Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en samarbeidsavtale (W81XWH-11-2-0174) mellom Henry M Jackson Foundation for fremming av militær medisin, Inc. og det amerikanske forsvarsdepartement. Anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV antistoff ble mottatt fra Dr. Susan Zolla-Pazner gjennom NIH AIDS reagens program.

<ol>
	<li>Karch, C. P., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+technologies:+From+whole+organisms+to+rationally+designed+protein+assemblies.">Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies.</a> Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).</li><li>Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Immunologic+Properties+of+Soluble+Versus+Particulate+Antigens.">Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens.</a> Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).</li><li>Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+basis+for+enhanced+immunity+of+nanoparticle+vaccines.">Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).</li><li>Yeates, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Principles+for+Designing+Highly+Symmetric+Self-Assembling+Protein+Nanomaterials.">Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).</li><li>Marcandalli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Potent+Neutralizing+Antibody+Responses+by+a+Designed+Protein+Nanoparticle+Vaccine+for+Respiratory+Syncytial+Virus.">Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus.</a> Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decorating+Self-Assembled+Peptide+Cages+with+Proteins.">Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins.</a> ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).</li><li>Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembling+Protein+Nanoparticles:+implications+for+HIV-1+vaccine+development.">Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development.</a> Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).</li><li>Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+design+of+peptides+that+self-assemble+into+regular+polyhedral+nanoparticles).">Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles).</a> Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+displaying+HIV-1+Env+V1V2+loop+in+a+native-like+trimeric+conformation+as+vaccine+antigen.">Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen.</a> Nanomedicine. , (2018).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+P.+falciparum+specific+coiled-coil+domain+to+construct+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+to+prevent+malaria.">The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-adjuvanted+nanoparticle+based+vaccine+against+infectious+bronchitis+virus.">A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus.</a> PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).</li><li>Wahome, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+display+of+4E10+and+2F5+epitopes+on+self-assembling+protein+nanoparticles+as+a+potential+HIV+vaccine.">Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+novel+immunogenic+nanoparticle+platform+for+Toxoplasma+peptide+vaccine+in+HLA+transgenic+mice.">Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice.</a> Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonadjuvanted+polypeptide+nanoparticle+vaccine+confers+long-lasting+protection+against+rodent+malaria.">A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria.</a> Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibody+and+CD8++T-cell+responses+to+the+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+protein+induced+by+a+nanoparticle+vaccine.">Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine.</a> PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).</li><li>Seth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+targeting+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+delivered+in+three+Army+Liposome+Formulation+adjuvants.">Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants.</a> Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+nanoparticles+with+built-in+flagellin+domains+increases+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+falciparum+based+vaccine.">Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine.</a> Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanovaccine+confers+robust+immunity+against+Toxoplasma.">Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma.</a> NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+self-adjuvanted+protein+nanoparticles+provides+protection+against+lethal+influenza+challenge.">Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge.</a> Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).</li><li>Haynes, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-correlates+analysis+of+an+HIV-1+vaccine+efficacy+trial.">Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial.</a> New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).</li><li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand.">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).</li><li>O&#39; Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+gp120+V1V2+loop:+structure,+function+and+importance+for+vaccine+development.">The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development.</a> Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).</li><li>Babapoor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Vaccine+Using+Nanoparticle+Platform+to+Present+Immunogenic+M2e+against+Avian+Influenza+Infection.">A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection.</a> Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).</li><li>Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+self-assembling+protein+nanoparticle+architectures+for+applications+in+vaccine+design.">Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design.</a> Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).</li><li>Indelicato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+Governing+the+Self-Assembly+of+Coiled-Coil+Protein+Nanoparticles.">Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles.</a> Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).</li><li>Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+assemblies+and+their+biomedical+applications.">Nanoscale assemblies and their biomedical applications.</a> Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).</li><li>Rey, F. A., Lok, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Features+of+Enveloped+Viruses+and+Implications+for+Immunogen+Design+for+Next-Generation+Vaccines.">Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines.</a> Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Endotoxins.">Bacterial Endotoxins.</a> United States Pharmacopeia (USP). , (2011).</li><li>. Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/media/76255/download">https://www.fda.gov/media/76255/download</a> (1993)</li></ol>

Synspunktene uttrykt er de av forfatterne og bør ikke tolkes til å representere posisjonene til den amerikanske hæren eller Department of Defense. Peter Burkhard har en interesse i selskapet som heter Alpha-O peptider AG og har patenter på teknologien. De andre forfatterne har ingen tilknytning eller økonomisk engasjement med noe selskap med en finansiell interesse på emnet som presenteres i denne utredningen.

Nanoteknologi gir mange fordeler og løsninger for delenhet vaksine utvikling. Nanovaccines kan gjentatte ganger presentere antigener som partikler til verts immunsystemet øker immunogenisitet26. Mens det er mange forskjellige typer Nanovaccines, tror vi at de består av de Novo designet protein synes å være den sterkeste tilnærmingen for vaksine utvikling1. De kan være konstruert uten noen sekvens homologi til verten proteiner og presentere antigen av interesse i nær native-like konformasjon samtidig som lave produksjonskostnader og høy produkt avkastning. Et godt eksempel på denne tilnærmingen er SAPN teknologi, som vi har søkt på vaksiner mot flere smittsomme sykdommer7. Adressering vanskelighetene i HIV-1 vaksine utvikling, har vi utviklet en unik SHB-SAPN kjerne for effektivt å presentere V1V2 antigen i en innfødt-lignende trimeric konformasjon9. Mange vaksine mål, spesielt for virussykdommer, er tilstede som trimers27. Dette fenomenet indikerer at vår SAPN design har bred implikasjoner for utviklingen av delenhet vaksiner.
I denne metoden demonstrerer vi hvordan man produserer SHB-SAPNs i et E. coli Expression system. Vi uttrykte høye avlinger av protein (ca 6 mg/100 mL kultur). Proteinet inneholdt 10 histidines og ble lett renset ved hjelp av en immobilisert metall affinitet kromatografi med ni2 + kolonne. Denne lengden av HIS-tag ble funnet å være den optimale for den høyeste protein yield. Renset proteinet inneholdt full lengde av designet protein som indikert av tilstedeværelsen av både N-Terminal HisTag og C-terminalen heptad gjenta. Vi benyttet allment aksepterte teknikker og optimalisert dem for uttrykk, produksjon og karakterisering av SHB-SAPN kjernen. Mangel på produksjon av full-lengde protein under utviklingen av en SAPN inneholder et nytt protein epitope kan indikere et uttrykk problem av genet i verten cellen. Hvis det skjer, må genet og uttrykks systemet være redesignet og tilpasset den beskrevne protokollen. Modifisering av sonikering tid eller intensitet kan også øke konsentrasjonen av spådd full-lengde protein.
Ombrettes partikler var i forventet størrelsesområde (20 til 100 NM)8,24,25 som bestemmes av DLS og nanopartikkel Tracking analyse. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved hjelp av TEM. Hvis det er problemer i dette trinnet, er det normalt på grunn av et problem med pH eller ioniske styrke refolding buffer. Når stor størrelse partikler oppdages på partikkel dimensjonering teknikker, indikerer det aggregering, som kan unngås ved å øke pH i refolding buffer. Hvis partiklene ikke oppdages av DLS, verifisere konsentrasjonen av proteinet og sjekk pH i bufferen. Den endelige protein konsentrasjonen for DLS bør være minst 100 μg/mL. Hvis konsentrasjonen er ikke problemet, indikerer det overflod av små, ufullstendig dannet partikler, hvis konsentrasjonen kan reduseres ved å redusere pH. Alternativt kan natriumklorid konsentrasjonen justeres til det optimale området for å minimere tilstedeværelsen av partikler med uønsket størrelse.
Til slutt, ved hjelp av en isopropanol vasketrinn under rensing vi var i stand til å redusere forurensende LPS fra verten E. coli til 0,01 EU/ΜG av SAPN som er under Food and Drug ADMINISTRATION (FDA) grense på 5 EU/kg kroppsvekt for injiserbare produkter 28. dette nivået kan bli ytterligere redusert ved å bruke en anion utvekslings Kol onnen også kjent som Q kolonne. Hvis høye nivåer av endotoksin er fortsatt til stede, sjekk alle materialer som ble brukt for buffer forberedelse. Husk å bruke bare depyrogenated glass og endotoksin gratis plasticware i denne metoden.
Disse resultatene tyder på at vi har med hell utviklet en metode for å produsere SHB-SAPN kjernen som kan brukes for pre-kliniske immunisering studier. Denne metoden med bare små modifikasjoner, om noen, kan brukes til rensing av SHB-SAPNs når et antigen av interesse er lagt til. Ved hjelp av denne metoden som utgangspunkt en av de store endringene er i eluering trinn. Ulike proteiner eluere ved ulike imidazole konsentrasjoner som må fastsettes eksperimentelt. Den andre store forskjellen kan være sammensetningen av refolding buffer. Optimalisering vil kreve testing ulike pH forhold samt ioniske styrker.
I betraktning av fremtidig arbeid, er det bare to små modifikasjoner som trengs for å tillate menneskelig anvendelse av SHB-SAPN. Den første er at uttrykket vektoren må endres til en kanamycin motstand valgbar markør på grunn av Ampicillin allergi hos mennesker29. Det annet større behov av det protein fremstiller for Human bruk er å tilvirke det SHB-SAPN inne dyr fabrikat-ledig Media. En liten studie indikerte allerede en rimelig utbytte av protein i en plantebasert Media. Arbeidet som presenteres her er lett skalerbar for endelig GMP produksjon som demonstrert med en malaria vaksine kandidat, FMP01416. Denne stor skala FMP014-SAPN-produksjonen inkluderte både den anion utvekslingen og de avgjørende utvekslings trinnene for å redusere LPS og ni2 + innhold fra det endelige produktet. Dette bakteriell-uttrykt SAPN er allerede skalert opp for en kommende fase 1/2a klinisk studie.

Mens tradisjonell vaksine utvikling har fokusert på inaktive eller svekkede patogener, har fokus for moderne vaksiner forskjøvet mot delenhet vaksiner1. Denne tilnærmingen kan føre til en mer målrettet respons, og potensielt mer effektiv vaksine kandidater. Men en av de viktigste ulempene er at delenhet vaksiner er ikke partikler som hele organismer som kan resultere i redusert immunogenisitet2. En nanopartikkel som et repeterende antigen display system kan ha fordelene av både målrettede delenhet vaksine tilnærming samt partikler natur hele organismen1,3.
Blant de eksisterende typer Nanovaccines, rasjonelt utformet protein forsamlinger tillate design og utvikling av vaksine kandidater som kan presentere flere eksemplarer av antigen potensielt i en innfødt-lignende konformasjon1,4 ,5,6. Et eksempel på disse protein forsamlinger er selv-sammenstillingen protein nanopartikler (SAPNs)7. SAPNs er basert på spiral-coil domener og er tradisjonelt uttrykt i Escherichia coli8. SAPN vaksine kandidater har blitt utviklet for en rekke sykdommer som malaria, Sars, influensa, toxoplasmosis og HIV-19,10,11,12,13 , 14 priser og priser , 15 priser og , 16 flere , 17 i , 18 av år , 19. utformingen av hver SAPN kandidat er spesifikk for patogen av interesse, men produksjonen, rensing, og refolding teknikker er generelt bredt aktuelt.
En av våre nåværende interesser er en effektiv HIV-1-vaksine. I RV144 — den eneste fase III kliniske studien av en HIV-1-vaksine som viste beskjeden effekt – den reduserte risikoen for infeksjon var korrelert med IgG antistoffer mot V1V2-løkken i konvolutt proteinet20,21. Den innfødte-lignende trimeric presentasjon av denne regionen antas å være viktig for beskyttende immunogenisitet22. Å presentere V1V2 sløyfe i så nær native-like konformasjon som mulig, vi utviklet et bevis på prinsippet SAPN vaksine kandidat som inneholdt HIV-1 konvolutt etter fusjon seks-Helix Bundle (SHB) å presentere V1V2 sløyfe i riktig konformasjon9 . Denne kandidaten ble anerkjent av kjente monoklonale antistoffer mot HIV-1 konvolutt protein. Mus vaksineres med V1V2-SHB-SAPN hevet V1V2 spesifikke antistoffer, som, viktigst, bundet til gp70 V1V2, riktig conformational epitopes9. Den SHB-SAPN kjernen kunne ha andre funksjoner utover rollen som en operatør for HIV-1 V1V2 loop. Her beskriver vi en detaljert metodikk for uttrykk, rensing, refolding og validering av SHB-SAPN kjerne. Sekvensen utvalg, nanopartikkel design, den molekylære kloning, og transformasjon av E. coli har tidligere blitt beskrevet9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

Selv montering av protein nanopartikler (SAPNs) fungerer som repeterende antigen-skjermer og kan brukes til å utvikle et bredt spekter av vaksiner for ulike infeksjonssykdommer. I denne artikkelen viser vi en metode for å produsere en SAPN kjerne inneholder en seks-Helix Bundle (SHB) forsamling som er i stand til å presentere antigener i en trimeric konformasjon. Vi beskriver uttrykket av SHB-SAPN i et E. coli -system, i tillegg til de nødvendige trinnene for protein rensing. Vi inkluderte en isopropanol vasketrinn for å redusere den gjenværende bakterielle lipopolysakkarid. Som en indikasjon på protein identitet og renhet, reagerte proteinet med kjente monoklonale antistoffer i Western Blot-analyser. Etter refolding falt størrelsen på partiklene i det forventede området (20 til 100 NM), som ble bekreftet av dynamisk lysspredning, nanopartikkel sporings analyse og overføring av elektron mikroskopi. Metodikken som beskrives her, er optimalisert for SHB-SAPN, men med bare små endringer kan den brukes på andre SAPN-konstruksjoner. Denne metoden er også lett overførbar til Storskalaproduksjon for GMP produksjon for menneskelige vaksiner.

Den ferdig monterte SHB-SAPN som vises her, er bygget på protein sekvenser (figur 1a) som antas å brettes inn i en partikkel som inneholder 60 eksemplarer av monomer (figur 1B). Figur 2 gir en oversikt over metoden for produksjon, rensing og identifisering av SHB-SAPN kjerne. E. coli fra en glyserol lager som inneholdt en PPep-T uttrykk vektor med Gen SEKVENS av SHB-SAPN kjernen ble indusert i BL21 (DE3) E. coli. Bakterielle celler ble vellykket dyrket og lysert under denaturering og redusere forholdene.
Totalt celle lysat ble brukt til å rense SHB-SAPN monomerer av FPLC ved hjelp av en ni2 + kolonne (figur 3a). FPLC-kromatografisk demonstrerer at protein eluert både på 150 mM og 500 mM imidazole (figur 3a). Kromatogram viser også to andre topper på 185 mL og 210 mL totalt volum tilsvarende isopropanol vask og imidazole-fri vask, henholdsvis. Fraksjoner og renheten av rekombinant protein ble identifisert ved gradient SDS-PAGE gels (figur 3b). Proteinet av interesse var hovedsakelig plassert i fraksjoner 68 \ u201279 (278 \ u2012300 mL totalt volum). Disse fraksjonene ble kombinert for videre analyser. Western Blot med anti-His antistoff (N-Terminal) og 167-D-IV antistoff (C-Terminus) indikerte at de samlede fraksjoner var faktisk proteinet av interesse (figur 4a, B). Disse blots viste også tilstedeværelsen av SHB-SAPN multimers. Tidligere vasker og eluering fraksjoner tendens til å inneholde en høyere konsentrasjon av multimerized protein og ble derfor ekskludert.
Prøvene som inneholdt protein monomerer av interesse ble foldet inn i ferdig montert SHB-SAPN av dialyse. Partikkelstørrelsesfordelingen ble bestemt av DLS og nanopartikkel sporings analyse (figur 5a, B). DLS identifiserte partikler med en Z-gjennomsnittlig hydrodynamisk diameter på 67 NM mens NTA systemet målte en gjennomsnittlig størrelse på 81 NM. Liten størrelse forskjellene skyldtes partikkel dimensjonering teknikker, men størrelsen fra begge analysene var i forventet område på 20 \ u2012100 NM8,24,25. SHB-SAPNs ble vist ved TEM og bildene viste godt formede individuelle partikler med størrelsesfordelingen fra de to partikkel størrelses teknikkene (figur 5c).
Under rensing av proteinet ble kolonnen vasket med isopropanol for å redusere LPS-forurensningen i det endelige SHB-SAPN-produktet. For å verifisere om endotoksin nivået var akseptabelt for immunisering, ble konsentrasjonen av LPS i SHB-SAPN prøver renset med eller uten isopropanol vaske trinnet ble bestemt av en kinetisk LAL analysen. Resultatene indikerte at isopropanol vask reduserte endotoksin nivåer fra > 0,25 EU/μg til 0,010 EU/μg av SHB-SAPN protein (tabell 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> Figur 1: SHB-SAPN protein sekvens og struktur. (A) aminosyren SEKVENSEN av SHB-SAPN monomer. (B) datamaskinmodell av strukturen av den fullt monterte SHB-SAPN-kjernen bestående av 60 protein monomerer. Fargevalg for aminosyre-sekvenser: grå = HisTag; Grønn = pentamer; Mørk blå = de Novo designet trimer; Lyseblå = seks-Helix bunt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> Figur 2: flytskjema for protokoll for SHB-SAPN produksjon. Fargevalg: svart = uttrykk for proteinet monomer i E. coli; Mørkegrå = monomer rensing; Medium grå = monomer identifikasjon; Lys grå = refolding og karakterisering; Hvit = ferdig montert SHB-SAPN-produkt. I trinn merket med mørk og middels grå, er proteinet under denaturering og reduserer forhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> Figur 3: protein rensing av SHB-SAPN-monomerer. (A) KROMATOGRAFISK fra FPLC rensing. Grønn linje over kromatogram indikerer rense trinnene. Blå linje i kromatogram representerer den optiske tettheten av fraksjoner ved 280 NM bølgelengde. Den svarte linjen viser hvor mange prosent av buffer B (8 M urea, 20 mM Tris, 50 mM natrium fosfat enbasisk, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazole, pH 8,5) som ble brukt i hvert trinn av rensing. (B) SDS-Page gels av de grupperte fraksjoner fra Lysat (L), strømme gjennom (ft), første vask (W1), isopropanol vask (W2), tredje vask (w3), og individuelle fraksjoner fra 150 mm Imidazole (E150) og 500 mm Imidazole (E500) eluering trinn i Rensing. Molekylære markører i første kjørefelt (M) identifiserer bånd mellom 10 og 250 kDa. Mål proteinet indikeres av en svart pil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> Figur 4: identifisering av proteinet ved Western Blot. Alle kjørefelt er lastet med 100 ng av protein. (A) resultatene av en Western Blot med anti-6-HisTag. (B) resultater av en Western Blot med et 167-D-IV HIV-1-monoklonale antistoff. Lanes er merket som: M = molekylvekt markør; 1 = lysat; 2 = strømme gjennom; 3 = vask først; 4 = isopropanol vask (andre vask); 5 = tredje vask; 6 = grupperte volum fraksjoner 56 \ u201261 (første eluering topp), 7 = grupperte volum fraksjoner 62 \ u201267 (mellom de to toppene), 8 = grupperte volum brøker 68 \ u201278 (andre eluering topp). Target protein med forventet bandet størrelse på 18,07 kDa som monomere SHB-SAPN bandet er indikert med en svart pil. Ekstra bånd i kjørefelt 7 og 8 er dimers, trimers og multimers av SHB-SAPN (rød pil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> Figur 5: karakterisering av OMBRETTES SHB-SAPN. (A). Partikkelstørrelsesfordeling som BESTEMMES av DLS. (B) partikkelstørrelse som bestemmes av nanopartikkel Tracking (system). (C) VISUALISERING av SHB-SAPN partikler av tem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Eksempel</td>
			<td>Endotoksin (EU/mL)</td>
			<td>Endotoksin (EU/mikrogram protein)</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN med isopropanol vask</td>
			<td>2,02</td>
			<td>0,01</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN uten isopropanol Wash</td>
			<td>> 50</td>
			<td>> 0,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Negativ kontroll</td>
			<td>Under deteksjons nivå</td>
			<td>N/a</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: endotoksin nivåer av OMBRETTES SHB-SAPNs. Endotoksin nivåer i SHB-SAPN prøver renset med eller uten en isopropanol vask presentert både som endotoksin enheter/mL og endotoksin enheter/μg av SHB-SAPN protein.

Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

En detaljert metode er gitt her beskriver rensing, refolding, og karakterisering av selv-montering protein nanopartikler (SAPNs) for bruk i vaksine utvikling.

Produksjon av E. coli-uttrykte selv-montering protein nanopartikler for vaksiner som krever Trimeric epitope presentasjon

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Selvmontering av proteinnanopartikler, eller SAPNer, kan brukes til å utvikle vaksiner mot ulike smittsomme sykdommer. Denne metoden som vi beskriver her, kan brukes til å rense, omfolde og karakterisere SAPNer som inneholder en seks-helix-bunt. Denne nanopartikkelen kan presentere trimeriske antigener i en innfødt-lignende konformasjon.Med små modifikasjoner kan denne metoden brukes på andre innovative SAPN-vaksinekonstruksjoner. Videre kan det lett overføres til storskala produksjon for kliniske studier. For lysis av høstet E.coli uttrykker seks-helix bunt SAPN, bruk en sonde med sonikering utgang på 150 watt med fire sekunder sonikering og seks sekunder hvile, for å sonicate resuspended bakteriellpellets i 40 milliliter i imidazol-fri buffer på is i fem minutter.Sentrifuge cellulær lysate for å generere en avklart supernatant og overføre supernatant til en steril 150-milliliter kolbe. Deretter, bringe prøven opp til et endelig volum på 100 milliliter med fersk imidazol-fri buffer. Hvis du vil isolere proteinet av interesse, åpner du FPLC-programvaren og klikker på alternativet Ny metode.Åpne rullegardinmenyen Kolonneplassering på Metodeinnstillinger-menyen, og velg C1 Port 3. Velg Affinitet i rullegardinmenyen Vist etter teknikk. Velg Andre, HisTrap HP og fem milliliter på rullegardinmenyen Kolonnetype.Kolonnevolumet og Trykk-boksene settes automatisk til de riktige verdiene. Klikk Metodeomriss, og dra knappene Likevekt og eksempelprogram, tre kolonnevaskknapper og Elution-knappen fra popup-menyen fasebibliotek ved siden av pilen før du lukker Fasebibliotek-menyen. Klikk Likevekt, og sett verdiene som er oppført i tabellen, til Startbuffer B, 4 %Endelig buffer B, 4 %og kolonnevolum, fem.Klikk eksempelprogram. Klikk alternativknappen for Injiser prøve på kolonne med prøvepumpe i eksempelinnlasting-boksen, og bekreft at det er merket av for Bruk strømningshastighet fra metodeinnstillinger i boksen Prøveinjeksjon med systempumpe. Endre volumboksverdien til 100 milliliter og Brøksamlingsoppsettet som skal aktiveres.Løsne boksen Bruk brøkstørrelse fra metodeinnstillinger, og endre Brøkstørrelse til fire milliliter. Klikk på den første Kolonnevask-knappen, sett verdiene som er oppført i tabellen til Første buffer B, 4% Endelig buffer B, 4% og Kolonnevolum, 10. Klikk boksen Aktiver brøksamlingsoppsett, og koble fra boksen Bruk brøkstørrelse fra metodeinnstillinger.Endre brøkstørrelsen til fire milliliter, og klikk den andre Kolonnevask-knappen. Sett verdiene i tabellen til Startbuffer B, 0 %Endelig buffer B, 0 %og Kolonnevolum, fem. Klikk boksen Aktiver brøksamlingsoppsett, og koble fra boksen Bruk brøkstørrelse fra metodeinnstillinger.Endre Brøkstørrelse til fire milliliter, og klikk den tredje Kolonnevask-knappen. Sett verdiene i tabellen til Startbuffer B, 0%Endelig buffer B, 0 %og Kolonnevolum, 10. Klikk knappen Aktiver brøksamlingsoppsett, og koble fra boksen Bruk brøkstørrelse fra metodeinnstillinger.Deretter endrer du brøkstørrelsen til fire milliliter. Klikk på Elution-knappen og høyreklikk informasjonen i tabellen. Klikk Slett trinn på hurtigmenyen, og dra isokratisk graderingsknappen til tabellen to ganger, slik at det er to oppføringer.Sett verdien for den første oppføringen til Første buffer B, 30 % endelig buffer B, 30 % og kolonnevolum, 10. Sett verdien for den andre oppføringen til Første buffer B, 100 % endelig buffer B, 100 %og kolonnevolum, 10. Klikk knappen Aktiver brøksamlingsoppsett, og klikk boksen Bruk brøkstørrelse fra metodeinnstillinger.Klikk deretter Lagre som og gi filen et navn, rensingen. Plasser pumpen En slange av FPLC i den imidazolfrie vaskebufferen, og pumpen B-slangen inn i den 500 millimolar imidazolbufferen. Plasser prøvepumpeslangen i 100-milliliter prøven og kjør renseprogrammet.Når 60% isopropanol vask er nødvendig, pause programmet, flytte pumpen En slange fra imidazol-fri vask inn i 60% isopropanol vask, og starte programmet på nytt. På slutten av vasken, pause programmet igjen, returnere pumpen A rør til imidazole-fri vaskebuffer, og starte rensing programmet. For å vurdere renheten av det rensede proteinet, kombiner først fraksjonene fra strømmen gjennom, vask en, vask to og vask tre trinn, i individuelle 50-milliliter koniske rør.Bland deretter 15 mikroliter fra hvert prøverør med 15 mikroliter 2X Laemmli-buffer i individuelle 0,5-milliliter mikrocentrifugerør og denaturere prøvene ved 95 grader Celsius i 10 minutter. På slutten av inkubasjonen, sette opp en gel kjører apparater med tre flekkfri fire til 20% prefabriker polyakrylamid geler i Tris-Glycine SDS-PAGE kjører buffer. Legg åtte mikroliter med molekylær vektmarkør til den første brønnen av hver gel og 30 mikroliter denaturert prøve til de andre brønnene.Kjør gelene på 200 volt til fargestofffronten treffer bunnen av gelen og skyll gelene kort med deionisert vann før du umiddelbart avbilder med et flekkfritt bildesystem. Deretter identifiserer du brøkene som inneholder proteinbånd med riktig størrelse og basseng disse brøkene. For sapn-omlegging med seks helixbunt, tilsett 10 til 20 milliliter med samlet protein til en 10 kilodaltonmolekylærvektskuttdialysekassett.Dialyser kassetten i åtte molar urea, 20-millimolar Tris, 5% glyserol og fem millimolar TCEP ved romtemperatur over natten. Neste morgen, redusere urea konsentrasjonen i dialysebufferen trinnvis med to molar annenhver time for å sakte dialyze urea av prøven. Når ureakonsentrasjonen når to molar, flytt dialyseapparatet til fire grader Celsius og dialyser prøven til 120-millimolar urea, 20-millimolar Tris og 5% glyserol over natten for å fullføre refoldingen.Neste morgen fjerner du det refoldede proteinet fra kassetten og filtrerer sapn med seks helix gjennom et 0,22-mikrometerpolyvinylidfluord sprøytefilter. For å måle den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen på SAPN med seks helix, legg til 45 mikroliter med seks helixbunt SAPN til en engangs cuvette og plasser cuvette i DLS-maskinen. Deretter oppretter du en ny målefil og kjører en forhåndsskrevet standard driftsprosedyre for protein i 120-millimolar urea, 20-millimolar Tris og 5% glyserolbuffer ved 25 grader Celsius.Deretter starter du målingen. Z-gjennomsnittsstørrelsen, PDI og distribusjonsresultatene beregnes for hver kjøring. Maskinen vil lese prøven fem ganger.Denne ferdig monterte seks-helix bunt SAPN er bygget på proteinsekvenser som er spådd å brette inn i en partikkel som inneholder 60 kopier av monomeren. Totalt cellelylat ble brukt til å rense seks-helix bunt SAPN monomerer av FPLC ved hjelp av en nikkelkolonne, som viser at proteinet eluted på både 150 og 500-millimolar imidazol. Kromatrammet viser også to andre topper på henholdsvis 185 og 210 milliliter totalt volum tilsvarende isopropanolvasken og den imidazolfrie vasken.Fraksjonene og renheten av det rekombinante proteinet kan identifiseres ved gradient SDS-PAGE geler med protein av interesse primært plassert i fraksjon 68 til 79. Western blot analyse med anti-Hans og anti-167D4 antistoffer indikerte at de samlede brøkene var faktisk protein av interesse. Blots demonstrerte også tilstedeværelsen av seks-helix bunt SAPN multimers.Prøvene som inneholdt proteinmonomerer av interesse ble brettet inn i den ferdigmonterte seks-helix bunt SAPN ved dialyse og partikkelstørrelsesfordeling ble bestemt av DLS og nanopartikkelsporingsanalyse. Visualisering ved overføring av elektronmikroskopi avslørte velformede individuelle seks-helix bunt SAPN-partikler med størrelsesfordelingen hentet fra de to partikkelstørrelsesteknikkene. Det viktigste trinnet i denne protokollen er omleggingen av SAPN for seks helix-bunten.Riktig pH og ionisk styrke av refolding bufferen er avgjørende. Ved hjelp av en isopropanol vask under rensing, vi var i stand til å redusere forurensende LPS til et svært lavt nivå. LPS kan imidlertid reduseres ytterligere ved hjelp av en anionutvekslingskolonne etter behov.Denne teknologien kan enkelt tilpasses for menneskelig bruk. En bakteriell uttrykt SAPN har allerede blitt skalert opp for en kommende fase 1/2a malaria klinisk studie.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Dyrking av Human Neural stamceller i en 3-dimensjonal Self-montering Peptid Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Analyse av målrettet Viral Protein Nanopartikler Levert til HER2 + Svulster

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanopartikler for regenerativ Forskning

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Produksjon av metall nanopartikler ved pulserende laserablation i væsker: Et verktøy for å studere de antibakterielle egenskapene til nanopartikler

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generisk protokoll for optimalisering av Heterologous Protein produksjonen ved hjelp av automatisert Microbioreactor teknologi

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Overflate Functionalization av hepatitt E Virus nanopartikler bruke kjemiske Bøyning

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Produksjonen av Elastin som Protein Hydrogels for innkapsling og immunostai-celler i 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...