Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por um acordo cooperativo (W81XWH-11-2-0174) entre a Fundação Henry M Jackson para o avanço da medicina militar, Inc., e o departamento de defesa dos EUA. O anticorpo anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV foi recebido do Dr. Susan Zolla-Pazner através do programa de reagente de AIDS da NIH.

<ol>
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Os pontos de vista expressos são os dos autores e não devem ser interpretados para representar as posições do exército dos EUA ou do departamento de defesa. Peter Burkhard tem um interesse na empresa chamada Alpha-O peptídeos AG e tem patentes sobre a tecnologia. Os demais autores não têm afiliação ou envolvimento financeiro com qualquer empresa com interesse financeiro no assunto apresentado neste artigo.

A nanotecnologia oferece muitas vantagens e soluções para o desenvolvimento de vacinas de subunidades. Nanovaccines pode repetidamente apresentar antígenos como particulados ao sistema imunológico hospedeiro aumentando a imunogenicidade26. Embora existam muitos tipos diferentes de nanovaccines, acreditamos que os compostos de proteína projetada de novo parecem ser a abordagem mais forte para o desenvolvimento da vacina1. Podem ser projetados sem nenhuma homologia da seqüência às proteínas do anfitrião e apresentar o antígeno do interesse perto do nativo-como a conformação ao fornecer o baixo custo de produção e rendimentos elevados do produto. Um excelente exemplo dessa abordagem é a tecnologia SAPN, que temos aplicado a vacinas contra múltiplas doenças infecciosas7. Abordando as dificuldades no desenvolvimento da vacina HIV-1, nós projetamos um núcleo SHB-SAPN original para apresentar eficazmente o antígeno de V1V2 em uma conformação de trimérico nativa-como9. Muitos alvos vacinais, particularmente para doenças virais, estão atuais como trímeros27. Este fenômeno indica que nosso projeto de SAPN tem implicações largas para o desenvolvimento de vacinas do subunidade.
Neste método, demonstramos como produzir SHB-SAPNs em um sistema de expressão de E. coli . Nós expressamos rendimentos elevados da proteína (aproximadamente 6 mg/100 mL da cultura). A proteína continha 10 histidinas e foi facilmente purificada usando uma cromatografia de afinidade metálica imobilizada com a coluna Ni2 + . Este comprimento do his-tag foi encontrado para ser o ideal para o rendimento o mais elevado da proteína. A proteína purificada continha o comprimento total da proteína projetada como indicado pela presença do N-terminal histag e da repetição de criselefantina terminal C. Foram utilizadas técnicas amplamente aceitas e otimizadas para a expressão, produção e caracterização do núcleo SHB-SAPN. A falta da produção da proteína full-length durante o desenvolvimento de um SAPN que contem um epítopo novo da proteína poderia indicar um problema da expressão do gene na pilha de anfitrião. Se isso acontecer, o gene e o sistema de expressão devem ser redesenhados e adaptados ao protocolo descrito. A modificação do tempo ou da intensidade da sonicação também pode aumentar a concentração da proteína de comprimento total prevista.
As partículas redobradas estavam na escala esperada do tamanho (20 a 100 nanômetro)8,24,25 como determinado por DLS e pela análise de seguimento da nanopartícula. Esses resultados foram confirmados com o uso de TEM. Se há uns problemas nesta etapa, é normalmente devido a um problema com o pH ou a força iónica do amortecedor de redobramento. Quando partículas de tamanho grande são detectadas nas técnicas de dimensionamento de partículas, ela indica agregação, que pode ser evitada aumentando o pH do buffer de redobramento. Se as partículas não forem detectadas pela DLS, verifique a concentração da proteína e verifique o pH do tampão. A concentração final de proteínas para DLS deve ser de pelo menos 100 μg/mL. Se a concentração não é o problema, indica a abundância de partículas pequenas, incompletamente formadas, cuja concentração pode ser reduzida diminuindo o pH. Alternativamente, a concentração do cloreto de sódio pode ser ajustada à escala a melhor para minimizar a presença de partículas com tamanho indesejado.
Finalmente, usando uma etapa da lavagem do isopropanol durante a purificação nós pudemos reduzir contaminando LPS do anfitrião e. coli a 0, 1 eu/ΜG de SAPN que está abaixo do limite da administração do alimento e da droga (FDA) de 5 UE/quilograma do peso corporal para produtos injetáveis o nível 28. this pode mais ser reduzido usando uma coluna da troca do aníon igualmente conhecida como a coluna de Q. Se os altos níveis de endotoxina ainda estão presentes, verifique todos os materiais que foram utilizados para a preparação do tampão. Recorde usar somente os produtos vidreiros depyrogenated e o plasticware livre da endotoxina neste método.
Estes resultados indicam que nós desenvolvemos com sucesso um método para produzir o núcleo de SHB-SAPN que pode ser usado para estudos pre-Clinical da imunização. Este método com apenas ligeiras modificações, se houver, pode ser aplicado à purificação de SHB-SAPNs quando um antígeno de interesse é adicionado. Usando esse método como um ponto de partida uma das principais alterações está na etapa de eluição. Proteínas diferentes eluir em concentrações diferentes do imidazol que devem ser determinadas experimentalmente. A outra diferença principal pode ser a composição do buffer de redobramento. A otimização exigiria testar diferentes condições de pH, bem como forças iônicas.
Em consideração do trabalho futuro, somente duas modificações ligeiras são necessárias para permitir a aplicação humana do SHB-SAPN. O primeiro é que o vetor da expressão precisa de ser mudado a um marcador selecionável da resistência do canamicina devido à alergia da ampicilina nos seres humanos29. A outra exigência principal da fabricação da proteína para o uso humano é produzir o SHB-SAPN em meios produto-livres animais. Um estudo de pequena escala já indicou um rendimento razoável de proteínas em uma mídia baseada em plantas. O trabalho apresentado aqui é facilmente escalável para a produção final GMP como demonstrado com um candidato a vacina contra a malária, FMP01416. Esta produção de grande escala FMP014-SAPN incluiu tanto a troca aniónica e as etapas de troca catiónica para reduzir ainda mais LPS e Ni2 + conteúdo do produto final. Este SAPN bacteriano-expressado foi aumentado já para um próximo ensaio clínico de fase 1/2a.

Enquanto o desenvolvimento tradicional da vacina se concentrou nos patógenos inativados ou atenuados, o foco das vacinas modernas mudou para as vacinas de subunidades1. Esta abordagem pode levar a uma resposta mais orientada, e potencialmente mais eficaz vacina candidatos. No entanto, um dos principais inconvenientes é que as vacinas subunitárias não são particulados como organismos inteiros que podem resultar em imunogenicidade reduzida2. Uma nanopartícula como um sistema de exibição de antígeno repetitivo pode ter os benefícios tanto da abordagem da vacina de subunidade direcionada quanto da natureza particulada de todo o organismo1,3.
Entre os tipos existentes de nanovaccines, os conjuntos de proteína projetados racionalmente permitem o projeto e o desenvolvimento de candidatos vacinais que podem apresentar cópias múltiplas do antígeno potencial em uma conformação nativo-como1,4 ,5,6. Um exemplo desses conjuntos proteicos são as nanopartículas proteicas Automontantes (SAPNs)7. Os SAPNs são baseados em domínios bobinados e são tradicionalmente expressos em Escherichia coli8. Os candidatos à vacina SAPN foram desenvolvidos para diversas doenças como malária, SARS, influenza, toxoplasmose e HIV-19,10,11,12,13 , 14 anos de , 15 anos de , 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , o projeto 19. The de cada candidato de SAPN é específico ao micróbio patogénico do interesse, entretanto, a produção, a purificação, e as técnicas de redobramento são geralmente amplamente aplicáveis.
Um dos nossos interesses actuais é uma vacina eficaz para o VIH-1. Em RV144 — o único ensaio clínico de fase III de umavacina contra oVIH-1 que demonstrou eficácia modesta — o risco reduzido de infeção foi correlacionado com anticorpos IgG ao ciclo V1V2 da proteína envelope20,21. O nativo-como a apresentação trimérico desta região é pensado para ser importante para a imunogenicidade protetora22. Para apresentar o laço de V1V2 em tão perto ao nativo-como a conformação como possível, nós desenvolvemos uma prova do candidato da vacina do princípio SAPN que continha o pacote da seis-hélice da borne-fusão do envelope de HIV-1 (SHB) para apresentar o laço V1V2 na conformação correta9 . Este candidato foi reconhecido por anticorpos monoclonais conhecidos à proteína do envelope de HIV-1. Camundongos imunizados com V1V2-SHB-SAPN levantaram V1V2 anticorpos específicos, que, mais importante, vinculados a gp70 V1V2, os epítopos conformacionais corretos9. O núcleo de SHB-SAPN poderia ter outras funções além do papel como um portador para o laço de HIV-1 V1V2. Aqui nós descrevemos uma metodologia detalhada para a expressão, a purificação, o redobramento, e a validação do núcleo de SHB-SAPN. A seleção da seqüência, o projeto da nanopartícula, o clonagem molecular, e a transformação de e. coli foram descritos previamente9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

A auto-montagem de nanopartículas de proteína (SAPNs) função como exposições de antígeno repetitivo e pode ser usado para desenvolver uma ampla gama de vacinas para diferentes doenças infecciosas. Neste artigo nós demonstramos um método para produzir um núcleo de SAPN que contem um conjunto do feixe da seis-hélice (SHB) que seja capaz de apresentar antígenos em uma conformação trimérico. Nós descrevemos a expressão do SHB-SAPN em um sistema de E. coli , assim como as etapas necessárias da purificação da proteína. Nós incluímos uma etapa da lavagem do isopropanol para reduzir o lipopolysaccharide bacteriano residual. Como uma indicação da identidade e da pureza da proteína, a proteína reagiu com os anticorpos monoclonais conhecidos em análises ocidentais do borrão. Após o redobramento, o tamanho das partículas caiu na escala esperada (20 a 100 nanômetro), que foi confirmado pelo espalhamento de luz dinâmico, pela análise de seguimento da nanopartícula, e pela microscopia de elétron da transmissão. A metodologia descrita aqui é otimizada para o SHB-SAPN, porém, com apenas ligeiras modificações pode ser aplicada a outros constructos SAPN. Este método também é facilmente transferível para a produção em grande escala para a fabricação de GMP para vacinas humanas.

A SHB-SAPN totalmente montada mostrada aqui é construída sobre sequências proteicas (Figura 1a) que se prevê dobrar em uma partícula que contenha 60 exemplares do monómero (Figura 1b). A Figura 2 fornece um contorno do método para a produção, purificação e identificação do núcleo SHB-SAPN. E. coli de um estoque do glicerol que contivesse um vetor da expressão de PPEP-T com seqüência do gene do núcleo de SHB-SAPN foram induzidos em BL21 (de3) E. coli. As células bacterianas foram cultivadas e lisadas com sucesso condições de desnaturação e redução.
O lisado total da pilha foi usado para purificar monômeros de SHB-SAPN por FPLC usando uma coluna de Ni2 + (Figura 3a). O cromatografo de FPLC demonstra que a proteína eluída em 150 milímetros e no imidazol de 500 milímetros (Figura 3a). O cromatograma também mostra dois outros picos a 185 mL e 210 mL de volume total correspondente à lavagem de isopropanol e à lavagem livre de imidazol, respectivamente. As frações e a pureza da proteína recombinante foram identificadas por géis de SDS-PAGE gradiente (Figura 3B). A proteína de interesse foi principalmente localizada em frações 68 \ u201279 (278 \ u2012300 mL de volume total). Estas frações foram combinadas para análises complementares. O borrão ocidental com anticorpo anti-his (N-terminal) e o anticorpo 167-D-IV (C-Terminus) indicaram que as frações agrupadas eram certamente a proteína do interesse (figura 4a, B). Estes borrões também demonstraram a presença dos multimers SHB-SAPN. As frações anteriores de lavagem e de eluição tenderam a conter uma maior concentração de proteínas multimerizadas e, portanto, foram excluídas.
As amostras que continham os monómeros proteicos de interesse foram dobradas para o SHB-SAPN totalmente montado por diálise. A distribuição do tamanho das partículas foi determinada pelo DLS e pela análise de rastreamento de nanopartículas (Figura 5a, B). O DLS identificou partículas com um diâmetro hidrodinâmico da Z-média de 67 nm, enquanto o sistema NTA mediu um tamanho médio de 81 nm. As pequenas diferenças de tamanho foram devidas às técnicas de dimensionamento de partículas, porém o tamanho de ambas as análises estava na faixa esperada de 20 \ u2012100 nm8,24,25. Os SHB-SAPNs foram visualizados pelo Met e as imagens mostraram partículas individuais bem formadas com a distribuição de tamanho obtida a partir das duas técnicas de dimensionamento de partículas (Figura 5C).
Durante a purificação da proteína, a coluna foi lavada com isopropanol para diminuir a contaminação do LPS no produto final SHB-SAPN. Para verificar se o nível de endotoxina era aceitável para imunização, a concentração de LPS em amostras de SHB-SAPN purificadas com ou sem o passo de lavagem de isopropanol foi determinada por um ensaio cinético de LAL. Os resultados indicaram que a lavagem do isopropanol diminuiu os níveis de endotoxina de > 0,25 EU/μg para 0, 10 EU/μg de proteína SHB-SAPN (tabela 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> Figura 1: seqüência e estrutura da proteína SHB-SAPN. (A) a sequência de aminoácidos do monómero SHB-SAPN. (B) modelo informático da estrutura do núcleo inteiramente montado de SHB-SAPN que consiste em 60 monomers da proteína. Esquema de cores para sequências de aminoácidos: Grey = HisTag; Verde = pentamer; Azul escuro = de novo projetado trimer; Azul claro = feixe de seis-hélice. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> Figura 2: fluxograma da protocolo para a produção de SHB-SAPN. Esquema de cores: preto = expressão do monômero proteico em E. coli; Cinza escuro = purificação do monómero; Cinza médio = identificação do monómero; Cinza claro = redobramento e caracterização; Branco = totalmente montado SHB-SAPN produto. Em etapas rotuladas com cinza escuro e médio, a proteína está condições de desnaturação e redução. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> Figura 3: purificação proteica dos monômeros SHB-SAPN. (A) cromatógrafo da purificação do FPLC. A linha verde acima do cromatograma indica as etapas de purificação. A linha azul no cromatograma representa a densidade óptica das frações a 280 nm de comprimento de onda. A linha preta mostra o percentual de tampão B (8 M de ureia, 20 mM Tris, 50 mM de fosfato de sódio monobásico, 5 mM TCEP, 500 mM imidazol, pH 8,5) que foi utilizado em cada estágio da purificação. (B) géis de SDS-PAGE das frações agrupadas do lisado (L), fluxo através (ft), primeira lavagem (W1), lavagem do isopropanol (W2), terceira lavagem (w3), e frações individuais dos 150 milímetros imidazol (E150) e 500 milímetros imidazol (E500) etapas da eluição do Purificação. Marcadores moleculares na primeira pista (M) identificam bandas entre 10 e 250 kDa. A proteína alvo é indicada por uma seta preta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> Figura 4: identificação da proteína por Western Blot. Todas as pistas são carregadas com 100 ng de proteína. (A) resultados de um borrão ocidental com anti-6x histag. (B) resultados de um borrão ocidental com um anticorpo monoclonal 167-D-IV HIV-1. As pistas são rotuladas como: M = marcador de peso molecular; 1 = lisado; 2 = fluxo através; 3 = primeira lavagem; 4 = lavagem de isopropanol (segunda lavagem); 5 = terceira lavagem; 6 = frações de volume agrupadas 56 \ u201261 (primeiro pico de eluição), 7 = facções de volume agrupadas 62 \ u201267 (entre os dois picos), 8 = frações de volume agrupadas 68 \ u201278 (segundo pico de eluição). A proteína alvo com o tamanho de banda esperado de 18, 7 kDa como a banda monomérica SHB-SAPN é indicada por uma seta preta. Bandas extras nas faixas 7 e 8 são dímeros, trimers e multários do SHB-SAPN (seta vermelha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> Figura 5: caracterização do SHB-SAPN redobrado. (A). distribuição granulométrica conforme determinado pela DLS. (B) granulometria determinada pelo rastreamento de nanopartículas (sistema). (C) visualização das partículas de SHB-SAPN por tem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Amostra</td>
			<td>Endotoxina (EU/mL)</td>
			<td>Endotoxina (EU/μg de proteína)</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN com isopropanol Wash</td>
			<td>2, 2</td>
			<td>0, 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN sem isopropanol Wash</td>
			<td>> 50 anos</td>
			<td>> 0,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Controle negativo</td>
			<td>Abaixo do nível de detecção</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: níveis de endotoxina de SHB-SAPNs redobrado. Os níveis de endotoxina em amostras de SHB-SAPN purificados com ou sem lavagem de isopropanol apresentaram-se como unidades de endotoxina/mL e unidades de endotoxina/μg de proteína SHB-SAPN.

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Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Um método detalhado é fornecido aqui descrevendo a purificação, o redobramento, e a caracterização de nanopartículas de proteína Self-montagem (SAPNs) para o uso no desenvolvimento da vacina.

Produção de E. coli-expressa auto-montagem de nanopartículas de proteína para vacinas que requerem Trimeric epitope apresentação

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Nanopartículas de proteína auto-montada, ou SAPNs, podem ser usadas para desenvolver vacinas contra várias doenças infecciosas. Este método que descrevemos aqui pode ser usado para purificar, revatar e caracterizar SAPNs contendo um feixe de seis hélices. Esta nanopartícula pode apresentar antígenos triméricos em uma conformação nativa.Com pequenas modificações, este método pode ser aplicado a outros construtos inovadores de vacinas SAPN. Além disso, pode ser facilmente transferível para produção em larga escala para ensaios clínicos. Para a lise de E.coli colhida expressando o feixe de seis hélices SAPN, use uma sonda com a saída de sônica de 150 watts com quatro segundos de sônica e seis segundos de descanso, para sonicar pelotas bacterianas resuspended em 40 mililitros de tampão sem imidazol no gelo por cinco minutos.Centrifugar o lise celular para gerar um supernanato esclarecido e transferir o supernante para um frasco estéril de 150 mililitros. Em seguida, leve a amostra até um volume final de 100 mililitros com tampão fresco sem imidazol. Para isolar a proteína de interesse, abra o software FPLC e clique na opção Novo Método.No menu Configurações de método, abra o menu suspenso da posição da coluna e selecione C1 Port 3. No menu suspenso mostrado pela técnica, selecione Afinidade. No menu suspenso do tipo coluna, selecione Outros, HisTrap HP e cinco mililitros.O volume da coluna e as caixas de pressão serão automaticamente definidos para os valores apropriados. Clique em Delinear método e arraste os botões de aplicativo de equilíbrio e amostra, três botões de lavagem de coluna e o botão Elution do menu pop-up da Biblioteca de Fases ao lado da seta antes de fechar o menu da Biblioteca de Fases. Clique em Equilibração e defina os valores listados na tabela para Buffer Inicial B, Buffer Final B de 4%, 4% e Volume de Coluna, cinco.Clique no Aplicativo Amostrar. Na caixa de carregamento de amostras, clique no botão de rádio para injetar amostra na coluna com bomba de amostra e confirme que a caixa ao lado da Taxa de Fluxo de Uso das Configurações do Método é verificada na caixa de injeção de amostra com a caixa de bomba do sistema. Altere o valor da caixa de volume para 100 mililitros e o Esquema de Coleta de Frações para Habilitar.Despreste o tamanho da fração de uso da caixa Configurações do método e altere o Tamanho da Fração para quatro mililitros. Clique no primeiro botão 'Lavagem da coluna', defina os valores listados na tabela para Buffer Inicial B, Buffer B 4%, 4% e Volume de Coluna, 10. Clique na caixa De habilitar o esquema de coleta de frações e desciclar o tamanho da fração de uso das configurações do método.Altere o tamanho da fração para quatro mililitros e clique no segundo botão Lavagem da coluna. Defina os valores na tabela para Buffer Inicial B, Buffer Final B, 0% e Volume de Coluna, cinco. Clique na caixa De habilitar o esquema de coleta de frações e desciclar o tamanho da fração de uso das configurações do método.Altere o tamanho da fração para quatro mililitros e clique no terceiro botão Lavagem da coluna. Defina os valores na tabela para Buffer Inicial B, Buffer Final B, 0% e Volume da Coluna, 10. Clique no botão Capacitar o esquema de coleta de frações e desciclar o tamanho da fração de uso da caixa Configurações do método.Em seguida, mude o Tamanho da Fração para quatro mililitros. Clique no botão Elution e clique com o botão direito do mouse nas informações na tabela. No menu pop-up, clique em Excluir passo e arraste o botão gradiente isocratic para a mesa duas vezes, de modo que haja duas entradas.Defina o valor para a primeira entrada no Buffer Inicial B, Buffer Final B de 30%, 30% e Volume da Coluna, 10. Defina o valor para a segunda entrada para buffer inicial B, Buffer 100% Final B, 100% e Volume de Coluna, 10. Clique no botão Capacitar o esquema de coleta de frações e clique na caixa De tamanho de fração de uso da caixa Configurações do método.Em seguida, clique em Salvar Como e nomeie a purificação do arquivo. Coloque a bomba Uma tubulação do FPLC no tampão de lavagem sem imidazol e a tubulação B da bomba no tampão imidazol de 500 mililitros. Coloque a tubulação da bomba de amostra na amostra de 100 mililitros e execute o programa de purificação.Quando a lavagem isopropanol de 60%, pausar o programa, mover a bomba Uma tubulação da lavagem sem imidazol para a lavagem isopropanol de 60% e reiniciar o programa. No final da lavagem, pausa o programa novamente, devolva a bomba A tubo para o tampão de lavagem sem imidazol e reinicie o programa de purificação. Para avaliar a pureza da proteína purificada, primeiro combine as frações do fluxo através, lave uma, lave duas e lave três passos, em tubos cônicos individuais de 50 mililitros.Em seguida, misture 15 microlitadores de cada tubo de amostra com 15 microliters de tampão 2X Laemmli em tubos individuais de microcentrífato de 0,5 mililitros e desnaturar as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos. No final da incubação, configure um aparelho de corrida de gel com três géis de poliacrilamida pré-moldados sem manchas em buffer de execução Tris-Glycine SDS-PAGE. Carregue oito microliters de marcador de peso molecular para o primeiro poço de cada gel e 30 microliters de amostra desnaturada para os outros poços.Passe os géis a 200 volts até que a frente de corante atinja a parte inferior do gel e enxágue brevemente os géis com água desionizada antes de imediatamente fotografar com um sistema de imagem livre de manchas. Em seguida, identifique as frações que contêm faixas proteicas com o tamanho correto e acumule essas frações. Para o feixe de seis hélices SAPN repato, adicione 10 a 20 mililitros de proteína agrupada a um de diálise de 10 kilodalton de corte de peso molecular.Dique o em oito ureia molar, Tris 20 mililitros, 5%de glicerol e TCEP de cinco mililitros à temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, diminua a concentração de ureia no tampão de diálise passo em dois molares a cada duas horas para lentamente dilisar a ureia da amostra. Quando a concentração de ureia atingir dois molares, mova o aparelho de diálise para quatro graus Celsius e dilante a amostra em ureia de 120 milialares, tris de 20 milimilitos e 5% de glicerol durante a noite para terminar o reabascamento.Na manhã seguinte, remova a proteína redobrada do e filtre o feixe de seis hélices SAPN através de um filtro de seringa de fluoreto de polivinildene de 0,22 micrômetros. Para medir o tamanho médio da partícula do feixe sapn de seis hélices, adicione 45 microliters de pacote SAPN de seis hélices a um cuvette descartável e coloque o cuvette na máquina DLS. Em seguida, crie um novo arquivo de medição e execute um procedimento operacional padrão pré-escrito para proteína em ureia de 120 milimonas, Tris de 20 mililitros e tampão de 5% de glicerol a 25 graus Celsius.Então, inicie a medição. O tamanho médio Z, o PDI e os resultados de distribuição serão calculados para cada execução. A máquina lerá a amostra cinco vezes.Este pacote sapn de seis hélices totalmente montado é construído sobre sequências proteicas que são previstas para dobrar em uma partícula que contém 60 cópias do monômero. O total de lise celular foi usado para purificar os monômeros SAPN de seis hélices por FPLC usando uma coluna de níquel, demonstrando que a proteína eluicido em imidazol 150 e 500 milimolares. O cromatógrafo também mostra dois outros picos em 185 e 210 mililitros volume total correspondente à lavagem isopropanol e à lavagem sem imidazol, respectivamente.As frações e a pureza da proteína recombinante poderiam ser identificadas por géis SDS-PAGE gradientes com a proteína de interesse localizada principalmente na fração 68 a 79. A análise de manchas ocidentais com anticorpos anti-His e anti-167D4 indicou que as frações agrupadas eram de fato a proteína de interesse. As manchas também demonstraram a presença do pacote de seis hélices SAPN multimers.As amostras que continham os monômeros proteicos de interesse foram dobradas no pacote sapn de seis hélices totalmente montado por diálise e distribuição do tamanho das partículas foi determinada pela análise de rastreamento de DLS e nanopartículas. A visualização por microscopia eletrônica de transmissão revelou partículas SAPN de pacote individual de seis hélices bem formadas com a distribuição de tamanho obtida das duas técnicas de dimensionamento de partículas. O passo mais importante neste protocolo é a redobramento do pacote de seis hélices SAPN.O pH correto e a força iônica do tampão de re dobramento são essenciais. Usando uma lavagem isopropanol durante a purificação, conseguimos reduzir a contaminação do LPS a um nível muito baixo. No entanto, o LPS pode ser reduzido ainda mais usando uma coluna de troca de ânion, conforme necessário.Esta tecnologia pode ser facilmente adaptada para a aplicação humana. Um SAPN expresso em bactérias já foi ampliado para um próximo ensaio clínico de malária fase 1/2a.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Termodinâmica de enovelamento de proteínas de membrana Medido por espectroscopia de fluorescência

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Bioengenharia

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Análise de Proteína Viral alvejado Nanopartículas entregue para tumores HER2 +

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanopartículas Regenerativa Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Protocolo genérico para otimização da produção de proteína heteróloga usando tecnologia automatizada de Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Functionalization superfície de nanopartículas de vírus de hepatite E usando métodos de conjugação química

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Produção de elastina, como proteína hidrogel para encapsulamento e imunocoloração de células em 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...