Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

यह काम सैन्य चिकित्सा, इंक, और अमेरिकी रक्षा विभाग की उन्नति के लिए हेनरी एम जैक्सन फाउंडेशन के बीच एक सहकारी समझौते (W81XWH-11-2-0174) द्वारा समर्थित किया गया था। विरोधी HIV-1 gp41 mAb 167-डी चतुर्थ एंटीबॉडी NIH एड्स अभिकर्मक कार्यक्रम के माध्यम से डॉ सुसान ज़ोला-Pazner से प्राप्त किया गया था।

<ol>
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व्यक्त विचार लेखकों के उन हैं और अमेरिकी सेना या रक्षा विभाग के पदों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नहीं लगाया जाना चाहिए. पीटर Burkhard अल्फा-ओ पेप्टाइड्स एजी नामक कंपनी में रुचि है और प्रौद्योगिकी पर पेटेंट है. अन्य लेखकों इस पत्र में प्रस्तुत विषय पर एक वित्तीय ब्याज के साथ किसी भी कंपनी के साथ कोई संबद्धता या वित्तीय भागीदारी है.

Nanotechnology subunit टीका विकास के लिए कई फायदे और समाधान प्रदान करता है. नैनोवैक्सीन बार-बार एंटीजन को मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए कण के रूप में पेश कर सकता है जो इम्यूनोजेनिकिटी26को बढ़ाता है . जबकि वहाँ नैनोटीकेक के कई अलग अलग प्रकार के होते हैं, हम मानते हैं कि डे नोवो डिजाइन प्रोटीन से बना लोगों को टीका विकास1के लिए सबसे मजबूत दृष्टिकोण लग रहे हो . वे मेजबान प्रोटीन के लिए किसी भी अनुक्रम homology के बिना इंजीनियर किया जा सकता है और कम उत्पादन लागत और उच्च उत्पाद पैदावार प्रदान करते हुए देशी की तरह रचना के करीब में ब्याज की प्रतिजन पेश करते हैं. इस दृष्टिकोण का एक प्रमुख उदाहरण SAPN प्रौद्योगिकी है, जो हम कई संक्रामक रोगों के खिलाफ टीकों के लिए आवेदन किया है7. एचआईवी-1 वैक्सीन के विकास में कठिनाइयों को संबोधित करते हुए, हमने एक अद्वितीय एसएचबी-एसएएन कोर तैयार किया है ताकि वी1वी2 प्रतिजन को देशी-जैसे ट्रिमरिक कॉन्फॉर्मेशन9में प्रभावी ढंग से पेश किया जा सके। कई टीका लक्ष्य, विशेष रूप से वायरल रोगों के लिए, trimers27के रूप में मौजूद हैं. इस घटना से पता चलता है कि हमारे SAPN डिजाइन subunit टीकों के विकास के लिए व्यापक प्रभाव पड़ता है.
इस विधि में, हम एक ई. कोलाई अभिव्यक्ति प्रणाली में SHB-SAPNs का उत्पादन करने के लिए कैसे प्रदर्शित करते हैं। हम प्रोटीन की उच्च पैदावार व्यक्त (के बारे में 6 मिलीग्राम /100 संस्कृति के एमएल). प्रोटीन में 10 हिस्टोडिन होते थे और नी2+ कॉलम के साथ एक स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके आसानी से शुद्ध किया गया था। उनके टैग की यह लंबाई उच्चतम प्रोटीन उपज के लिए इष्टतम पाया गया. शुद्ध प्रोटीन डिजाइन प्रोटीन की पूर्ण लंबाई के रूप में दोनों एन-टर्मिनल HisTag और सी टर्मिनल heptad दोहराने की उपस्थिति से संकेत निहित. हम व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं तकनीक का उपयोग किया और उन्हें अभिव्यक्ति, उत्पादन, और SHB-SAPN कोर की विशेषता के लिए अनुकूलित. एक नया प्रोटीन एपिटोप युक्त एक SAPN के विकास के दौरान पूर्ण लंबाई प्रोटीन के उत्पादन की कमी मेजबान सेल में जीन की अभिव्यक्ति की समस्या का संकेत हो सकता है. यदि ऐसा होता है, जीन और अभिव्यक्ति प्रणाली बदल दिया और वर्णित प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. sonication समय या तीव्रता के संशोधन भी भविष्यवाणी की पूर्ण लंबाई प्रोटीन की एकाग्रता में वृद्धि हो सकती है.
Refolded कणों की उम्मीद आकार रेंज में थे (20 से 100 एनएम)8,24,25 के रूप में डीएलएस और नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा निर्धारित. इन परिणामों को आगे TEM का उपयोग करके पुष्टि की गई. यदि इस चरण में समस्याएं हैं, यह सामान्य रूप से पीएच या refolding बफर के आयनिक शक्ति के साथ एक समस्या के कारण है. जब कण आकार तकनीक पर बड़े आकार के कणों का पता लगाया जाता है, तो यह एकत्रीकरण को इंगित करता है, जिसे रीफोल्ड बफर के पीएच को बढ़ाकर बचा या जा सकता है। यदि कणों डीएलएस द्वारा पता नहीं कर रहे हैं, प्रोटीन की एकाग्रता की पुष्टि करें और बफर के पीएच की जाँच करें। डीएलएस के लिए अंतिम प्रोटीन एकाग्रता कम से कम 100 g/ यदि एकाग्रता समस्या नहीं है, यह छोटे, अपूर्ण रूप से गठित कणों की बहुतायत को इंगित करता है, जिनकी एकाग्रता पीएच को कम करके कम की जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, सोडियम क्लोराइड एकाग्रता इष्टतम रेंज के लिए समायोजित किया जा सकता है अवांछित आकार के साथ कणों की उपस्थिति को कम करने के लिए.
अंत में, शुद्धि के दौरान एक आइसोप्रोपेनोल धोने के कदम का उपयोग करके हम मेजबान ई. कोलाई से 0.01 यूरोपीय संघ / 28. इस स्तर को एक आयन विनिमय स्तंभ का उपयोग करके और भी कम किया जा सकता है Q स्तंभ के रूप में जाना जाता है। यदि endotoxin के उच्च स्तर अभी भी मौजूद हैं, सभी सामग्री है कि बफर तैयारी के लिए इस्तेमाल किया गया जाँच करें. इस विधि में केवल depyrogenated ग्लासवेयर और endotoxin मुक्त प्लास्टिक के बर्तन का उपयोग करने के लिए याद रखें.
इन परिणामों से संकेत मिलता है कि हम सफलतापूर्वक SHB-SAPN कोर है कि पूर्व नैदानिक प्रतिरक्षण अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उत्पादन करने के लिए एक विधि विकसित की है. केवल मामूली संशोधनों के साथ इस विधि, यदि कोई हो, SHB-SAPNs के शुद्धिकरण के लिए लागू किया जा सकता है जब ब्याज की एक प्रतिजन जोड़ा जाता है. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस विधि का उपयोग प्रमुख परिवर्तनों में से एक elution कदम में है. विभिन्न इमिडाज़ोल सांद्रता में विभिन्न प्रोटीन एल्यूट जो प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किए जाने चाहिए। अन्य प्रमुख अंतर refolding बफर की संरचना हो सकती है. अनुकूलन विभिन्न पीएच शर्तों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आयनिक शक्तियों के परीक्षण की आवश्यकता होगी.
भविष्य के काम को ध्यान में रखते हुए, SHB-SAPN के मानव आवेदन की अनुमति देने के लिए केवल दो मामूली संशोधनों की आवश्यकता है। पहला यह है किमनुष्योंमें एम्पसिलिन एलर्जी के कारण अभिव्यक्ति वेक्टर को कानामाइसिन प्रतिरोध चयन मार्कर में बदलने की आवश्यकता है . मानव उपयोग के लिए प्रोटीन विनिर्माण की अन्य प्रमुख आवश्यकता पशु उत्पाद मुक्त मीडिया में SHB-SAPN का उत्पादन करने के लिए है। एक छोटे पैमाने पर अध्ययन पहले से ही एक संयंत्र आधारित मीडिया में प्रोटीन की उचित उपज का संकेत दिया. यहाँ प्रस्तुत काम आसानी से परम जीएमपी उत्पादन के लिए स्केलेबल के रूप में एक मलेरिया टीका उम्मीदवार, FMP01416के साथ प्रदर्शन किया है. इस बड़े पैमाने पर FMP014-SAPN उत्पादन दोनों anion विनिमय और अंतिम उत्पाद से LPS और Ni2 + सामग्री को कम करने के लिए धन विनिमय कदम शामिल थे। यह जीवाणु-एक्सप्रेस्ड एसएपीएन को आगामी चरण 1/2a नैदानिक परीक्षण के लिए पहले ही बढ़ाया जा चुका है।

जबकि पारंपरिक वैक्सीन विकास निष्क्रिय या क्षीण रोगजनकों पर ध्यान केंद्रित किया है, आधुनिक टीकों का ध्यान सबयूनिट टीकों1की ओर स्थानांतरित कर दिया गया है। इस दृष्टिकोण एक और अधिक लक्षित प्रतिक्रिया करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और संभावित रूप से अधिक प्रभावशाली टीका उम्मीदवारों. तथापि, मुख्य कमियों में से एक यह है कि सबयूनिट टीके पूरे जीवों की तरह कण नहीं होते हैं जिसके परिणामस्वरूप इम्यूनोजेनिकिटी2कम हो सकती है। दोहराव वाले प्रतिजन प्रदर्शन प्रणाली के रूप में एक नैनोकण में लक्षित सबयूनिट वैक्सीन दृष्टिकोण के साथ - साथ पूरे जीव की कणिक प्रकृति1,3दोनों के लाभ हो सकते हैं .
Nanovaccines के मौजूदा प्रकार के अलावा, तर्कसंगत रूप से डिजाइन प्रोटीन विधानसभाओं डिजाइन और टीका उम्मीदवारों के विकास के लिए अनुमति देते हैं कि एक देशी की तरह रचना1,4 में संभावित प्रतिजन के कई प्रतियां पेश कर सकते हैं ,5,6. इन प्रोटीन विधानसभाओं का एक उदाहरण स्व-समुच्चय प्रोटीन नैनोकणों (एसएएन)7हैं। SAPNs coiled-coil डोमेन पर आधारित हैं और पारंपरिक रूप से Escherichia कोलाई8में व्यक्त कर रहे हैं. एसएपीएन वैक्सीन उम्मीदवारों को मलेरिया, सार्स, इन्फ्लूएंजा, टोक्सोपलोसिस, और एचआईवी-1 9,10,11,12,13 जैसे विभिन्न रोगों के लिए विकसित किया गया है , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. प्रत्येक एसएपिन उम्मीदवार का डिजाइन ब्याज के रोगज़नक़ के लिए विशिष्ट है, तथापि, उत्पादन, शोधन, और refolding तकनीक आम तौर पर मोटे तौर पर लागू होते हैं.
हमारे वर्तमान हितों में से एक एक प्रभावी एचआईवी-1 टीका है. RV144 में - एक एचआईवी-1 टीके का एकमात्र चरण III नैदानिक परीक्षण जो मामूली प्रभावकारिता का प्रदर्शन करता था-संक्रमण का कम जोखिम लिफाफा प्रोटीन20,21के V1V2 लूप से आईजीजी एंटीबॉडी के साथ संबंधित था . इस क्षेत्र की देशी-समान त्रिमकी प्रस्तुति को सुरक्षात्मक इम्यूनोजेनिकता22के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है। संभव के रूप में देशी की तरह रचना के करीब के रूप में V1V2 पाश पेश करने के लिए, हम सिद्धांत SAPN टीका उम्मीदवार है कि एचआईवी-1 लिफाफा पोस्ट-फ्यूजन छह-हेलिक्स बंडल (SHB) शामिल का एक सबूत विकसित करने के लिए सही अनुरूपता 9 में V1V2 पाश पेश . इस उम्मीदवार एचआईवी-1 लिफाफा प्रोटीन के लिए जाना जाता मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त किया गया था। चूहे V1V2-SHB-SAPN के साथ प्रतिरक्षित V1V2 विशिष्ट एंटीबॉडी उठाया, कि, सबसे महत्वपूर्ण बात, gp70 V1V2 के लिए बाध्य, सही conformational epitopes9. SHB-SAPN कोर एचआईवी-1 V1V2 पाश के लिए एक वाहक के रूप में भूमिका से परे अन्य कार्य हो सकता है. यहाँ हम अभिव्यक्ति, शुद्धि, refolding, और SHB-SAPN कोर के सत्यापन के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन. अनुक्रम चयन, नैनोकण डिजाइन, आणविक क्लोनिंग, और ई. कोलाई के परिवर्तन पहले9वर्णित किया गया है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

स्व-एसेंबलिंग प्रोटीन नैनोकणों (SAPNs) दोहराए एंटीजन प्रदर्शित करता है के रूप में कार्य और विभिन्न संक्रामक रोगों के लिए टीकों की एक विस्तृत श्रृंखला विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस लेख में हम एक छह-हेलिक्स बंडल (SHB) विधानसभा है कि एक trimeric conformation में प्रतिजनों को पेश करने में सक्षम है युक्त एक SAPN कोर का उत्पादन करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन. हम एक ई. कोलाई प्रणाली में SHB-SAPN की अभिव्यक्ति का वर्णन है, साथ ही आवश्यक प्रोटीन शुद्धि कदम. हम अवशिष्ट जीवाणु lipopolysaccharide को कम करने के लिए एक आइसोप्रोपेनोल धोने कदम शामिल थे। प्रोटीन पहचान और शुद्धता का एक संकेत के रूप में, प्रोटीन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण में ज्ञात monoclonal एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की. refolding के बाद, कणों का आकार अपेक्षित रेंज में गिर गया (20 से 100 एनएम), जो गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन, नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण, और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई थी। यहाँ वर्णित पद्धति SHB-SAPN के लिए अनुकूलित है, हालांकि, केवल मामूली संशोधनों के साथ यह अन्य SAPN constructs पर लागू किया जा सकता है। इस विधि को भी आसानी से मानव टीकों के लिए जीएमपी विनिर्माण के लिए बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए हस्तांतरणीय है.

यहाँ दिखाया गया पूर्ण रूप से इकट्ठा SHB-SAPN प्रोटीन अनुक्रमों पर बनाया गया है (चित्र 1A) जो एक कण में गुना करने की भविष्यवाणी की जाती है जिसमें मोनोमर की 60 प्रतियां होती हैं (चित्र 1ख) । चित्र 2 SHB-SAPN कोर के उत्पादन, शुद्धिकरण, और पहचान के लिए विधि की एक रूपरेखा प्रदान करता है। ई. कालाई एक ग्लिसरोल स्टॉक है कि SHB-SAPN कोर के जीन अनुक्रम के साथ एक pPep-T अभिव्यक्ति वेक्टर शामिल से BL21 (DE3) ई. कोलाई में प्रेरित किया गया. बैक्टीरियल कोशिकाओं को सफलतापूर्वक विकसित किया गया और denaturing और शर्तों को कम करने के तहत lysed.
कुल सेल lysate एक Ni2 + कॉलम का उपयोग कर FPLC द्वारा SHB-SAPN monomers शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्र 3A) . एफपीएलसी क्रोमैटोग्राफ दर्शाता है कि प्रोटीन 150 एमएम और 500 एमएम इमिडाज़ोल (चित्र 3क) दोनों पर किया जाता है। क्रोमैटोग्राम भी 185 एमएल और 210 एमएल कुल मात्रा isopropanol धोने और imidazole मुक्त धोने के लिए इसी पर दो अन्य चोटियों से पता चलता है, क्रमशः. पुनः संयोजक प्रोटीन के अंश और शुद्धता की पहचान ग्रेडिएंट एसडीएस-पेज जैल द्वारा की गई थी (चित्र 3ख)। ब्याज की प्रोटीन मुख्य रूप से भिन्न में स्थित था 68]u2201279 (278$u2012300 एमएल कुल मात्रा). इन अंशों को आगे के विश्लेषण ों के लिए संयोजित किया गया। पश्चिमी दाग-विरोधी-हिस एंटीबॉडी (एन-टर्मिनल) और 167-डी-IV एंटीबॉडी (सी-टर्मिनस) के साथ पश्चिमी दाग ने संकेत दिया कि जमा हुए भिन्न वास्तव में ब्याज का प्रोटीन थे (चित्र 4क, बी)। इन धब्बों ने एसएचबी-एसएपिन मल्टीमर्स की उपस्थिति का भी प्रदर्शन किया। पहले washes और elution भिन्न बहुmerized प्रोटीन की एक उच्च एकाग्रता होते थे और इसलिए बाहर रखा गया.
ब्याज की प्रोटीन monomers निहित नमूने डायलिसिस द्वारा पूरी तरह से इकट्ठे SHB-SAPN में जोड़ रहे थे. कण आकार वितरण डीएलएस और नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था (चित्र 5ए, बी)। डीएलएस 67 एनएम की एक $ औसत ऊष्मागतिक व्यास के साथ कणों की पहचान की, जबकि NTA प्रणाली 81 एनएम का एक मतलब आकार मापा. मामूली आकार अंतर कण आकार तकनीक के कारण थे, लेकिन दोनों विश्लेषण से आकार की उम्मीद की सीमा में थे 20u2012100 एनएम8,24,25. SHB-SAPNs TEM द्वारा कल्पना की गई और छवियों को दो कण आकार तकनीकों से प्राप्त आकार वितरण के साथ अच्छी तरह से तैयार व्यक्तिगत कणों से पता चला (चित्र 5C)।
प्रोटीन की शुद्धि के दौरान, स्तंभ अंतिम SHB-SAPN उत्पाद में एलपीएस संदूषण को कम करने के लिए आइसोप्रोपेनोल के साथ धोया गया था। यदि endotoxin स्तर प्रतिरक्षण के लिए स्वीकार्य था सत्यापित करने के लिए, SHB-SAPN नमूनों में एलपीएस की एकाग्रता के साथ या isopropanol धोने कदम के बिना शुद्ध एक गतिज लाल परख द्वारा निर्धारित किया गया था. परिणामों से संकेत मिलता है कि आइसोप्रोपेनॉल वॉश ने एंडोटॉक्सिन के स्तर को कम कर दिया है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> चित्र 1: SHB-SAPN प्रोटीन अनुक्रम और संरचना. (ए) एसएचबी-एसएएन मोनोमर का एमिनो एसिड अनुक्रम। (बी) पूरी तरह से इकट्ठे एसएचबी-एसएपीएन कोर की संरचना का कंप्यूटर मॉडल जिसमें 60 प्रोटीन मोनोमर होते हैं। एमिनो एसिड दृश्यों के लिए रंग योजना: ग्रे ] HisTag; ग्रीन ] पेंटामर; गहरे नीले रंग की जेड डे नोवो डिजाइन ट्रिमर; हल्के नीले रंग - छह हेलिक्स बंडल. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> चित्र 2: फ़्लोचार्ट का SHB-SAPN उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल| रंग योजना: ई. कोलाईमें प्रोटीन मोनोमर की ब्लैक एक्सप्रेशन ; डार्क ग्रे ] मोनोमर शुद्धिकरण; मध्यम ग्रे ] मोनोमर पहचान; हल्का ग्रे ] refolding और विशेषता; व्हाइट - पूरी तरह से इकट्ठे SHB-SAPN उत्पाद. अंधेरे और मध्यम ग्रे के साथ लेबल चरणों में, प्रोटीन denaturing और शर्तों को कम करने के तहत है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> चित्र 3: SHB-SAPN monomers के प्रोटीन शुद्धि| (ए) FPLC शुद्धि से Chromatograph. क्रोमैटोग्राम के ऊपर हरी रेखा शुद्धि चरणों को इंगित करती है। वर्णलेख में नीली रेखा 280 एनएम तरंगदैर्ध्य पर भिन्नों के ऑप्टिकल घनत्व का प्रतिनिधित्व करती है। काली रेखा से पता चलता है कि शुद्धीकरण के प्रत्येक चरण में उपयोग किए गए बफर बी (8 एम यूरिया, 20 एमएम ट्राइस, 50 एमएम सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक, 5 एमएम टीसीपी, 500 एमएम इमिडाज़ोल, पीएच 8.5) का प्रतिशत क्या है। (B) एसडीएस-पेज जैल से जमा भिन्नों के lysate (L), प्रवाह के माध्यम से (एफटी), पहले धोने (W1), isopropanol धोने (W2), तीसरे धोने (W3), और 150 m imidazole (E150) और 500 m imidazole (Elution) elution के elution से अलग-अलग अंश शोधन. पहली लेन (एम) में आण्विक मार्कर 10 और 250 केडीए के बीच बैंड की पहचान करते हैं। लक्ष्य प्रोटीन एक काले तीर से संकेत दिया है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> चित्र 4: पश्चिमी धब्बा द्वारा प्रोटीन की पहचान। सभी गलियों में 100 एनजी प्रोटीन भरा हुआ है। (ए) एंटी-6x हिस्टैग के साथ एक पश्चिमी दाग का परिणाम। (ख) 167-डी-IV एचआईवी-1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एक पश्चिमी दाग के परिणाम। लेन के रूप में चिह्नित कर रहे हैं: एम $ आणविक वजन मार्कर; 1 ] lysate; 2 के माध्यम से प्रवाह; 3 - पहले धोने; 4 ] आइसोप्रोपेनॉल वॉश (दूसरा धोने); 5 ] तीसरा धोने; 6 [पूल्ड मात्रा भिन्न 56]u201261 (पहली elution चोटी), 7 ] जमा मात्रा गुटों 62]u201267 (दो चोटियों के बीच), 8 ] जमा मात्रा भिन्न 68 ]u201278 (दूसरी elution चोटी). एक काले तीर द्वारा संकेत दिया है के रूप में 18.07 kDa की उम्मीद बैंड आकार के साथ लक्ष्य प्रोटीन. गलियों में अतिरिक्त बैंडिंग 7 और 8 dimers, trimers, और SHB-SAPN (लाल तीर) के multimers हैं. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> चित्र 5: पुन: फ़ोल्ड SHB-SAPN का वर्णीकरण. (ए) कण आकार वितरण के रूप में डीएलएस द्वारा निर्धारित. (बी) कण आकार के रूप में नैनोकण ट्रैकिंग (सिस्टम) द्वारा निर्धारित. (ग) टीईएम द्वारा एसएचबी-एसएएन कणों का दृश्य। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>नमूना</td>
			<td>एंडोटॉक्सिन (ईयू/</td>
			<td>एंडोटॉक्सिन (ईयू/</td>
		</tr>
<tr>
<td>इसोप्रोपेनॉल वॉश के साथ एसएपीएन</td>
			<td>2.02</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>इसोप्रोपेनॉल वॉश के बिना एसएपीएन</td>
			<td>और 50</td>
			<td>०.२९</td>
		</tr>
<tr>
<td>नकारात्मक नियंत्रण</td>
			<td>पता लगाने के स्तर के नीचे</td>
			<td>एन/ए</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: refolded SHB-SAPNs के Endotoxin स्तर. एसएचबी-एसएपीएन नमूनों में एंडोटॉक्सिन स्तर एक आइसोप्रोपेनोल वॉश के साथ या बिना शुद्ध, एंडोटॉक्सिन इकाइयों/एमएल और एंडोटॉक्सिन इकाइयों/जेडजी ऑफ एसएचबी-एसएपीएन प्रोटीन के रूप में प्रस्तुत किया गया है।

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Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

एक विस्तृत विधि यहाँ टीका विकास में उपयोग के लिए आत्म इकट्ठा प्रोटीन नैनोकणों (SAPNs) के शुद्धि, refolding, और विशेषता का वर्णन प्रदान की जाती है।

टीके के लिए ई. कोलाई-एक्सप्रेस्ड स्व-एसम्बेलिंग प्रोटीन नैनोकणों का उत्पादन, ट्राइमेरिक एपिटोप प्रस्तुति की आवश्यकता होती है

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

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Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

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