mesuré une taille moyenne de 81 nm. Les légères différences de taille étaient dues aux techniques de dimensionnement des particules, mais la taille des deux analyses était de l'ordre de 20'u2012100 nm8,24,25. Les SHB-SAPN ont été visualisés par TEM et les images montraient des particules individuelles bien formées avec la distribution de la taille obtenue à partir des deux techniques de dimensionnement des particules (figure5C).
Pendant la purification de la protéine, la colonne a été lavée avec l'isopropanol pour diminuer la contamination de LPS dans le produit final de SHB-SAPN. Pour vérifier si le niveau d'endotoxine était acceptable pour l'immunisation, la concentration de LPS dans les échantillons de SHB-SAPN purifiéavec ou sans l'étape de lavage d'isopropanol a été déterminée par un analyse cinétique de LAL. Les résultats ont indiqué que le lavage à l'isopropanol a diminué les niveaux d'endotoxine s'est élevé à 0,05 eu/g à 0,010 UE/g de protéines SHB-SAPN (tableau1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> Figure 1 : séquence et structure des protéines SHB-SAPN. (A) La séquence d'acides aminés du monomère SHB-SAPN. (B) Modèle informatique de la structure du noyau SHB-SAPN entièrement assemblé composé de 60 monomères protéiques. Schéma de couleurs pour les séquences d'acides aminés: Gris - HisTag; Vert et pentamer; Trimer conçu en bleu foncé et de novo; Bleu clair et paquet de six hélices. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> Figure 2 : Diagramme de flux de la protocole pour la production sHB-SAPN. Schéma de couleurs : Noir et expression du monomère protéique chez E. coli; Gris foncé et purification monomère; Identification gris moyen et monomère; Gris clair et repliement et caractérisation; Produit SHB-SAPN entièrement assemblé. Dans les étapes étiquetées avec gris foncé et moyen, la protéine est sous dénaturation et réduire les conditions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> Figure 3 : Purification protéique des monomères SHB-SAPN. (A) Chromatographe de la purification FPLC. La ligne verte au-dessus du chromatogramme indique les étapes de purification. La ligne bleue dans le chromatogramme représente la densité optique des fractions à 280 nm longueur d'onde. La ligne noire montre quel pourcentage de tampon B (8 M urée, 20 mM Tris, 50 mM de phosphate de sodium monobasic, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazole, pH 8,5) qui a été utilisé à chaque étape de la purification. (B) Gels SDS-PAGE des fractions mises en commun du lysate (L), écoulement à travers (FT), premier lavage (W1), lavage d'isopropanol (W2), troisième lavage (W3), et fractions individuelles de l'imidazole 150 mM (E150) et 500 mM imidazole (E500) étapes d'élution de l'ilution 150 mM (E150) et 500 mM imidazole (E500) étapes d'élution de l'ilution 150 mM (E150) et 500 mM imidazole (E500) étapes d'élution de l'ilution 150 mM (E150) et 500 mM imidazole (E500) étapes d'élution de la purification. Les marqueurs moléculaires de la première voie (M) identifient les bandes entre 10 et 250 kDa. La protéine cible est indiquée par une flèche noire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> Figure 4 : Identification de la protéine par tache occidentale. Toutes les voies sont chargées de 100 ng de protéines. (A) Résultats d'une tache occidentale avec anti-6x HisTag. (B) Résultats d'une tache occidentale avec un anticorps monoclonal 167-D-IV HIV-1. Les voies sont étiquetées comme : M et marqueur de poids moléculaire; 1 lysate; 2 - Flux à travers; 3 - premier lavage; 4 - lavage à l'isopropanol (deuxième lavage); 5 - troisième lavage; 6 - fractions de volume en commun 56-u201261 (premier pic d'élution), 7 - factions de volume en commun 62-u201267 (entre les deux pics), 8 fractions de volume en commun 68-u201278 (deuxième pic d'élution). Protéine cible avec la taille prévue de la bande de 18,07 kDa comme la bande monomeric SHB-SAPN est indiquée par une flèche noire. Les bandes supplémentaires dans les voies 7 et 8 sont des douilles, des trimers et des multimères du SHB-SAPN (flèche rouge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> Figure 5 : Caractérisation du SHB-SAPN replié. (A. Distribution de la taille des particules telle que déterminée par DLS. (B) Taille des particules déterminée par le suivi des nanoparticules (système). (C) Visualisation des particules SHB-SAPN par TEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>échantillon</td>
			<td>Endotoxine (UE/mL)</td>
			<td>Endotoxine (UE/g de protéines)</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN avec lavage d'isopropanol</td>
			<td>2.02</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN sans lavage isopropanol</td>
			<td>À la 50e</td>
			<td>0,25 euros</td>
		</tr>
<tr>
<td>Contrôle négatif</td>
			<td>En dessous du niveau de détection</td>
			<td>ne s'applique pas</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Niveaux d'endotoxine des SHB-SAPN repliés. Les niveaux d'endotoxine dans les échantillons de SHB-SAPN purifiés avec ou sans lavage d'isopropanol présentés comme unités d'endotoxine/mL et unités d'endotoxine/g de protéine DeHB-SAPN.

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Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Une méthode détaillée est fournie ici décrivant la purification, le repliement et la caractérisation des nanoparticules de protéines auto-assemblantes (SAPN) pour le développement de vaccins.

Production de E. coli-les nanoparticules de protéines auto-assemblantes exprimées pour les vaccins nécessitant une présentation de l'épitope trimmérique

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

L’auto-assemblage de nanoparticules protéiques, ou SAPNs, peut être utilisé pour développer des vaccins contre diverses maladies infectieuses. Cette méthode que nous décrivons ici peut être utilisée pour purifier, refold, et caractériser SAPNs contenant un paquet de six hélices. Cette nanoparticule peut présenter des antigènes trimériques dans une conformation indigène.Avec de légères modifications, cette méthode peut être appliquée à d’autres constructions innovantes de vaccins SAPN. En outre, il peut être facilement transférable à la production à grande échelle pour les essais cliniques. Pour la lyse d’E.coli récolté exprimant le faisceau de six hélices SAPN, utilisez une sonde avec la sortie de sonication de 150 watts avec quatre secondes de sonication et six secondes de repos, pour sonifier les granulés bactériens résuspendus en 40 millilitres de tampon sans imidazole sur la glace pendant cinq minutes.Centrifugeuse le lysate cellulaire pour générer un supernatant clarifié et transférer le supernatant à un flacon stérile de 150 millilitres. Ensuite, amener l’échantillon jusqu’à un volume final de 100 millilitres avec tampon frais sans imidazole. Pour isoler la protéine d’intérêt, ouvrez le logiciel FPLC et cliquez sur l’option Nouvelle Méthode.Dans le menu Paramètres de méthode, ouvrez le menu de dropdown de position de colonne et sélectionnez C1 Port 3. Dans le menu de dropdown Montré par technique, sélectionnez Affinity. Dans le menu de dropdown de type colonne, sélectionnez Autres, HisTrap HP et cinq millilitres.Le volume de colonne et les boîtes de pression seront automatiquement réglés sur les valeurs appropriées. Cliquez sur Le contour de la méthode et faites glisser les boutons d’application Equilibration et Sample, trois boutons de lavage de colonne et le bouton Elution du menu popup de la bibliothèque de phase à côté de la flèche avant de fermer le menu bibliothèque de phases. Cliquez sur Equilibration et définissez les valeurs indiquées dans le tableau sur le tampon initial B, le tampon final B de 4 %, 4 % et le volume de la colonne, cinq.Cliquez sur Exemple d’application. Dans la boîte de chargement de l’échantillon, cliquez sur le bouton radio pour injecter l’échantillon sur la colonne avec la pompe d’échantillon, et confirmez que la boîte à côté du taux de débit d’utilisation des paramètres de méthode est cochée dans l’injection d’échantillon avec la boîte de pompe de système. Modifiez la valeur de la boîte volume à 100 millilitres et le système de collecte fractionnée pour activer.Délectez la taille de fraction d’utilisation de la boîte paramètres de méthode et modifiez la taille de la fraction en quatre millilitres. Cliquez sur le premier bouton De lavage de colonne, définissez les valeurs énumérées dans le tableau au tampon initial B, au tampon final B de 4 %, au volume de la colonne 4 % et au volume de la colonne, 10. Cliquez sur le système de collecte fraction activer la boîte et délecter la taille fraction d’utilisation à partir des paramètres de méthode.Changez la taille de la fraction en quatre millilitres et cliquez sur le deuxième bouton De lavage de colonne. Définissez les valeurs dans le tableau au tampon initial B, au tampon final B de 0 %, à 0 % et au volume de la colonne, cinq. Cliquez sur le système de collecte fraction activer la boîte et délecter la taille fraction d’utilisation à partir des paramètres de méthode.Changez la taille fraction en quatre millilitres et cliquez sur le troisième bouton De lavage de colonne. Définissez les valeurs dans le tableau au tampon initial B, au tampon final B à 0 %, au volume de la colonne 10. Cliquez sur le système de collecte fraction activer le bouton et déchlickr la taille de fraction d’utilisation de la boîte paramètres de méthode.Ensuite, changez la taille de la fraction en quatre millilitres. Cliquez sur le bouton Elution et cliquez à droite sur les informations dans le tableau. Dans le menu pop-up, cliquez sur Supprimer l’étape et faites glisser le bouton de gradient isocratique sur la table deux fois, de sorte qu’il y ait deux entrées.Définissez la valeur de la première entrée au tampon initial B, au tampon final B de 30 %, à 30 % et au volume de la colonne, 10. Définissez la valeur de la deuxième entrée au tampon initial B, au tampon B 100 % final, au volume de 100 % et au volume de la colonne, 10. Cliquez sur le bouton Fraction Collection Scheme Enable et cliquez sur la taille fraction d’utilisation de la boîte Paramètres de méthode.Ensuite, cliquez sur Enregistrer As et nommer la purification du fichier. Placez la pompe A tube du FPLC dans le tampon de lavage sans imidazole, et la pompe B tube dans le tampon imidazole de 500 millimlaires. Placez le tube de pompe d’échantillon dans l’échantillon de 100 millilitres et exécutez le programme de purification.Lorsque le lavage isopropanol à 60 % est nécessaire, mettez le programme en pause, déplacez la pompe A du lavage sans imidazole dans le lavage à 60 % de l’isopropanol et redémarrez le programme. À la fin du lavage, interrompez à nouveau le programme, retournez le tube de la pompe A au tampon de lavage sans imidazole et redémarrez le programme de purification. Pour évaluer la pureté de la protéine purifiée, combinez d’abord les fractions du flux à travers, lavez-en une, lavez-en deux et lavez trois étapes, dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres.Ensuite, mélangez 15 microlitres de chaque tube d’échantillon avec 15 microlitres de tampon 2X Laemmli dans des tubes de microcentrifugeuse individuels de 0,5 millilitre et déliaturez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, mettre en place un appareil de fonctionnement de gel avec trois gels polyacrylamides préfabriqués sans taches de quatre à 20 % dans le tampon de fonctionnement Tris-Glycine SDS-PAGE. Chargez huit microlitres de marqueur de poids moléculaire au premier puits de chaque gel et 30 microlitres d’échantillon dénaturé vers les autres puits.Faire fonctionner les gels à 200 volts jusqu’à ce que l’avant de colorant touche le fond du gel et rincer brièvement les gels avec de l’eau déionisée avant d’imagerie immédiate avec un système d’imagerie sans taches. Ensuite, identifiez les fractions qui contiennent des bandes protéiques avec la bonne taille et mutualiser ces fractions. Pour le refolding sapn de faisceau de six hélices, ajoutez 10 à 20 millilitres de protéine mise en commun à une cassette de dialyse de coupure de poids moléculaire de 10 kilodalton.Dialyz la cassette en huit urée molaire, Tris de 20 millimolaires, 5% glycérol, et TCEP de cinq millimolaires à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain matin, diminuez la concentration d’urée dans le tampon de dialyse par étapes de deux molaire toutes les deux heures pour diagnostiquer lentement l’urée de l’échantillon. Lorsque la concentration d’urée atteint deux molaire, déplacer l’appareil de dialyse à quatre degrés Celsius et dialyser l’échantillon en urée de 120 millimlaires, tris de 20 millimolaires, et 5% glycérol pendant la nuit pour terminer le refolding.Le lendemain matin, retirez la protéine refolded de la cassette et filtrez le faisceau de six hélices SAPN par un filtre de seringue de fluorure de polyvinylidene de 0,22 micromètre. Pour mesurer la taille moyenne des particules du faisceau de six hélices SAPN, ajoutez 45 microlitres de sapn à six hélices à une cuvette jetable et placez la cuvette dans la machine DLS. Ensuite, créez un nouveau fichier de mesure et exécutez une procédure d’exploitation standard préécrite pour les protéines dans l’urée de 120 millimlaires, les tris de 20 millimolaires et le tampon glycérol de 5 % à 25 degrés Celsius.Ensuite, commencez la mesure. La taille moyenne Z, le PDI et les résultats de distribution seront calculés pour chaque course. La machine lira l’échantillon cinq fois.Ce faisceau entièrement assemblé de six hélices SAPN est construit sur des séquences protéiques qui devraient se plier en une particule qui contient 60 copies du monomère. Le lysate de cellules total a été employé pour purifier les monomères de SAPN de faisceau de six hélices par FPLC utilisant une colonne de nickel, démontrant que la protéine s’est échappée à l’imidazole de 150 et de 500 millimolar. Le chromatogramme montre également deux autres pics à 185 et 210 millilitres volume total correspondant au lavage isopropanol et le lavage imidazole-libre respectivement.Les fractions et la pureté de la protéine recombinante pourraient être identifiées par des gels SDS-PAGE dégradés avec la protéine d’intérêt principalement située dans la fraction 68 à 79. L’analyse occidentale de tache avec des anticorps anti-His et anti-167D4 a indiqué que les fractions poolées étaient en effet la protéine d’intérêt. Les taches ont également démontré la présence du paquet de six hélices SAPN multimères.Les échantillons qui contenaient les monomères protéiques d’intérêt ont été pliés dans le faisceau entièrement assemblé de six hélices SAPN par dialyse et la distribution de la taille des particules a été déterminée par LSD et l’analyse de suivi des nanoparticules. La visualisation par microscopie électronique de transmission a indiqué les particules individuelles bien formées de SAPN de faisceau de six hélices avec la distribution de taille obtenue des deux techniques de dimensionnement de particule. L’étape la plus importante de ce protocole est le refolding du paquet de six hélices SAPN.Le pH correct et la force ionique du tampon de refolding sont essentiels. À l’aide d’un lavage à l’isopropanol pendant la purification, nous avons pu réduire la contamination du LPS à un niveau très bas. Toutefois, LPS peut être réduit davantage à l’aide d’une colonne d’échange d’anion si nécessaire.Cette technologie peut être facilement adaptée à l’application humaine. Un SAPN à exprimé bactérien a déjà été mis à l’échelle pour un essai clinique sur le paludisme de phase 1/2a à venir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

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Thermodynamique du repliement des protéines membranaires mesuré par fluorescence Spectroscopie

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Recherche

Bio-ingénierie

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