Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

この研究は、ヘンリー・M・ジャクソン軍事医学振興財団と米国国防総省との間の協力協定(W81XWH-11-2-0174)によって支えられました。抗HIV-1 gp41 mAb 167-D IV抗体は、NIHエイズ試薬プログラムを通じてスーザン・ゾラ・パズナー博士から受け取りました。

<ol>
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表明された見解は著者のものであり、米陸軍や国防総省の立場を表すものと解釈されるべきではない。ピーター・ブルクハルトは、アルファ-OペプチドAGと呼ばれる会社に興味を持っており、技術に関する特許を持っています。他の著者は、本稿で提示される主題に関する金銭的利害関係を有する会社との提携または財政的関与を持っていません。

ナノテクノロジーは、サブユニットワクチン開発のための多くの利点とソリューションを提供します。ナノワクチンは、免疫原性を増加させる宿主免疫系に微粒子として抗原を繰り返し提示することができる26.ナノワクチンには多くの種類がありますが、デノボ設計タンパク質で構成されたものがワクチン開発1の最強のアプローチであると考えています。それらは宿主タンパク質に対する配列相同性なしで設計され、低い生産コストおよび高いプロダクト収率を提供している間、原生様の立体構造に近い関心の抗原を提示することができる。このアプローチの主な例は、複数の感染症に対するワクチンに適用した SAPN 技術7.HIV-1ワクチン開発の難しさに対処し、我々は効果的にネイティブのような三体化コンフォメーション9でV1V2抗原を提示するためにユニークなSHB-SAPNコアを設計しました。多くのワクチン標的、特にウイルス性疾患に対しては、トリマー27として存在する。この現象は、SAPN設計がサブユニットワクチンの開発に大きな影響を及ぼすことを示しています。
この方法では、大腸菌発現システムでSHB-SNSを生成する方法を示す。タンパク質の高収率(培養量約6mg/100mL)を発現した。タンパク質は10個のヒスチジンを含み、Ni2+カラムを用いた固定化金属親和性クロマトグラフィーを用いて容易に精製した。His-Tagのこの長さは、最も高いタンパク質収率に最適であることがわかった。精製されたタンパク質は、N末端HisTagとC末端ヘプタド繰り返しの両方の存在によって示されるように、設計されたタンパク質の全長を含んでいた。広く受け入れられている技術を活用し、SHB-SAPNコアの表現、生産、特性評価に最適化しました。新しいタンパク質エピトープを含むSAPNの開発中に全長タンパク質の産生が欠如している場合は、宿主細胞における遺伝子の発現問題を示している可能性がある。それが起こる場合、遺伝子および発現システムは再設計され、記載されたプロトコルに合わせなければならない。超音波処理時間または強度の修飾はまた、予測される全長タンパク質の濃度を増加させる可能性がある。
再折り畳まれた粒子は、DLSおよびナノ粒子追跡分析によって決定される予想サイズ範囲(20〜100nm)8、24、25であった。これらの結果は、TEMを用いてさらに確認した。このステップに問題がある場合は、通常、再折りたたみバッファーのpHまたはイオン強度に問題があるためです。粒子サイジング技術で大きなサイズの粒子が検出されると、凝集を示し、リフォールディングバッファのpHを増加させることによって回避することができる。粒子がDLSによって検出されない場合は、タンパク質の濃度を確認し、バッファーのpHを確認します。DLSの最終的なタンパク質濃度は、少なくとも100 μg/mLでなければなりません。濃度が問題でない場合は、小さな、不完全に形成された粒子の存在を示し、その濃度はpHを減少させることによって減少させることができる。あるいは、塩化ナトリウム濃度は、不要なサイズの粒子の存在を最小限に抑えるために最適な範囲に調整することができる。
最後に、精製時にイソプロパノール洗浄工程を用いることで、注射用製品の体重5EU/kgの上限を下回るSAPNの0.01 EU/μgまで、宿主大腸菌からの汚染LPSを0.01EU/μgに低減することができました。28.このレベルは、Q 列とも呼ばれるアニオン交換列を使用することでさらに低下できます。高レベルのエンドトキシンがまだ存在する場合は、バッファー調製に使用されたすべての材料を確認してください。この方法では、デピロゲン化ガラス製品とエンドトキシンフリープラスチック製品のみを使用することを忘れないでください。
これらの結果は、臨床前の予防接種研究に用いられるSHB-SAPNコアの製造方法の開発に成功したことを示している。わずかな変更しか加え付けることができないこの方法は、目的の抗原が添加されたときにSHB-SAPNの精製に適用することができる。この方法を出発点として使用する大きな変更の 1 つは、溶出ステップです。異なるタンパク質は、実験的に決定しなければならない異なるイミダゾール濃度で溶出する。もう 1 つの大きな違いは、再折りたたみバッファーの組成です。最適化には、異なるpH条件とイオン強度をテストする必要があります。
将来の作業を考慮して、SHB-SAPN の人間のアプリケーションを可能にするために必要なわずかな変更は 2 つだけです。第1は、ヒト29におけるアンピシリンアレルギーによる発現ベクターをカナマイシン耐性選択マーカーに変更する必要があることです。人間が使用するタンパク質製造のもう一つの主要な要件は、動物製品フリーメディアでSHB-SAPNを製造することです。小規模な研究は、すでに植物ベースの媒体でタンパク質の合理的な収量を示しました。ここで提示された作業は、マラリアワクチン候補、FMP01416で実証されているように、究極のGMP生産のために簡単にスケーラブルです。この大規模なFMP014-SAPN生産には、最終製品からLPSおよびNi2+コンテンツをさらに削減するためのアニオン交換と陽イオン交換ステップの両方が含まれていました。この細菌発現SAPNは、今後のフェーズ1/2a臨床試験のために既にスケールアップされています。

従来のワクチン開発は不活性化または減衰病原体に焦点を当ててきたが、現代のワクチンの焦点はサブユニットワクチン1に向かってシフトしている。このアプローチは、より標的を絞った反応、および潜在的により有効なワクチン候補につながる可能性があります。しかし、主な欠点の1つは、サブユニットワクチンが全生物のような微粒子ではなく、免疫原性2の低下をもたらす可能性があることです。反復抗原表示システムとしてのナノ粒子は、標的サブユニットワクチンアプローチと生物全体の粒子性の両方の利点を持つことができる1,3.
既存のタイプのナノワクチンの中で、合理的に設計されたタンパク質アセンブリは、ネイティブ様の立体構造1、4で抗原の複数のコピーを潜在的に提示できるワクチン候補の設計と開発を可能にします。 、5,6.これらのタンパク質アセンブリの一例は、自己組織化タンパク質ナノ粒子(SAPN)7である。SAPN はコイルコイルドメインに基づいており、伝統的に大腸菌8で表現されています。SAPNワクチン候補は、マラリア、SARS、インフルエンザ、トキソプラズマ症、HIV-1 9、10、11、12、13などの様々な疾患に対して開発されています。,14歳,15歳,16歳,17歳,18歳,19.各SAPN候補の設計は対象の病原体に固有ですが、生産、精製、および折りたたみ技術は一般的に広く適用可能です。
私たちの現在の関心の一つは、効果的なHIV-1ワクチンです。RV144では、適度な有効性を示したHIV-1ワクチンの唯一の第III相臨床試験において、感染リスクの低減は、エンベロープタンパク質20、21のV1V2ループに対するIgG抗体と相関していた。この領域のネイティブライクなトリメプレゼンテーションは、保護免疫原性22にとって重要であると考えられている。V1V2ループを可能な限りネイティブ状の立体構造に近づけるため、HIV-1エンベロープポストフュージョン後6らせリックバンドル(SHB)を含む原理SAPNワクチン候補を開発し、V1V2ループを正しいコンフォメーション9に提示しました。.この候補は、HIV-1エンベロープタンパク質に対する既知のモノクローナル抗体によって認識された。V1V2-SHB-SAPNで免疫したマウスはV1V2特異的抗体を挙げ、最も重要なことは、gp70 V1V2に結合し、正しい立体構造エピトープ9である。SHB-SAPNコアは、HIV-1 V1V2ループのキャリアとしての役割を超えた他の機能を持つことができます。ここでは、SHB-SAPNコアの式、精製、再折りたたみ、検証の詳細な方法論について説明します。配列選択、ナノ粒子設計、分子クローニング、および大腸菌の形質転換は、前述の9である。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

自己組織化タンパク質ナノ粒子(SAPN)は、反復抗原ディスプレイとして機能し、異なる感染症に対する幅広いワクチンの開発に使用できます。この記事では、三重コンフォメーションで抗原を提示できる6らせん束(SHB)アセンブリを含むSAPNコアを生成する方法を示します。大腸菌系におけるSHB-SAPNの発現と、必要なタンパク質精製工程について述べる。残留細菌リポ多糖を低減するイソプロパノール洗浄工程を盛り込んだ。タンパク質同一性および純度の指標として、タンパク質はウェスタンブロット分析において公知のモノクローナル抗体と反応した。再折りたたみ後、粒子の大きさは予想範囲(20~100nm)に入り、動的光散乱、ナノ粒子追跡解析、透過電子顕微鏡によって確認されました。ここで説明する方法論は SHB-SAPN 用に最適化されていますが、わずかな変更しか加え付けることができない他の SAPN コンストラクトに適用できます。この方法はまた、ヒトワクチン用のGMP製造のための大規模な生産に容易に移用可能である。

ここに示す完全に組み立てられたSHB-SAPNは、モノマーの60コピーを含む粒子に折りたたむと予測されるタンパク質配列(図1A)に基づいて構築されています(図1B)。図2は、SHB-SAPNコアの生産、精製、同定の方法の概要を説明します。SHB-SAPNコアの遺伝子配列を有するpPep-T発現ベクターを含有するグリセロールストック由来の大腸菌をBL21(DE3)大腸菌に誘導した。細菌細胞は、脱育および減少条件下で正常に増殖し、ライズした。
総細胞液質は、Ni2+カラムを用いてFPLCによるSHB-SAPNモノマーを精製するために使用された(図3A)。FPLCクロマトグラフは、タンパク質が150mMと500mMイミダゾールの両方でタンパク質をタンパク質でた出したことを示しています(図3A)。クロマトグラムはまた、イソプロパノール洗浄およびイミダゾールフリー洗浄に対応する185 mLおよび210 mLの総容積で2つの他のピークを示す。組換えタンパク質の分画および純度は、勾配SDS-PAGEゲルによって同定された(図3B)。目的のタンパク質は、主に分数68\u201279(278\u2012300 mL総容積)に位置していた。これらの分数は、さらなる分析のために組み合わされた。抗HIS抗体(N末端)および167-D-IV抗体(C末端)を有するウェスタンブロットは、プールされた画分が実際に目的のタンパク質であることを示した(図4A,B)。これらのブロットはまた、SHB-SAPNマルチマーの存在を実証した。以前の洗い流しおよび溶出画画は、より高濃度の多量化タンパク質を含む傾向があり、したがって除外された。
目的とするタンパク質モノマーを含むサンプルを透析により完全に組み立てられたSHB-SAPNに折りたたんだ。粒子サイズ分布は、DLSおよびナノ粒子追跡解析により決定した(図5A,B)。DLSは、NTAシステムが81nmの平均サイズを測定しながら、Z平均流体力学直径67nmの粒子を同定しました。わずかなサイズの違いは、粒子サイズの技術によるが、両方の分析からのサイズは20\u2012100 nm8、24、25の予想範囲内であった。SHB-S/S/S/S/S/SINはTEMによって可視化され、画像は2つの粒子サイジング技術から得られたサイズ分布を有する整形した個々の粒子を示した(図5C)。
タンパク質の精製中に、カラムをイソプロパノールで洗浄し、最終SHB-SAPN産物におけるLPS汚染を減少させる。エンドトキシンレベルが免疫に許容できるかどうかを確認するために、イソプロパノール洗浄工程の有無にかかわらず精製したSHB-SAPNサンプル中のLPSの濃度を運動性LALアッセイによって決定した。その結果、イソプロパノール洗浄はエンドトキシンレベルを>0.25 EU/μgからSHB-SAPNタンパク質の0.010 EU/μgに減少させたことが示された(表1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> 図1:SHB-SAPNタンパク質配列および構造。(A) SHB-SAPNモノマーのアミノ酸配列。(B) 60個のタンパク質モノマーからなる完全に組み立てられたSHB-SAPNコアの構造のコンピュータモデル。アミノ酸配列の配色: グレー = HisTag;緑 = ペンタマー;ダークブルー=デノボ設計トリマー;水色 = 6らせん束。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> 図2: のフローチャートSHB-SAPN 生産のためのプロトコル。配色: 黒 =大腸菌中のタンパク質モノマーの発現;ダークグレー= モノマー精製;ミディアムグレー = モノマー識別;ライトグレー = 折り返しとキャラクタライゼーション;白 = 完全に組み立てられた SHB-SAPN 製品。ダークグレーとミディアムグレーで標識されたステップでは、タンパク質は、伝型および減少条件下にあります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> 図3:SHB-SAPNモノマーのタンパク質精製(A)FPLC精製からのクロマトグラフ。クロマトグラムの上の緑色の線は、精製工程を示す。クロマトグラム中の青い線は、280nm波長での画分の光学密度を表す。黒線は、精製の各段階で使用されたバッファーB(8M尿素、20mMトリス、50mMリン酸ナトリウムモノベーシック、5mM TCEP、500mMイミダゾール、pH8.5)の何パーセントを示す。(B) 溶解物(L)、フロースルー(FT)、第1洗浄(W1)、イソプロパノール洗浄(W2)、第3洗浄(W3)、および150mMイミダゾール(E150)および500mMイミダゾール(E500)からの個々の分画からのプールされた画分のSDS-PAGEゲル浄化。第1レーン(M)の分子マーカーは、10~250 kDaのバンドを識別します。標的タンパク質は黒い矢印で示される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> 図4:ウェスタンブロットによるタンパク質の同定。すべてのレーンには100 ngのタンパク質が搭載されています。(A) 抗6xヒスタッグを持つウェスタンブロットの結果。(B) 167-D-IV HIV-1モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットの結果。レーンには、M = 分子量マーカーというラベルが付けられます。1 = リサート;2 = フロースルー;3 = 最初の洗浄;4 = イソプロパノール洗浄(第2洗浄);5 = 3回目の洗浄;6 = プールされた体積分率 56\u201261 (最初の溶出ピーク)、7 = プールされた体積ファクション 62\u201267 (2 つのピークの間)、8 = プールされた体積分率 68\u201278 (2 番目の溶出ピーク)。単量体SHB-SAPNバンドとして期待されるバンドサイズが18.07 kDaの標的タンパク質は、黒い矢印で示されます。レーン 7 および 8 の余分なバンディングは、SHB-SAPN (赤い矢印) のダイマー、トリマー、およびマルチマーです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> 図5:折り返されたSHB-SAPNの特性を説明する。(A)DLSによって決定される粒度分布。(B)ナノ粒子トラッキング(系)によって決定される粒子径。(C) TEMによるSHB-SAPN粒子の可視化<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>サンプル</td>
			<td>エンドトキシン (EU/mL)</td>
			<td>エンドトキシン (EU/μg のタンパク質)</td>
		</tr>
<tr>
<td>イソプロパノールウォッシュ付きSAPN</td>
			<td>2.02</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>イソプロパノールウォッシュなしSAPN</td>
			<td>>50</td>
			<td>>0.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>負のコントロール</td>
			<td>検出レベル以下</td>
			<td>N/a</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:再折りたたみSHB-SHB-S/SNSのエンドトキシンレベル。イソプロパノール洗浄の有無にかかわらず精製したSHB-SAPNサンプル中のエンドトキシンレベルは、エンドトキシン単位/mLおよびエンドトキシン単位/μgの両方をSHB-SAPNタンパク質として提示した。

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Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

ここでは、ワクチン開発に使用する自己組織化タンパク質ナノ粒子(SAPN)の精製、再折りたたみ、および特性評価について詳しく説明します。

トリマーエピトーププレゼンテーションを必要とするワクチンに対する大腸菌の自己組織化タンパク質ナノ粒子の産生

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

自己組み立てタンパク質ナノ粒子(SAPN)は、様々な感染症に対するワクチンの開発に使用できます。ここで説明するこの方法を使用して、6 らせんバンドルを含む SAPN を精製、再折り、および特徴付けることができます。このナノ粒子は、天然型の立体構造で三量体抗原を提示することができる。わずかな変更を加えれば、この方法は他の革新的なSAPNワクチン構築物に適用することができます。さらに、臨床試験のために大規模生産に容易に移すことができる。6ヘリックスバンドルSAPNを発現する収穫された大腸菌のリシスについては、4秒間の超音波処理と6秒間の残りの150ワットの超音波出力を備えたプローブを使用して、氷上のイミダゾールフリーバッファーの40ミリリットルで再懸濁された細菌ペレットを5分間超音波処理します。細胞リセートを遠心分離して、清澄上清を生成し、上清を滅菌150ミリリットルフラスコに移す。次に、新鮮なイミダゾールフリーバッファーで100ミリリットルの最終体積までサンプルを持って来ます。目的のタンパク質を分離するには、FPLC ソフトウェアを開き、[新しい方法] オプションをクリックします。[メソッド設定]メニューで、[列の位置]ドロップダウンメニューを開き、[C1ポート3]を選択します。[テクニック別に表示] ドロップダウン メニューで、[アフィニティ] を選択します。[列タイプ] ドロップダウン メニューで、[その他]、[HisTrap HP]、および [5 ミリリットル] を選択します。[列の体積]ボックスと[圧力]ボックスは、自動的に適切な値に設定されます。[メソッド アウトライン]をクリックし、[フェーズライブラリ]メニューを閉じる前に、矢印の横にある[フェーズライブラリ]ポップアップメニューから[平衡]ボタンと[サンプルアプリケーション]ボタン、3つの[列の洗浄]ボタン、および[溶出]ボタンをドラッグします。[均衡]をクリックし、表に示す値を初期バッファB、4%最終バッファB、4%、カラムボリューム、5に設定します。[サンプル アプリケーション] をクリックします。[サンプルの読み込み]ボックスで、[サンプル ポンプで列にサンプルを注入]ラジオ ボタンをクリックし、[システム ポンプでのサンプルインジェクション]ボックスの[メソッド設定から流量を使用]の横にあるチェックボックスがオンになっていることを確認します。[ボリューム ボックス] の値を 100 ミリリットルに変更し、[分数コレクション] スキームを有効にします。[方法設定から分数サイズを使用]ボックスをクリック解除し、[分率サイズ]を4ミリリットルに変更します。最初の[列の洗浄]ボタンをクリックし、表に示す値を初期バッファB、4%最終バッファB、4%、カラムボリューム10に設定します。[分数コレクションスキームの有効化]ボックスをクリックし、[方法設定から分数サイズを使用]をクリック解除します。[分率サイズ]を4ミリリットルに変更し、2つ目の[列の洗浄]ボタンをクリックします。テーブル内の値を初期バッファ B、0%最終バッファ B、0%、カラムボリューム、5 に設定します。[分数コレクションスキームの有効化]ボックスをクリックし、[方法設定から分数サイズを使用]をクリック解除します。[分率サイズ]を4ミリリットルに変更し、3つ目の[列の洗浄]ボタンをクリックします。テーブル内の値を初期バッファ B、0%最終バッファ B、0%、カラムボリューム 10 に設定します。[分数コレクション スキームの有効化] ボタンをクリックし、[方法設定から分数サイズを使用] ボックスをクリック解除します。次に、分率サイズを4ミリリットルに変更します。[溶出]ボタンをクリックし、テーブル内の情報を右クリックします。ポップアップメニューで「ステップを削除」をクリックし、2 つのエントリが表示されるように、表に「等角グラデーション」ボタンを2回ドラッグします。最初のエントリの値を初期バッファ B、30%最終バッファ B、30%、カラムボリューム、10 に設定します。2 番目のエントリの値を初期バッファ B、100%最終バッファ B、100%、カラム ボリューム、10 に設定します。[分数コレクション スキームの有効化] ボタンをクリックし、[方法設定から分数サイズを使用] ボックスをクリックします。次に、[名前を付けて保存]をクリックし、ファイルの浄化に名前を付けます。FPLCのポンプAチューブをイミダゾールフリー洗浄バッファーに入れ、ポンプBチューブを500ミリモル・イミダゾールバッファーに入れます。サンプルポンプチューブを100ミリリットルのサンプルに入れ、精製プログラムを実行します。60%イソプロパノール洗浄が必要な場合は、プログラムを一時停止し、イミダゾールフリー洗浄から60%イソプロパノール洗浄にポンプAチューブを移動し、プログラムを再起動します。洗浄の最後に、プログラムをもう一度一時停止し、ポンプAチューブをイミダゾールフリーの洗浄バッファに戻し、精製プログラムを再開します。精製したタンパク質の純度を評価するには、まず流れから分率を組み合わせ、1つを洗浄し、2つを洗浄し、3つのステップを、個々の50ミリリットル円錐形チューブで洗浄します。次に、各サンプルチューブから15マイクロリットルを個々の0.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に2Xレムリバッファー15マイクロリットルと混合し、95°Cでサンプルを10分間変性させます。インキュベーションの最後に、トリスグリシンSDS-PAGEランニングバッファに3つの染色フリー4〜20%プレキャストポリアクリルアミドゲルを備えたゲルランニング装置を設置します。各ゲルの最初のウェルに分子量マーカーの8マイクロリットルをロードし、他のウェルに変性サンプルの30マイクロリットル。染料の前面がゲルの底に当たるまで200ボルトでゲルを実行し、脱イオン水でゲルを短時間リンスしてから、すぐに染色を含まないイメージングシステムでイメージングします。次に、正しいサイズのタンパク質バンドを含む分数を特定し、これらの画分をプールします。6ヘリックスバンドルSAPNリフォールディングの場合、10キロダルトン分子量カットオフ透析カセットに10〜20ミリリットルのプールタンパク質を加えます。カセットを8つの臼歯尿素、20ミリモルトリス、5%グリセロール、5ミリモルTCEPの室温で一晩透析する。翌朝、透析バッファー内の尿素濃度を2時間ごとに2モルずつ段階的に減少させて、尿素をサンプルからゆっくりと透析する。尿素濃度が2モルに達したら、透析装置を摂氏4度に移動し、サンプルを120ミリモル尿素、20ミリモルトリス、グリセロール5%に透析して一晩で再折り畳みを終了します。翌朝、カセットからリフォールドされたタンパク質を取り除き、0.22マイクロメートルのポリビニリデンフッ化物注射器フィルターを通して6ヘリックスバンドルSAPNをフィルター処理します。6ヘリックスバンドルSAPNの平均粒径を測定するには、6ヘリックスバンドルSAPNの45マイクロリットルを使い捨てキュベットに追加し、そのキュベットをDLSマシンに入れます。次に、新しい測定ファイルを作成し、120ミリモル尿素、20ミリモルトリス、および摂氏25度の5%グリセロールバッファーでタンパク質の事前に書かれた標準的な操作手順を実行します。次に、測定を開始します。Z平均サイズ、PDI、分布結果は、各実行に対して計算されます。機械はサンプルを5回読み取る。この完全に組み立てられた6つのヘリックスバンドルSAPNは、モノマーの60コピーを含む粒子に折り畳まれると予測されるタンパク質配列に基づいて構築されています。全細胞リセートを使用して、ニッケルカラムを用いてFPLCにより6ヘリックスバンドルSAPNモノマーを精製し、タンパク質が150ミリモルイミダゾールと500ミリモルイミダゾールの両方で溶出したことを実証した。クロマトグラムはまた、イソプロパノール洗浄とイミダゾールフリー洗浄に対応する185および210ミリリットルの総体積で他の2つのピークを示す。組換えタンパク質の画分と純度は、主に画分68〜79に位置する目的のタンパク質を有する勾配SDS-PAGEゲルによって同定することができた。抗Hisおよび抗167D4抗体によるウェスタンブロット分析は、プールされた分画が実際に関心のあるタンパク質であることを示した。このブロットは、6ヘリックスバンドルSAPNマルチマーの存在も実証しました。目的のタンパク質モノマーを含むサンプルを透析および粒度分布によって完全に組み立てられた6ヘリックスバンドルSAPNに折りたたみ、DLSおよびナノ粒子追跡分析によって決定した。透過電子顕微鏡による可視化により、2つの粒子サイズ化技術から得られたサイズ分布を有する、個々の6ヘリックス束SAPN粒子が明らかになった。このプロトコルで最も重要なステップは、6 ヘリックスバンドル SAPN のリフォールディングです。リフォールディングバッファーの正しい pH およびイオン強度が必須です。精製時にイソプロパノール洗浄を行い、汚染LPSを極めて低いレベルにまで低減することができました。ただし、必要に応じて、アニオン交換カラムを使用してLPSをさらに削減することができます。この技術は、人間のアプリケーションに容易に適応することができます。細菌表現のSAPNは、今後のフェーズ1/2aマラリア臨床試験のためにすでにスケールアップされています。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

蛍光分光法により測定膜タンパク質フォールディングの熱力学

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

ナノ析出法を通じて、ジブロック高分子ナノ粒子の製剤

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

3次元自己組織化ペプチドハイドロゲル中のヒト神経前駆細胞の栽培

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

標的ウイルスタンパク質の分析はHER2 +腫瘍に配信ナノ粒子

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

回生研究ハーモニックナノ粒子

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

液体中のパルスレーザアブレーションによる金属ナノ粒子の生成：ナノ粒子の抗菌特性を調べるためのツール

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

自動 Microbioreactor 技術を用いた異種タンパク質生産の最適化のための汎用プロトコル

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

カプセル化と 3 D の細胞の免疫染色のエラスチン様タンパク質ゲルの生産

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...