Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

이 작품은 군사 의학의 발전을위한 헨리 M 잭슨 재단 사이의 협력 협정 (W81XWH-11-2-0174)에 의해 지원되었다, Inc., 미국 국방부. 항 HIV-1 gp41 mAb 167-D IV 항체는 NIH 에이즈 시약 프로그램을 통해 수잔 졸라-파스너 박사로부터 받았다.

<ol>
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표현된 견해는 저자의 견해이며 미육군이나 국방부의 입장을 대변하는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 피터 버크하르트는 알파-O 펩타이드 AG라는 회사에 관심을 가지고 있으며 이 기술에 대한 특허를 보유하고 있습니다. 다른 저자는 이 백서에 제시된 주제에 대해 재정적 이해관계가 있는 회사와 어떠한 제휴 나 재정적 관여도 하지 않습니다.

나노 기술은 하위 단위 백신 개발을위한 많은 장점과 솔루션을 제공합니다. 나노백신은 항원을 숙주 면역계통에 미립자로 반복적으로 제시하여 면역원성을 증가시키는26. 나노 백신의 많은 다른 모형이 있는 동안, 우리는 de novo 디자인한 단백질로 구성된그들 백신 발달을 위한 강한 접근이 될 것 같다는 것을 믿습니다 1. 그(것)들은 호스트 단백질에 어떤 순서 상동성도 없이 설계되고 낮은 생산 비용 및 높은 제품 수율을 제공하면서 네이티브 같이 형성에 가까운 관심의 항원을 제시할 수 있습니다. 이 접근법의 대표적인 예는 여러 전염병에 대한 백신에 적용한 SAPN 기술 7입니다. HIV-1 백신 개발의 어려움을 해결하기 위해, 우리는 효과적으로 네이티브 같은 트리메라 형태 9에서 V1V2 항원을제시하기 위해 독특한 SHB-SAPN 코어를 설계했다. 많은 백신 표적, 특히 바이러스 성 질환에 대한, 트리머 (27)로 존재한다. 이 현상은 우리의 SAPN 설계가 하위 단위 백신의 개발에 광범위한 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.
이 방법에서는 대장균 발현 시스템에서 SHB-SAPNS를 생성하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 단백질의 높은 수율을 표현 (약 6 mg/100 배양의 mL). 단백질은 10개의 히스티딘을 함유하고Ni2+ 컬럼을 이용한 고정화 금속 친화도 크로마토그래피를 사용하여 쉽게 정제되었다. His-Tag의 이 길이는 가장 높은 단백질 수율에 최적인 것으로 나타났습니다. 정제된 단백질은 N-말단 HisTag 및 C 말단 heptad 반복의 존재에 의해 지시된 바와 같이 설계된 단백질의 전체 길이를 함유하였다. 우리는 널리 인정되는 기술을 활용하고 SHB-SAPN 코어의 표현, 생산 및 특성화에 최적화했습니다. 새로운 단백질 에피토프를 함유하는 SAPN의 개발 동안 전신 단백질의 생산부족은 숙주 세포에서 유전자의 발현 문제를 나타낼 수 있었다. 이 경우 유전자 및 발현 시스템은 기재된 프로토콜에 맞게 재설계및 조정되어야 합니다. 초음파 처리 시간 또는 강도의 변형은 또한 예측된 전체 길이 단백질의 농도를 증가시킬 수 있다.
재접립된 입자는 DLS 및 나노입자 추적 분석에 의해 결정된 바와 같이예상크기 범위(20~ 100 nm) 8,24,25였다. 이러한 결과는 TEM을 사용하여 추가로 확인되었다. 이 단계에서 문제가 있는 경우, 일반적으로 재접이식 버퍼의 pH 또는 이온 강도에 대한 문제 때문입니다. 입자 크기 조정 기술에서 큰 크기의 입자가 감지되면 재접이식 버퍼의 pH를 증가시켜 피할 수 있는 집계를 나타냅니다. 입자가 DLS에 의해 검출되지 않으면 단백질의 농도를 확인하고 버퍼의 pH를 확인하십시오. DLS에 대한 최종 단백질 농도는 적어도 100 μg/mL이어야 합니다. 농도가 문제가되지 않는 경우, 그것은 그 농도가 pH를 감소시킴으로써 감소 될 수있는 작고 불완전하게 형성 된 입자의 풍부를 나타냅니다. 대안적으로, 염화나트륨 농도는 원치 않는 크기의 입자의 존재를 최소화하기 위해 최적의 범위로 조절될 수 있다.
마지막으로, 정화 중에 이소프로판올 세척 단계를 사용하여 주사용 제품에 대한 체중 5 EU/kg의 미국 식품의약국(FDA) 한도 미만인 SAPN의 호스트 대장균에서 오염되는 LPS를 0.01 EU/μg로 줄일 수 있었습니다. 28. 이 레벨은 Q 열이라고도 하는 음이온 교환 열을 사용하여 더 줄일 수 있습니다. 높은 수준의 내독소가 여전히 존재하는 경우 버퍼 준비에 사용 된 모든 재료를 확인하십시오. 이 방법은 depyrogenated 유리 제품 및 내독소 무료 플라스틱 제품을 사용하는 것을 기억하십시오.
이러한 결과는 전임상 예방 접종 연구에 사용될 수 있는 SHB-SAPN 코어를 생산하는 방법을 성공적으로 개발했음을 나타냅니다. 이 방법은 약간의 변형만으로, 만약 있는 경우, 관심 있는 항원이 첨가될 때 SHB-SAPN의 정제에 적용될 수 있다. 이 방법을 시작점으로 사용하는 것은 용출 단계에 있습니다. 다른 단백질은 실험적으로 결정되어야 하는 다른 imidazole 농도에서 용해됩니다. 다른 주요 차이점은 다시 접는 버퍼의 구성일 수 있습니다. 최적화를 위해서는 이온 강도뿐만 아니라 다양한 pH 조건을 테스트해야 합니다.
향후 작업을 고려하여 SHB-SAPN을 인간으로 적용하려면 두 가지 약간의 수정만 필요합니다. 첫 번째는 인간29의암피실린 알레르기로 인해 발현 벡터가 카나마이신 저항성 선택 가능한 마커로 변경될 필요가 있다는 것이다. 인간 사용을 위한 단백질 제조의 다른 주요 요구 사항은 동물성 제품 없는 매체에서 SHB-SAPN을 생산하는 것입니다. 소규모 연구는 이미 식물 기반 매체에서 단백질의 합리적인 수율을 나타냈다. 여기에 제시된 일은 말라리아 백신 후보, FMP01416으로입증된 바와 같이 궁극적인 GMP 생산을 위해 쉽게 확장가능합니다. 이 대규모 FMP014-SAPN 생산에는 음이온 교환 및 양이온 교환 단계가 모두 포함되어 있어 최종 제품에서 LPS 및 Ni2+ 함량을 더욱 감소시켰습니다. 이 세균 성 발현 SAPN은 이미 곧 단계 1/2a 임상 시험을 위해 확장되었습니다.

전통적인 백신 개발은 불활성화 또는 감쇠된 병원체에 초점을 맞추고 있는 동안, 현대 백신의 초점은하위 단위 백신으로 이동했습니다 1. 이 접근은 더 표적으로 한 반응으로 이끌어 낼 수 있고, 잠재적으로 더 효과적인 백신 후보자. 그러나, 주요 단점 중 하나는 소단위 백신이 감소 된 면역 원성 2를 초래할 수있는 전체유기체와 같은 미립자되지 않는다는 것입니다. 반복적 항원 디스플레이 시스템으로서의 나노입자는 전체 유기체의 미립자 성질뿐만 아니라 표적 소단위 백신 접근법 모두의 이점을 가질 수있다1,3.
기존의 나노백신 중에서 합리적으로 설계된 단백질 어셈블리는 항원의 여러 사본을 네이티브 와 같은 형태에서 잠재적으로 제시할 수 있는백신 후보의 설계 및 개발을 가능하게 합니다 1,4 ,5,6. 이들 단백질 어셈블리의 한 예로는 자가 조립 단백질 나노입자(SAPN)7이있다. SAPN은 코일 코일 도메인을 기반으로 하며 전통적으로 대장균8로표현됩니다. SAPN 백신 후보기는 말라리아, 사스, 인플루엔자, 톡소플라즈마증 및 HIV-1 9,10,11,12,13 과 같은 다양한 질병에 대해 개발되었습니다. , 14세 , 15세 , 16세 , 17세 , 18세 , 19. 각 SAPN 후보의 설계는 관심 있는 병원체에 특정하지만, 생산, 정제 및 재접공 기술은 일반적으로 광범위하게 적용가능하다.
우리의 현재 관심사 중 하나는 효과적인 HIV-1 백신입니다. RV144에서- 적당한 효험을 설명한 HIV-1 백신의 유일한 단계 III 임상 시험은 감염의 감소된 리스크는 봉투 단백질20,21의V1V2 루프에 IgG 항체와 상관되었습니다. 이 지역의 네이티브 유사 트리메라 프리젠 테이션은 보호 면역 원성22에중요하다고 생각됩니다. V1V2 루프를 가능한 한 네이티브 와 같은 형태에 가깝게 제시하기 위해, 우리는 올바른 형태 9로 V1V2 루프를 제시하기 위해 HIV-1 봉투 후 융합 6 나선 번들 (SHB)을 포함하는 원리 SAPN 백신 후보의 증거를 개발했습니다. . 이 후보는 HIV-1 봉투 단백질에 공지된 단일클론 항체에 의해 인식되었다. V1V2-SHB-SAPN으로 면역화된 마우스는 V1V2 특이적 항체를 제기했으며, 가장 중요한 것은, gp70 V1V2에 바인딩되어, 정확한 형태 에피토프9. SHB-SAPN 코어는 HIV-1 V1V2 루프의 캐리어 역할을 넘어서는 다른 기능을 가질 수 있습니다. 여기서는 SHB-SAPN 코어의 발현, 정제, 재접기 및 유효성 검사에 대한 자세한 방법론을 설명합니다. 서열 선택, 나노입자 설계, 분자 복제, 및 대장균의 변형은 이전에9에기술되어 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

자가 조립 단백질 나노 입자 (SAPN) 반복항원 디스플레이로 기능하고 다른 감염성 질환에 대한 백신의 넓은 범위를 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 이 문서에서는 트리메라 형태에서 항원을 제시할 수 있는 6-나선 번들(SHB) 어셈블리를 포함하는 SAPN 코어를 생산하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 대장균 시스템에서 SHB-SAPN의 발현뿐만 아니라 필요한 단백질 정제 단계를 설명합니다. 잔류 세균성 리포폴리사카라이드를 감소시키기 위한 이소프로판올 세척 단계를 포함시켰습니다. 단백질 정체성 및 순도의 표시로서, 단백질은 서양 블롯 분석에서 알려진 단일 클론 항체와 반응했다. 재접이식 후, 입자의 크기는 동적 광 산란, 나노 입자 추적 분석 및 투과 전자 현미경으로 확인된 예상 범위(20~100 nm)로 떨어졌다. 여기서 설명하는 방법은 SHB-SAPN에 최적화되어 있지만 약간의 수정만으로 다른 SAPN 구문에 적용할 수 있습니다. 이 방법은 또한 인간 백신을 위한 GMP 제조를 위한 대규모 생산으로 쉽게 양도할 수 있습니다.

여기서 도시된 완전히 조립된 SHB-SAPN은단량체 60부를 포함하는 입자로 접을 것으로 예상되는 단백질 서열(그림 1A)에 기초한다(도1B). 도 2는 SHB-SAPN 코어의 제조, 정제 및 식별방법에 대한 개요를 제공한다. 대장균은 SHB-SAPN 코어의 유전자 서열을 가진 pPep-T 발현 벡터를 함유한 글리세롤 스톡으로부터 BL21(DE3) 대장균에서 유도되었다. 세균성 세포는 성공적으로 성장하고 변성 및 감소 조건 하에서 lysed했다.
총 세포 용해액은Ni2+ 컬럼을 사용하여 FPLC에 의해 SHB-SAPN 단량체를 정제하는 데 사용되었다(도3A). FPLC 크로마토그래프는 단백질이 150 mM 및 500 mM 이미다졸(그림3A)에서모두 용출되었다는 것을 보여준다. 크로마토그램은 또한 이소프로판올 세척 및 이미다졸 프리 워시에 해당하는 185 mL 및 210 mL 총 부피에서 두 개의 다른 피크를 각각 나타낸다. 재조합 단백질의 분획 및 순도는 그라데이션 SDS-PAGE겔에 의해 확인되었다(도 3B). 관심 단백질은 주로 분획 68\u201279 (278\u2012300 mL 총 부피)에 위치하였다. 이러한 분획은 추가 분석을 위해 결합되었습니다. 항-그의 항체(N-말단) 및 167-D-IV 항체(C-종말)를 가진 웨스턴 블롯은 풀된 분획이 실제로 관심의 단백질임을 나타냈다(도4A,B). 이러한 블롯은 또한 SHB-SAPN 멀티머의 존재를 입증했다. 이전 의 세차 및 용출 분획은 다중 결합 된 단백질의 높은 농도를 포함하는 경향이 따라서 배제되었다.
관심 있는 단백질 단량체를 함유한 샘플을 투석에 의해 완전히 조립된 SHB-SAPN 내로 접혀하였다. 입자 크기 분포는 DLS 및 나노 입자 추적 분석(도5A,B)에 의해 결정되었다. DLS는 67 nm의 Z 평균 유체 역학 직경을 가진 입자를 확인했으며 NTA 시스템은 평균 크기81 nm를 측정했습니다. 약간의 크기 차이는 입자 크기 조정 기술로 인해 있었지만 두 분석의 크기는 20\u2012100nm 8,24,25의예상 범위에 있었습니다. SHB-SAPNs는 TEM에 의해 시각화되었고, 이미지는 두 개의 입자 크기 배분 기술로부터 얻어진 크기 분포를 가진 잘 형성된 개별 입자를 보였다(도5C).
단백질의 정제 동안, 컬럼은 최종 SHB-SAPN 제품에서 LPS 오염을 감소시키기 위해 이소프로판올로 세척하였다. 내독소 수준이 면역에 허용되는지 확인하기 위해, 이소프로판올 세척 단계유무에 관계없이 정제된 SHB-SAPN 샘플에서 LPS의 농도를 운동LAL 분석방식으로 결정하였다. 결과는 이소프로판올 세척이 내독소 수치를 SHB-SAPN 단백질의 0.010 EU/μg로 >0.25 EU/μg로 감소시키는 것으로 나타났다(표 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> 도 1: SHB-SAPN 단백질 서열 및 구조. (A) SHB-SAPN 단량체의 아미노산 서열. (B) 60개의 단백질 단량체로 구성된 완전히 조립된 SHB-SAPN 코어의 구조의 컴퓨터 모델. 아미노산 서열에 대한 색 구성표: 회색 = HisTag; 녹색 = 펜타머; 다크 블루 = 데 노보 디자인 트리머; 라이트 블루 = 6-나선 번들. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> 그림 2: SHB-SAPN 생산을 위한프로토콜. 색 구성표: 흑색 = 대장균에서단백질 단량체의 발현; 다크 그레이 = 단량체 정제; 중간 회색 = 단량체 식별; 연한 회색 = 다시 접기 및 특성화; 흰색 = 완전히 조립된 SHB-SAPN 제품. 어둡고 중간 회색으로 표지 된 단계에서, 단백질은 변성 및 감소 조건. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> 그림 3: SHB-SAPN 단량체의 단백질정제. (A) FPLC 정제로부터의 크로마토그래프. 크로마토그램 위의 녹색 선은 정제 단계를 나타낸다. 크로마토그램의 청색선은 280 nm 파장에서 분획의 광학 밀도를 나타낸다. 블랙 라인은 정제의 각 단계에서 사용된 완충B(8M 우레아, 20 mM Tris, 50 mM 인산나트륨 모노베이직, 5 mM TCEP, 500 mM 이미다졸, pH 8.5)의 백분율을 나타낸다. (B) 용해물 (L), 유동 (FT), 첫 번째 세척 (W1), 이소 프로판 올 워시 (W2), 세 번째 세척 (W3) 및 150 mM imidazole (E150) 및 500 mM 이미다졸 (E500) elution에서 개별 분획에서 풀화 된 분획의 SDS-PAGE 겔 정화. 첫 번째 레인(M)의 분자 마커는 10~250kDa 사이의 대역을 식별합니다. 표적 단백질은 검은 색 화살표로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> 그림 4: 서쪽 얼룩에 의한 단백질의 식별. 모든 레인에는 100 ng의 단백질이 들어 있습니다. (A) 안티 6x HisTag와 서쪽 얼룩의 결과. (B) 167-D-IV HIV-1 단일클론 항체를 가진 서쪽 얼룩의 결과. 차선은 다음과 같이 표기됩니다: M = 분자량 마커; 1 = 포세이트; 2 = 흐름을 통해; 3 = 첫 번째 세척; 4 = 이소프로판올 세척(두 번째 세척); 5 = 세 번째 세척; 6 = 풀풀된 볼륨 분수 56\u201261(첫 번째 용출 피크), 7 = 풀풀된 볼륨 파벌 62\u201267(두 피크 사이), 8 = 풀풀된 볼륨 분수 68\u201278(두 번째 용출 피크) 단모성 SHB-SAPN 대역으로서 18.07 kDa의 예상 대역 크기를 가진 표적 단백질은 검은 색 화살표로 지시된다. 7번 과 8번 차선의 추가 밴딩은 SHB-SAPN(빨간색 화살표)의 디머, 트리머 및 멀티머입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> 그림 5: 재접힌 SHB-SAPN의 특성화. (A). DLS에 의해 결정된 입자 크기 분포. (B) 나노 입자 추적 (시스템)에 의해 결정 된 입자 크기. (C) TEM에 의한 SHB-SAPN 입자의 시각화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>샘플</td>
			<td>내독소 (EU/mL)</td>
			<td>내독소 (단백질의 EU / μg)</td>
		</tr>
<tr>
<td>이소프로판올 워시를 곁들인 SAPN</td>
			<td>2.02</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>이소프로판 올 워시가 없는 SAPN</td>
			<td>>50</td>
			<td>>0.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>네거티브 컨트롤</td>
			<td>아래 검출 수준</td>
			<td>해당/A</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 다시 접힌 SHB-SAPNs의 내독소 수준. SHB-SAPN 단백질의 내독소 단위/mL 및 내독소 단위/μg로 제시된 이소프로판 세척유무에 관계없이 정제된 SHB-SAPN 샘플의 내독소 수치.

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Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

백신 개발에 사용하기 위한 자가 조립 단백질 나노입자(SAPN)의 정제, 재접이식 및 특성화를 설명하는 상세한 방법이 여기에 제공된다.

삼중 에피토프 프리젠 테이션을 필요로하는 백신을위한 대장균- 발현 자가 조립 단백질 나노 입자의 생산

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

자가 조립 단백질 나노 입자, 또는 SAPNs, 다양 한 전염병에 대 한 백신을 개발 하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서 설명하는 이 방법은 6개의 나선 번들을 포함하는 SAPNs를 정화, 재접기 및 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 나노 입자는 네이티브 와 같은 형태로 트리메릭 항원들을 제시 할 수 있습니다.약간의 수정으로 이 방법은 다른 혁신적인 SAPN 백신 구조에 적용될 수 있습니다. 또한 임상 시험을 위해 대규모 생산으로 쉽게 이전할 수 있습니다. 6개의 나선 번들 SAPN을 표현하는 수확된 E.coli의 용액을 위해, 초음파 처리 4초와 6초의 휴식으로 150와트의 초음파 처리 출력을 가진 프로브를 사용하여 얼음에 이미다졸프리 버퍼 40밀리리터에 세균 펠릿을 초음파 처리합니다.세포 용양을 원심분리하여 명확한 상체를 생성하고 상체를 멸균 150 밀리리터 플라스크로 이송합니다. 그런 다음, 신선한 imidazole 프리 버퍼와 100 밀리리터의 최종 볼륨까지 샘플을 가져. 관심 있는 단백질을 격리하려면 FPLC 소프트웨어를 열고 새 방법 옵션을 클릭합니다.메서드 설정 메뉴에서 열 위치 드롭다운 메뉴를 열고 C1 포트 3을 선택합니다. 기술로 표시된 드롭다운 메뉴에서 선호도를 선택합니다. 열 유형 드롭다운 메뉴에서 다른 사용자, HisTrap HP 및 5밀리리터를 선택합니다.열 볼륨 및 압력 상자는 자동으로 적절한 값으로 설정됩니다. 메서드 개요를 클릭하고 위상 라이브러리 메뉴를 닫기 전에 화살표 옆에 있는 위상 라이브러리 팝업 메뉴에서 평형 및 샘플 응용 프로그램 단추, 세 개의 열 세척 버튼 및 용출 버튼을 드래그합니다. 평형을 클릭하고 테이블에 나열된 값을 초기 버퍼 B, 4%최종 버퍼 B, 4%및 열 볼륨, 5로 설정합니다.샘플 응용 프로그램을 클릭합니다. 샘플 로딩 상자에서 샘플 펌프가 있는 컬럼의 샘플 주입을 위한 라디오 버튼을 클릭하고 시스템 펌프 상자가 있는 샘플 주입에서 메서드 설정의 유량 사용 옆에 있는 상자가 체크인지 확인합니다. 볼륨 박스 값을 100 밀리리터로 변경하고 분수 수집 체계를 사용하도록 변경합니다.메서드 설정 상자에서 분수 사용 크기를 클릭하고 분획 크기를 4밀리리터로 변경합니다. 첫 번째 열 세척 버튼을 클릭하고 테이블에 나열된 값을 초기 버퍼 B, 4%최종 버퍼 B, 4%및 열 볼륨 10으로 설정합니다. 분수 컬렉션 구성표 사용 상자를 클릭하고 메서드 설정에서 분수 사용 크기를 클릭합니다.분획 크기를 4밀리리터로 변경하고 두 번째 열 세척 버튼을 클릭합니다. 테이블의 값을 초기 버퍼 B, 0%최종 버퍼 B, 0%및 열 볼륨, 5로 설정합니다. 분수 컬렉션 구성표 사용 상자를 클릭하고 메서드 설정에서 분수 사용 크기를 클릭합니다.분획 크기를 4밀리리터로 변경하고 세 번째 열 세척 버튼을 클릭합니다. 테이블의 값을 초기 버퍼 B, 0%최종 버퍼 B, 0%및 열 볼륨, 10으로 설정합니다. 분획 컬렉션 구성표 사용 버튼을 클릭하고 메서드 설정 상자에서 분수 사용 크기를 클릭합니다.그런 다음 분획 크기를 4 밀리리터로 변경합니다. 용출 버튼을 클릭하고 테이블의 정보를 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 팝업 메뉴에서 단계 삭제를 클릭하고 Isocratic 그라데이션 버튼을 두 번 테이블에 드래그하여 두 개의 항목이 있습니다.초기 버퍼 B, 30%의 최종 버퍼 B, 30%및 열 볼륨, 10에 대한 첫 번째 항목에 대한 값을 설정합니다. 초기 버퍼 B, 100% 최종 버퍼 B, 100%및 열 볼륨, 10에 대한 두 번째 항목에 대한 값을 설정합니다. 분획 컬렉션 구성표 사용 버튼을 클릭하고 메서드 설정 상자에서 분수 크기 사용을 클릭합니다.그런 다음 저장을 클릭하여 파일 정화의 이름을 지정합니다. 펌프 FPLC의 튜브를 이미다졸이 없는 세척 버퍼에 넣고 펌프 B 튜빙을 500밀리머 이미다졸 버퍼에 넣습니다. 샘플 펌프 튜빙을 100밀리리터 샘플에 넣고 정화 프로그램을 실행합니다.60%의 이소프로판올 세척이 필요한 경우, 프로그램을 일시 중지하고, 펌프 A 튜브를 이미다졸 프리 워시에서 60%의 이소프로판올 세척으로 옮기고 프로그램을 다시 시작합니다. 세척이 끝나면 프로그램을 다시 일시 중지하고 펌프 A 튜브를 이미다졸 프리 워시 버퍼로 반환하고 정화 프로그램을 다시 시작합니다. 정제된 단백질의 순도를 평가하기 위해 먼저 흐름에서 분획을 결합하고, 세척하고, 2개를 씻고, 개별 50밀리리터 원뿔튜브에서 세 단계를 세척합니다.다음으로 각 샘플 튜브의 마이크로리터 15개를 2X Laemmli 버퍼 15개에 개별 0.5밀리터 미세센심분리기 튜브에 혼합하고 샘플을 섭씨 95도에서 10분 동안 분해합니다. 인큐베이션의 끝에서, 트리스-글리신 SDS-PAGE 러닝 버퍼에 3개의 얼룩없는 4 ~20% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 젤로 젤 러닝 장치를 설치하였다. 분자량 마커 8마이크로리터를 각 젤의 첫 번째 우물에 적재하고 30마이크로리터의 변성 시료를 다른 우물에 적재합니다.염료 전면이 젤 바닥에 닿을 때까지 200 볼트에서 젤을 실행하고 염색되지 않은 이미징 시스템으로 즉시 이미징하기 전에 탈이온 된 물로 젤을 간략하게 헹구습니다. 그런 다음 올바른 크기와 단백질 밴드를 포함하는 분획을 식별하고 이러한 분획을 풀수 있습니다. 6개의 나선 번들 SAPN 리폴딩의 경우, 10킬로달톤 분자량 컷오프 투석 카세트에 풀링 단백질 10~20밀리리터를 추가합니다.카세트를 8개의 어금니 우레아, 20밀리머 트리, 5%글리세롤, 5밀리머 TCEP로 밤새 실온에서 투석합니다. 다음 날 아침, 투석 버퍼의 우레아 농도를 2시간마다 2개의 어금니로 단계적으로 감소시켜 샘플에서 우레아를 천천히 투석한다. 우레아 농도가 2개의 어금니에 도달하면 투석 장치를 섭씨 4도로 이동하고 샘플을 120밀리몰라 우레아, 20밀리머 트리, 글리세롤 5%로 투석하여 하룻밤 사이에 다시 접는것을 완료합니다.다음 아침, 카세트에서 다시 접힌 단백질을 제거하고 0.22 마이크로미터 폴리 비닐리덴 불소 주사기 필터를 통해 6-나선 번들 SAPN을 필터링합니다. 6개의 나선 번들 SAPN의 평균 입자 크기를 측정하려면 일회용 큐벳에 6개의 나선 번들 SAPN 45 마이크로리터를 추가하고 CUvette를 DLS 기계에 배치합니다. 다음으로, 새로운 측정 파일을 만들고 120 밀리머 우레아, 20 밀리머 트리, 5%글리세롤 완충액에서 단백질에 대한 사전 작성된 표준 작동 절차를 섭씨 25도에서 실행합니다.그런 다음 측정을 시작합니다. Z 평균 크기, PDI 및 분포 결과는 각 실행에 대해 계산됩니다. 기계는 샘플을 다섯 번 읽습니다.완전히 조립된 6개의 나선 번들 SAPN은 단량체 60부를 포함하는 입자로 접을 것으로 예상되는 단백질 서열에 내장되어 있습니다. 총 세포 용액은 니켈 컬럼을 사용하여 FPLC에 의해 6-헬릭스 번들 SAPN 단조체를 정화하는 데 사용되었으며, 단백질이 150 밀리머 와 500 밀리머 이미다졸 모두에서 용출되었다는 것을 입증했습니다. 크로마토그램은 또한 이소프로판올 세척과 이미다졸 프리 워시에 해당하는 총 부피 185 및 210 밀리리터의 두 개의 다른 피크를 보여줍니다.재조합 단백질의 분획 및 순도는 주로 분수 68에서 79에 위치한 관심의 단백질을 가진 그라데이션 SDS-PAGE 젤에 의해 확인될 수 있었다. 항-His 및 항-167D4 항체를 가진 서양 얼룩 분석은 풀이 있는 분획이 실제로 관심있는 단백질이었다는 것을 표시했습니다. 또한 6개의 나선 번들 SAPN 멀티머의 존재를 보여주었습니다.관심 있는 단백질 단량체를 함유한 시료는 투석 및 입자 크기 분포에 의해 완전히 조립된 6-나선 번들 SAPN으로 접혀 DLS 및 나노입자 추적 분석에 의해 결정되었다. 투과 전자 현미경 검사법에 의한 시각화는 두 입자 크기 조정 기술으로부터 얻은 크기 분포와 잘 형성된 개별 6-나선 번들 SAPN 입자를 밝혀냈다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 6개의 나선 번들 SAPN의 재접기입니다.재폴딩 버퍼의 올바른 pH 및 이온 강도는 필수적입니다. 정제 시 이소프로판올 세척을 사용하여 오염 LPS를 매우 낮은 수준으로 줄일 수 있었습니다. 그러나 필요에 따라 음이온 교환 열을 사용하여 LPS를 추가로 줄일 수 있습니다.이 기술은 인간의 응용 프로그램에 쉽게 적응할 수 있습니다. 세균성 표현된 SAPN은 이미 다가오는 1/2a 말라리아 임상 시험을 위해 확장되었습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

막 단백질 폴딩의 열역학은 형광 분광학에 의해 측정

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

연구

생체공학

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanoprecipitation 기법을 통해 디블록 고분자 Nanoparticles의 제형

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

표적으로 바이러스 성 단백질의 분석은 HER2 + 종양에 전달 나노 입자

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

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Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

재생 연구를위한 고조파 나노 입자

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

액체에서의 펄스 레이저 어블 레이션에 의한 금속 나노 입자의 제조 : 나노 입자의 항균성 연구를위한 도구

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

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Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

간염 E 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...