Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da un accordo di cooperazione (W81XWH-11-2-0174) tra la Henry M Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc., e il Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti. L'anticorpo anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV è stato ricevuto dalla dott.ssa Susan s'olla-Pazner attraverso il NIH AIDS Reagent Program.

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Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non devono essere interpretate per rappresentare le posizioni dell'esercito americano o del Dipartimento della Difesa. Peter Burkhard ha un interesse per l'azienda Alpha-O Peptides AG e ha brevetti sulla tecnologia. Gli altri autori non hanno alcuna affiliazione o coinvolgimento finanziario con alcuna società con un interesse finanziario sull'argomento presentato in questo documento.

La nanotecnologia offre molti vantaggi e soluzioni per lo sviluppo di vaccini di sottounità. I nanovaccine possono presentare ripetutamente gli antigeni come particolato al sistema immunitario ospite aumentando l'immunogenicità26. Mentre ci sono molti tipi diversi di nanovaccino, crediamo che quelli composti da proteine de novo progettati sembrano essere l'approccio più forte per lo sviluppo del vaccino1. Possono essere progettati senza alcuna sequenza omemologia alle proteine ospiti e presentano l'antigene di interesse per la conformazione simile a quella nativa, fornendo allo stesso tempo bassi costi di produzione e alte rese di prodotto. Un primo esempio di questo approccio è la tecnologia SAPN, che abbiamo applicato ai vaccini contro molteplici malattie infettive7. Affrontando le difficoltà nello sviluppo di vaccini HIV-1, abbiamo progettato un nucleo SHB-SAPN unico per presentare efficacemente l'antigene V1V2 in una conformazione trimerica nativa9. Molti obiettivi del vaccino, in particolare per le malattie virali, sono presenti come trimer27. Questo fenomeno indica che la nostra progettazione SAPN ha ampie implicazioni per lo sviluppo di vaccini di sottounità.
In questo metodo viene illustrato come produrre SHB-SAPNs in un sistema di espressione E. coli. Abbiamo espresso elevate rese di proteine (circa 6 mg/100 mL di coltura). La proteina conteneva 10 istidine ed era facilmente purificata utilizzando una cromatografia di affinità metallica immobilizzata con colonna Ni 2. Questa lunghezza della His-Tag è stata trovata come l'ideale per la più alta resa proteica. La proteina purificata conteneva l'intera lunghezza della proteina progettata, come indicato dalla presenza sia del N-terminal EPtad che della ripetizione del terminale C heptad. Abbiamo utilizzato tecniche ampiamente accettate e le abbiamo ottimizzate per l'espressione, la produzione e la caratterizzazione del core SHB-SAPN. La mancanza di produzione della proteina a lunghezza intera durante lo sviluppo di un SAPN contenente un nuovo epitopo proteico potrebbe indicare un problema di espressione del gene nella cellula ospite. In tal caso, il gene e il sistema di espressione devono essere riprogettati e adattati al protocollo descritto. La modifica del tempo di sonicazione o dell'intensità può anche aumentare la concentrazione della proteina a lunghezza intera prevista.
Le particelle ripiegate erano nell'intervallo di dimensioni previsto (da 20 a 100 nm)8,24,25 come determinato dall'analisi di DLS e monitoraggio delle nanoparticelle. Questi risultati sono stati ulteriormente confermati dall'utilizzo di TEM. Se ci sono problemi in questo passaggio, è normalmente dovuto a un problema con il pH o la forza ionica del buffer di ripiegamento. Quando vengono rilevate particelle di grandi dimensioni sulle tecniche di dimensionamento delle particelle, ciò indica l'aggregazione, che può essere evitata aumentando il pH del buffer di ripiegamento. Se le particelle non vengono rilevate da DLS, verificare la concentrazione della proteina e controllare il pH del buffer. La concentrazione finale delle proteine per la DLS deve essere di almeno 100 g/mL. Se la concentrazione non è il problema, indica l'abbondanza di piccole particelle incompletamente formate, la cui concentrazione può essere ridotta diminuendo il pH. In alternativa, la concentrazione di cloruro di sodio può essere regolata alla gamma ottimale per ridurre al minimo la presenza di particelle con dimensioni indesiderate.
Infine, utilizzando una fase di lavaggio dell'isopropanolo durante la purificazione siamo stati in grado di ridurre la contaminazione LPS dall'host E. coli a 0,01 UE/G di SAPN che è al di sotto del limite della Food and Drug Administration (FDA) di 5 EU/kg di peso corporeo per i prodotti iniettabili 28. Questo livello può essere ulteriormente ridotto utilizzando una colonna di scambio di anion nota anche come colonna Q. Se sono ancora presenti alti livelli di endotossina, controllare tutti i materiali utilizzati per la preparazione del tampone. Ricordatevi di utilizzare solo vetro depyrogenated e plastica senza endotossina in questo metodo.
Questi risultati indicano che abbiamo sviluppato con successo un metodo per produrre il nucleo SHB-SAPN che può essere utilizzato per studi di immunizzazione pre-clinica. Questo metodo con solo lievi modifiche, se presenti, può essere applicato alla purificazione di SHB-SAPNs quando viene aggiunto un antigene di interesse. Utilizzando questo metodo come punto di partenza una delle principali modifiche è nella fase di eluizione. Proteine diverse evengono a diverse concentrazioni di imidazole che devono essere determinate sperimentalmente. L'altra differenza principale potrebbe essere la composizione del buffer di ripiegamento. L'ottimizzazione richiederebbe test di diverse condizioni di pH e punti di forza ionici.
In considerazione del lavoro futuro, sono necessarie solo due lievi modifiche per consentire l'applicazione umana della SHB-SAPN. Il primo è che il vettore di espressione deve essere cambiato in un marcatore selezionabile di resistenza alla kanamicicina a causa dell'allergia all'anguillina nell'uomo29. L'altro grande requisito della produzione di proteine per uso umano è quello di produrre lo SHB-SAPN in supporti animali-free. Uno studio su piccola scala ha già indicato una resa ragionevole di proteine in un supporto vegetale. Il lavoro qui presentato è facilmente scalabile per la produzione di GMP finale come dimostrato con un candidato vaccino antimalarico, FMP01416. Questa produzione FMP014-SAPN su larga scala includeva sia lo scambio di anion che i passaggi di scambio per ridurre ulteriormente i contenuti LPS e Ni2 o più dal prodotto finale. Questo SAPN espresso batterico è già stato aumentato per un imminente studio clinico di fase 1/2a.

Mentre lo sviluppo tradizionale dei vaccini si è concentrato sugli agenti patogeni inattivati o attenuati, l'attenzione dei vaccini moderni si è spostata verso i vaccini delle sottounità1. Questo approccio può portare a una risposta più mirata e potenzialmente a i candidati al vaccino più efficaci. Tuttavia, uno dei principali inconvenienti è che i vaccini delle sottounità non sono particolati come organismi interi che possono portare a una ridotta immunogenicità2. Una nanoparticella come sistema di visualizzazione antigene ripetitivo può avere i benefici sia dell'approccio mirato al vaccino delle sottounità sia della natura del particolato dell'intero organismo1,3.
Tra i tipi esistenti di nanovaccino, le assemblee proteiche progettate razionalmente consentono la progettazione e lo sviluppo di candidati vaccino in grado di presentare più copie dell'antigene potenzialmente in una conformazione nativa1,4 ,5,6. Un esempio di questi gruppi proteici sono le nanoparticelle proteiche auto-assemblanti (SAPN)7. I SAPN si basano su domini a bobina e sono tradizionalmente espressi in Escherichia coli8. I candidati al vaccino SAPN sono stati sviluppati per una varietà di malattie come la malaria, la SARS, l'influenza, la toxoplasmosi e l'HIV-19,10,11,12,13 , 14 Del sistema , 15 Mi lasa del sistema , 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19. La progettazione di ciascun candidato SAPN è specifica per l'agente patogeno di interesse, tuttavia, le tecniche di produzione, purificazione e ripiegamento sono generalmente ampiamente applicabili.
Uno dei nostri interessi attuali è un vaccino efficace per l'HIV-1. In RV144, l'unico studio clinico di fase III di un vaccino HIV-1 che ha dimostrato una modesta efficacia, il ridotto rischio di infezione è stato correlato con gli anticorpi IgG al ciclo V1V2 della proteina dell'involucro20,21. La presentazione trimeric nativa di questa regione è pensata per essere importante per l'immunogenicità protettiva22. Per presentare il circuito V1V2 il più vicino possibile alla conformazione nativa, abbiamo sviluppato una prova di principio del candidato del vaccino SAPN che conteneva l'involucro HIV-1 del pacchetto di sei elicoivi (SHB) per presentare il circuito V1V2 nella corretta conformazione9 . Questo candidato è stato riconosciuto da noti anticorpi monoclonali alla proteina dell'involucro HIV-1. I topi immunizzati con V1V2-SHB-SAPN hanno sollevato anticorpi specifici V1V2, che, soprattutto, sono legati a gp70 V1V2, l'epitope conformazionale 9. Il core SHB-SAPN potrebbe avere altre funzioni oltre il ruolo di vettore per il ciclo HIV-1 V1V2. Qui viene descritta una metodologia dettagliata per l'espressione, la purificazione, la ripiegatura e la convalida del core SHB-SAPN. La selezione della sequenza, la progettazione delle nanoparticelle, la clonazione molecolare e la trasformazione di E. coli sono state descritte in precedenza9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

Le nanoparticelle proteiche auto-assemblanti (SAPN) funzionano come display di antigene ripetitivo e possono essere utilizzate per sviluppare un'ampia gamma di vaccini per diverse malattie infettive. In questo articolo viene illustrato un metodo per produrre un nucleo SAPN contenente un assembly di fascio di sei elica (SHB) in grado di presentare gli antigeni in una conformazione trimerica. Descriviamo l'espressione della SHB-SAPN in un sistema E. coli, così come le necessarie fasi di purificazione delle proteine. Abbiamo incluso un passaggio di lavaggio isopropanolo per ridurre il lipopolisicoaccharide batterico residuo. Come indicazione dell'identità e della purezza delle proteine, la proteina ha reagito con anticorpi monoclonali noti nelle analisi delle macchie occidentali. Dopo la ripiegamento, la dimensione delle particelle è diminuita nell'intervallo previsto (20-100 nm), che è stato confermato dalla dispersione dinamica della luce, dall'analisi del monitoraggio delle nanoparticelle e dalla microscopia elettronica a trasmissione. La metodologia qui descritta è ottimizzata per SHB-SAPN, tuttavia, con solo lievi modifiche può essere applicata ad altri costrutti SAPN. Questo metodo è anche facilmente trasferibile alla produzione su larga scala per la produzione di GMP per vaccini umani.

L'assieme SHB-SAPN completamente assemblato qui si basa sulle sequenze proteiche (Figura 1A) che si prevede si ripieghino in una particella che contiene 60 copie del monomero (Figura 1B). Nella Figura 2 viene fornita una descrizione del metodo per la produzione, la purificazione e l'identificazione del core SHB-SAPN. E. coli da uno stock di glicerolo che conteneva un vettore di espressione pPep-T con sequenza genica del nucleo SHB-SAPN sono stati indotti in BL21 (DE3) E. coli. Le cellule batteriche sono state coltivate e lismi con successo in condizioni di denatura e riduzione.
Il lisato totale delle cellule è stato utilizzato per purificare i monomeri SHB-SAPN da FPLC utilizzando una colonna Ni2 s (Figura 3A). Il cromatografo FPLC dimostra che la proteina si è eluita sia a 150 mM che a 500 mM di imidazolo (Figura 3A). Il cromatogramma mostra anche altri due picchi a 185 mL e 210 mL di volume totale corrispondente al lavaggio isopropanolo e al lavaggio senza imidazole, rispettivamente. Le frazioni e la purezza della proteina ricombinante sono state identificate da gel sfumati SDS-PAGE (Figura 3B). La proteina di interesse si trovava principalmente in frazioni 68-u201279 (278-u2012300 mL volume totale). Queste frazioni sono state combinate per ulteriori analisi. La macchia occidentale con anticorpo (N-terminale) e 167-D-IV anticorpo (C-terminus) indicava che le frazioni raggruppate erano effettivamente la proteina di interesse (Figura 4A,B). Queste macchie hanno anche dimostrato la presenza dei multimeri SHB-SAPN. I fuchi e le frazioni di eluizione precedenti tendevano a contenere una maggiore concentrazione di proteine multimerizzate e sono stati quindi esclusi.
I campioni che contenevano i monomeri proteici di interesse sono stati ripiegati nella SHB-SAPN completamente assemblata dalla dialisi. La distribuzione delle dimensioni delle particelle è stata determinata dall'analisi delle DLS e del monitoraggio delle nanoparticelle (Figura5A,B). Il DLS ha identificato particelle con un diametro idrodinamico medio di 67 nm, mentre il sistema NTA misurava una dimensione media di 81 nm. Le lievi differenze di dimensioni erano dovute alle tecniche di dimensionamento delle particelle, tuttavia le dimensioni di entrambe le analisi erano nell'intervallo previsto di 20-u2012100 nm8,24,25. Gli SHB-SAPN sono stati visualizzati da TEM e le immagini hanno mostrato particelle ben formate con la distribuzione delle dimensioni ottenuta dalle due tecniche di dimensionamento delle particelle (Figura 5C).
Durante la purificazione della proteina, la colonna è stata lavata con isopropanolo per diminuire la contaminazione da LPS nel prodotto finale SHB-SAPN. Per verificare se il livello di endotossina fosse accettabile per l'immunizzazione, la concentrazione di LPS nei campioni SHB-SAPN purificata con o senza la fase di lavaggio dell'isopropanolo è stata determinata da un test cinetico LAL. I risultati hanno indicato che il lavaggio dell'isopropanolo ha ridotto i livelli di endotossina da >0,25 UE/g a 0,010 UE/g della proteina SHB-SAPN (Tabella 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> Figura 1: Sequenza e struttura della proteina SHB-SAPN. (A) Sequenza di amminoacidi del monomero SHB-SAPN. (B) Modello computerizzato della struttura del nucleo SHB-SAPN completamente assemblato costituito da 60 monomeri proteici. Combinazione di colori per le sequenze di amminoacidi: Grigio - HisTag; Verde : pentamer; Taglio blu scuro - de novo; Azzurro- fascio di sei elica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> Figura 2: Diagramma di flusso del per la produzione SHB-SAPN. Schema di colori: Nero - espressione del monomero proteico in E. coli; Grigio scuro - purificazione del monomero; Grigio medio : identificazione del monomero; Grigio chiaro: ripiegamento e caratterizzazione; Bianco: prodotto SHB-SAPN completamente assemblato. Nei gradini etichettati con grigio scuro e medio, la proteina è sotto condizioni di denatura e riduzione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> Figura 3: Purificazione proteica dei monomeri SHB-SAPN. (A) Cromatografo dalla purificazione FPLC. La linea verde sopra il cromatogramma indica i passaggi di purificazione. La linea blu nel cromatogramma rappresenta la densità ottica delle frazioni a 280 nm di lunghezza d'onda. La linea nera mostra quale percentuale di buffer B (8 M urea, 20 mM Tris, 50 mM di fosfato di sodio monobasico, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazole, pH 8.5) che è stato utilizzato in ogni fase della purificazione. (B) Gel SDS-PAGE delle frazioni raggruppate (L), flusso attraverso (FT), primo lavaggio (W1), lavaggio isopropanolo (W2), terzo lavaggio (W3) e frazioni individuali dai gradini di emidazole (E150) e 500 mM imidazole (E500) Purificazione. I marcatori molecolari nella prima corsia (M) identificano bande comprese tra 10 e 250 kDa. La proteina bersaglio è indicata da una freccia nera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> Figura 4: Identificazione della proteina da parte di macchie occidentali. Tutte le corsie sono caricate con 100 ng di proteine. (A) Risultati di una macchia occidentale con HisTag anti-6x. (B) Risultati di una macchia occidentale con un anticorpo monoclonale 167-D-IV HIV-1. Le corsie sono etichettate come: M - marcatore di peso molecolare; 1 - lisato; 2 - Flusso; 3 - primo lavaggio; 4 - lavaggio isopropanolo (secondo lavaggio); 5 - terzo lavaggio; 6 - frazioni di volume raggruppate 56-u201261 (primo picco di elusione), 7 fazioni di volume raggruppate 62-u201267 (tra i due picchi), 8 frazioni di volume raggruppate 68-u201278 (secondo picco di elusione). Proteina di destinazione con la dimensione prevista della banda di 18,07 kDa in quanto la banda monomerica SHB-SAPN è indicata da una freccia nera. Banding extra nelle corsie 7 e 8 sono dimer, trimer e multimers della SHB-SAPN (freccia rossa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> Figura 5: caratterizzazione dell'oggetto SHB-SAPN ripiegato. (A). Distribuzione delle dimensioni delle particelle come determinato da DLS. (B) Dimensione delle particelle determinata dal tracciamento delle nanoparticelle (sistema). (C) Visualizzazione delle particelle SHB-SAPN da TEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>campione</td>
			<td>Endotossina (UE/mL)</td>
			<td>Endotossina (UE/g di proteine)</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN con lavaggio Isopropanol</td>
			<td>2.02</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN senza lavaggio Isopropanol</td>
			<td>>50</td>
			<td>>0.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Controllo negativo</td>
			<td>Livello di rilevamento inferiore</td>
			<td>non pertinente</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Livelli di endotossina di SHB-SAPN ripiegati. Livelli di endotossina nei campioni SHB-SAPN purificati con o senza lavaggio isopropanolo presentati sia come unità di endotossina/mL che come unità di endotossina/g di proteina SHB-SAPN.

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Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Un metodo dettagliato è fornito qui che descrive la purificazione, il ripiegamento e la caratterizzazione delle nanoparticelle proteiche auto-assemblanti (SAPN) da utilizzare nello sviluppo del vaccino.

Produzione di Nanoparticelle proteiche auto-assemblanti E. coliper vaccini che richiedono la presentazione dell'epitoscopio trimerico

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Le nanoparticelle proteiche autoassemblanti, o SAPN, possono essere utilizzate per sviluppare vaccini contro varie malattie infettive. Questo metodo descritto qui può essere utilizzato per purificare, riformlicare e caratterizzare i SAPN contenenti un fascio a sei eliche. Questa nanoparticella può presentare antigeni trimerici in una conformazione nativa.Con lievi modifiche, questo metodo può essere applicato ad altri innovativi costrutti di vaccino SAPN. Inoltre, può essere facilmente trasferibile alla produzione su larga scala per studi clinici. Per la lisi dell'E.coli raccolto che esprime il fascio a sei eliche SAPN, utilizzare una sonda con la potenza di sonicazione di 150 watt con quattro secondi di sonicazione e sei secondi di riposo, per sonicare pellet batterici rimescolati in 40 millilitri di tampone senza imidazolo sul ghiaccio per cinque minuti.Centrifugare il lysate cellulare per generare un supernatante chiarificato e trasferire il supernatante in un pallone sterile da 150 millilitri. Quindi, portare il campione fino a un volume finale di 100 millilitri con tampone fresco privo di imidazolo. Per isolare la proteina di interesse, aprire il software FPLC e fare clic sull'opzione Nuovo metodo.Nel menu Impostazioni metodo aprire il menu a discesa Posizione colonna e selezionare Porta C1 3. Nel menu a discesa Mostra per tecnica selezionare Affinità. Nel menu a discesa Tipo di colonna selezionare Altri, Hp HisTrap e cinque millilitri.Le caselle Volume colonna e Pressione verranno automaticamente impostate sui valori appropriati. Fate clic su Struttura metodo (Method Outline) e trascinate i pulsanti Equilibrazione e Applicazione di esempio, tre pulsanti Lava colonna e il pulsante Eluizione dal menu di scelta rapida Libreria di fasi accanto alla freccia prima di chiudere il menu Libreria di fasi. Fare clic su Equilibrazione e impostare i valori elencati nella tabella su Buffer iniziale B, 4%Buffer finale B, 4% e Volume colonna, cinque.Fare clic su Applicazione di esempio. Nella casella Caricamento campione fare clic sul pulsante di opzione Per iniettare l'esempio sulla colonna con pompa campione e verificare che la casella accanto a Usa portata dalle impostazioni del metodo sia selezionata nella casella Iniezione campione con pompa di sistema. Modificare il valore della casella Volume in 100 millilitri e lo schema di raccolta delle frazioni da abilitare.Deselezionare la casella Usa dimensione frazione da Impostazioni metodo e modificare la dimensione frazione in quattro millilitri. Fare clic sul primo pulsante Lava colonna, impostare i valori elencati nella tabella su Buffer iniziale B, 4%Buffer finale B, 4% e Volume colonna, 10. Fate clic sulla casella Abilita schema raccolta frazione (Fraction Collection Scheme Enable) e deselezionate la casella Usa dimensione frazione (Use Fraction Size) da Impostazioni metodo (Method Settings).Modificare la dimensione della frazione in quattro millilitri e fare clic sul secondo pulsante Lava colonna. Impostare i valori della tabella su Buffer iniziale B, 0%Buffer finale B, 0% e Volume colonna, cinque. Fate clic sulla casella Abilita schema raccolta frazione (Fraction Collection Scheme Enable) e deselezionate la casella Usa dimensione frazione (Use Fraction Size) da Impostazioni metodo (Method Settings).Modificare la dimensione della frazione in quattro millilitri e fare clic sul terzo pulsante Lava colonna. Impostare i valori della tabella su Buffer iniziale B, 0%Buffer finale B, 0% e Volume colonna, 10. Fate clic sul pulsante Abilita schema raccolta frazioni (Fraction Collection Scheme Enable) e deselezionate la casella Usa dimensione frazione (Use Fraction Size from Method Settings).Quindi, modificare la dimensione della frazione in quattro millilitri. Fare clic sul pulsante Eluizione e fare clic con il pulsante destro del mouse sulle informazioni nella tabella. Nel menu a comparsa fare clic su Elimina passaggio e trascinare il pulsante Sfumatura isocratica nella tabella due volte, in modo che siano disponibili due voci.Impostare il valore della prima voce su Buffer iniziale B, 30%Buffer finale B, 30% e Volume colonna, 10. Impostare il valore della seconda voce su Buffer iniziale B, Buffer finale B 100%,100% e Volume colonna, 10. Fare clic sul pulsante Abilita schema raccolta frazioni e fare clic sulla casella Usa dimensione frazione da impostazioni metodo.Quindi, fare clic su Salva con nome e denominare la purificazione dei file. Posizionare la pompa Un tubo dell'FPLC nel tampone di lavaggio privo di imidazolo e il tubo B della pompa nel tampone imidazolo da 500 millimolare. Posizionare il tubo della pompa del campione nel campione da 100 millilitri ed eseguire il programma di purificazione.Quando è necessario il lavaggio isopropanolo del 60%, sospendere il programma, spostare il tubo A della pompa dal lavaggio privo di imidazolo nel lavaggio isopropanolo del 60% e riavviare il programma. Al termine del lavaggio, sospendere nuovamente il programma, restituire il tubo A della pompa al tampone di lavaggio privo di imidazolo e riavviare il programma di purificazione. Per valutare la purezza della proteina purificata, combinare prima le frazioni dal flusso attraverso, lavare uno, lavare due e lavare tre passaggi, in singoli tubi conici da 50 millilitri.Successivamente, mescolare 15 microlitri per ogni tubo campione con 15 microlitri di tampone Laemmli 2X in singoli tubi di microcentrifugo da 0,5 millilitri e denaturare i campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, impostare un apparecchio di funzionamento in gel con tre gel di poliacrilammide prefabbricati da quattro a 20% in tampone di funzionamento Tris-Glycine SDS-PAGE. Caricare otto microlitri di marcatore di peso molecolare sul primo pozzo di ogni gel e 30 microlitri di campione denaturato negli altri pozzi.Eseguire i gel a 200 volt fino a quando la parte anteriore del colorante colpisce il fondo del gel e sciacquare brevemente i gel con acqua deionizzata prima di eseguire immediatamente l'imaging con un sistema di imaging privo di macchie. Quindi, identificare le frazioni che contengono bande proteiche con le dimensioni corrette e mettere in comune queste frazioni. Per il refolding SAPN a sei eliche bundle, aggiungere da 10 a 20 millilitri di proteine raggruppate a una cassetta di dialisi cut-off a peso molecolare da 10 kilodalton.Dializzare la cassetta in otto urea molare, Tris da 20 millimolare, 5% di glicerolo e TCEP da cinque millimolare a temperatura ambiente durante la notte. La mattina seguente, diminuire la concentrazione di urea nel tampone di dialisi gradualmente di due molari ogni due ore per dializzare lentamente l'urea dal campione. Quando la concentrazione di urea raggiunge due molari, spostare l'apparato dialitico a quattro gradi Celsius e dializzare il campione in urea 120 millimolare, Tris da 20 millimolare e 5% di glicerolo durante la notte per completare il ripieroiezione.La mattina seguente, rimuovere la proteina riformuplicata dalla cassetta e filtrare il pacchetto a sei eliche SAPN attraverso un filtro siringa al fluoruro di polivinilidene da 0,22 micrometri. Per misurare la dimensione media delle particelle del fascio a sei eliche SAPN, aggiungere 45 microlitri di SAPN a fascio a sei eliche a una cuvetta usa e getta e posizionare la cuvetta nella macchina DLS. Successivamente, creare un nuovo file di misurazione ed eseguire una procedura operativa standard prescritta per le proteine in urea 120 millimolare, Tris da 20 millimolare e tampone di glicerolo al 5% a 25 gradi Celsius.Quindi, inizia la misurazione. La dimensione della media Z, il PDI e i risultati della distribuzione verranno calcolati per ogni esecuzione. La macchina leggerà il campione cinque volte.Questo fascio di sei eliche completamente assemblato SAPN è costruito su sequenze proteiche che si prevede si pieghino in una particella che contiene 60 copie del monomero. Il lisato a cellule totali è stato utilizzato per purificare i monomeri SAPN a sei eliche con FPLC usando una colonna di nichel, dimostrando che la proteina eluizzava sia a imidazolo da 150 che da 500 millimolare. Il cromatogramma mostra anche altri due picchi a 185 e 210 millilitri volume totale corrispondente rispettivamente al lavaggio isopropanolo e al lavaggio senza imidazolo.Le frazioni e la purezza della proteina ricombinante potrebbero essere identificate da gel gradiente SDS-PAGE con la proteina di interesse situata principalmente nella frazione 68-79. L'analisi western con anticorpi anti-His e anti-167D4 ha indicato che le frazioni raggruppate erano effettivamente la proteina di interesse. Le macchie hanno anche dimostrato la presenza dei multimeri SAPN a sei eliche.I campioni che contenevano i monomeri proteici di interesse sono stati piegati nel fascio di sei eliche completamente assemblato SAPN per dialisi e distribuzione delle dimensioni delle particelle è stato determinato da DLS e analisi di tracciamento delle nanoparticelle. La visualizzazione mediante microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato singole particelle SAPN a sei eliche ben formate con la distribuzione delle dimensioni ottenuta dalle due tecniche di dimensionamento delle particelle. Il passo più importante in questo protocollo è il ripiezione del bundle a sei eliche SAPN.Il pH corretto e la forza ionica del tampone di ripiezione sono essenziali. Utilizzando un lavaggio isopropanolo durante la purificazione, siamo stati in grado di ridurre l'LPS contaminante a un livello molto basso. Tuttavia, LPS può essere ulteriormente ridotto utilizzando una colonna di scambio di anion, se necessario.Questa tecnologia può essere facilmente adattata per l'applicazione umana. Un SAPN espresso in batteri è già stato scalato per un prossimo studio clinico sulla malaria di fase 1/2a.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

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