Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Эта работа была поддержана соглашением о сотрудничестве (W81XWH-11-2-0174) между Фондом Генри М Джексона по развитию военной медицины, Inc., и Министерством обороны США. Анти-ВИЧ-1 gp41 mAb 167-D IV антитела были получены от д-р Сьюзен Золла-Пазнер через NIH СПИД реагент программы.

<ol>
	<li>Karch, C. P., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+technologies:+From+whole+organisms+to+rationally+designed+protein+assemblies.">Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies.</a> Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).</li><li>Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Immunologic+Properties+of+Soluble+Versus+Particulate+Antigens.">Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens.</a> Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).</li><li>Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+basis+for+enhanced+immunity+of+nanoparticle+vaccines.">Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).</li><li>Yeates, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Principles+for+Designing+Highly+Symmetric+Self-Assembling+Protein+Nanomaterials.">Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).</li><li>Marcandalli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Potent+Neutralizing+Antibody+Responses+by+a+Designed+Protein+Nanoparticle+Vaccine+for+Respiratory+Syncytial+Virus.">Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus.</a> Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decorating+Self-Assembled+Peptide+Cages+with+Proteins.">Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins.</a> ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).</li><li>Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembling+Protein+Nanoparticles:+implications+for+HIV-1+vaccine+development.">Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development.</a> Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).</li><li>Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+design+of+peptides+that+self-assemble+into+regular+polyhedral+nanoparticles).">Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles).</a> Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+displaying+HIV-1+Env+V1V2+loop+in+a+native-like+trimeric+conformation+as+vaccine+antigen.">Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen.</a> Nanomedicine. , (2018).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+P.+falciparum+specific+coiled-coil+domain+to+construct+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+to+prevent+malaria.">The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-adjuvanted+nanoparticle+based+vaccine+against+infectious+bronchitis+virus.">A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus.</a> PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).</li><li>Wahome, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+display+of+4E10+and+2F5+epitopes+on+self-assembling+protein+nanoparticles+as+a+potential+HIV+vaccine.">Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+novel+immunogenic+nanoparticle+platform+for+Toxoplasma+peptide+vaccine+in+HLA+transgenic+mice.">Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice.</a> Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonadjuvanted+polypeptide+nanoparticle+vaccine+confers+long-lasting+protection+against+rodent+malaria.">A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria.</a> Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibody+and+CD8++T-cell+responses+to+the+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+protein+induced+by+a+nanoparticle+vaccine.">Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine.</a> PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).</li><li>Seth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+targeting+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+delivered+in+three+Army+Liposome+Formulation+adjuvants.">Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants.</a> Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+nanoparticles+with+built-in+flagellin+domains+increases+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+falciparum+based+vaccine.">Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine.</a> Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanovaccine+confers+robust+immunity+against+Toxoplasma.">Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma.</a> NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+self-adjuvanted+protein+nanoparticles+provides+protection+against+lethal+influenza+challenge.">Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge.</a> Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).</li><li>Haynes, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-correlates+analysis+of+an+HIV-1+vaccine+efficacy+trial.">Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial.</a> New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).</li><li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand.">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).</li><li>O&#39; Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+gp120+V1V2+loop:+structure,+function+and+importance+for+vaccine+development.">The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development.</a> Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).</li><li>Babapoor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Vaccine+Using+Nanoparticle+Platform+to+Present+Immunogenic+M2e+against+Avian+Influenza+Infection.">A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection.</a> Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).</li><li>Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+self-assembling+protein+nanoparticle+architectures+for+applications+in+vaccine+design.">Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design.</a> Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).</li><li>Indelicato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+Governing+the+Self-Assembly+of+Coiled-Coil+Protein+Nanoparticles.">Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles.</a> Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).</li><li>Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+assemblies+and+their+biomedical+applications.">Nanoscale assemblies and their biomedical applications.</a> Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).</li><li>Rey, F. A., Lok, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Features+of+Enveloped+Viruses+and+Implications+for+Immunogen+Design+for+Next-Generation+Vaccines.">Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines.</a> Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Endotoxins.">Bacterial Endotoxins.</a> United States Pharmacopeia (USP). , (2011).</li><li>. Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/media/76255/download">https://www.fda.gov/media/76255/download</a> (1993)</li></ol>

Высказанные мнения являются мнениями авторов и не должны быть истолкованы как представляющие позиции армии США или Министерства обороны. Питер Буркхард имеет интерес к компании под названием Alpha-O Peptides AG и имеет патенты на технологию. Другие авторы не имеют никакого отношения или финансового участия в какой-либо компании с финансовыми интересами по этому вопросу, представленному в настоящем документе.

Нанотехнология предоставляет множество преимуществ и решений для разработки субунитовой вакцины. Nanovaccines может повторно представить антигены в качестве частиц для иммунной системы хозяина повышения иммуногенности26. Хотя Есть много различных типов нановакцин, мы считаем, что те, состоящий из de novo разработан белка, как представляется, самый сильный подход для разработки вакцины1. Они могут быть разработаны без какой-либо последовательности гомологии для принимающих белков и представить антиген интереса в близко к родной, как конформация, обеспечивая при этом низкую себестоимость производства и высокие урожаи продукции. Ярким примером такого подхода является технология SAPN, которую мыприменили к вакцинам против множественных инфекционных заболеваний 7. Решая трудности в разработке вакцины против ВИЧ-1, мы разработали уникальное ядро SHB-SAPN, чтобы эффективнопредставить антиген V1V2 в местной тримерной конформации 9. Многие цели вакцины, особенно для вирусных заболеваний, присутствуют в качестве тримеров27. Это явление указывает на то, что наша конструкция SAPN имеет широкие последствия для разработки субединых вакцин.
В этом методе мы демонстрируем, как производить SHB-SAPNs в системе экспрессии кишечной палочки. Мы выразили высокие урожаи белка (около 6 мг/100 мл культуры). Белок содержал 10 гистидинов и легко очищался с помощью обездвиженного металлического сродства хроматографии с колонкой Ni2.com. Эта длина Его-Тега была признана оптимальной для самого высокого уровня урожайности белка. Очищенный белок содержал полную длину разработанного белка, о чем свидетельствует наличие как N-терминала HisTag, так и повторения гептада терминала С. Мы использовали общепринятые методы и оптимизировали их для выражения, производства и характеристики ядра SHB-SAPN. Отсутствие производства полноразмерного белка во время разработки SAPN, содержащего новый белковый эпитоп, может указывать на проблему экспрессии гена в клетке-хозяине. Если это произойдет, ген и система экспрессии должны быть переработаны и адаптированы к описанному протоколу. Изменение времени или интенсивности звукового времени может также увеличить концентрацию прогнозируемого полноформатного белка.
Сложенные частицы находились в ожидаемом диапазоне размеров (от 20 до 100 нм)8,24,25, как это определено анализом DLS и наночастиц. Эти результаты были дополнительно подтверждены с помощью TEM. Если есть проблемы в этом шаге, это, как правило, из-за проблемы с рН или иной силы складирования буфера. Когда крупные частицы размера обнаруживаются на методах размеров частиц, это указывает на агрегацию, которой можно избежать, увеличивая рН сворачивающего буфера. Если частицы не обнаружены DLS, проверьте концентрацию белка и проверьте рН буфера. Окончательная концентрация белка для DLS должна быть не менее 100 мкг/мл. Если концентрация не является проблемой, это указывает на обилие мелких, неполно сформированных частиц, концентрация которых может быть уменьшена за счет уменьшения рН. Кроме того, концентрация хлорида натрия может быть скорректирована с оптимальным диапазоном, чтобы свести к минимуму наличие частиц с нежелательным размером.
Наконец, с помощью изопропанола мыть шаг во время очистки мы смогли уменьшить загрязняющих LPS от хозяина кишечной палочки до 0,01 ЕС / мкг SAPN, который ниже пищевых продуктов и медикаментов (FDA) предел 5 ЕС / кг массы тела для инъекционных продуктов 28. Этот уровень можно еще больше снизить с помощью столбца обмена анионами, также известного как колонка q. Если высокие уровни эндотоксина все еще присутствуют, проверьте все материалы, которые были использованы для подготовки буфера. Не забудьте использовать только depyrogenated стеклянной посуды и эндотоксина бесплатно пластмассовые изделия в этом методе.
Эти результаты свидетельствуют о том, что мы успешно разработали метод производства ядра SHB-SAPN, который может быть использован для доклинических исследований иммунизации. Этот метод с небольшими изменениями, если таковые имеются, может быть применен к очищению SHB-SAPNs, когда антиген интереса добавляется. Использование этого метода в качестве отправной точки одним из основных изменений находится в шаге elution. Различные белки elute на различных концентрациях imidazole которые необходимо определить экспериментально. Другим важным отличием может быть состав буфера складывания. Оптимизация потребует тестирования различных условий рН, а также ионных сильных сторон.
При рассмотрении будущей работы, только два небольших изменения необходимы, чтобы позволить человеческому применению SHB-SAPN. Во-первых, вектор выражения должен быть изменен на канамицин сопротивление выбираемый маркер из-за аллергии ампициллин у людей29. Другим важным требованием производства белка для использования человеком является производство SHB-SAPN в носителях, свободных от продуктов животного происхождения. Небольшое исследование уже показало разумную урожайность белка в растительных носителях. Работа, представленная здесь легко масштабируемых для конечной производства GMP, как показано с кандидатом вакцины против малярии, FMP01416. Это крупномасштабное производство FMP014-SAPN включало как обмен анионов, так и шаги по обмену катионами для дальнейшего сокращения содержания LPS и Ni2'из конечного продукта. Это бактериальной выраженных SAPN уже масштабируется для предстоящего фаза 1/2a клинических испытаний.

В то время как традиционная разработка вакцин была сосредоточена на инактивированных или ослабленных патогенных микроорганизмов, фокус современных вакцин сместился в сторону субединых вакцин1. Такой подход может привести к более целенаправленным ответным мерам и потенциально более эффективным кандидатам на вакцину. Однако одним из основных недостатков является то, что субединые вакцины не являются твердыми частицами, как целые организмы, что может привести к снижению иммуногенности2. Наночастицы в качестве повторяющейся системы дисплея антигена могут иметь преимущества как целевого подхода к вакцине субунита, так и твердых частиц всего организма1,3.
Среди существующих типов нановакцин, рационально разработанные сборки белка позволяют для разработки и разработки вакцины кандидатов, которые могут представить несколько копий антигена потенциально в родной, как конформация1,4 ,5,6. Одним из примеров этих белковых сборок являются самосборка белковыхнаночастиц (SAPN) 7. SAPNs основаны на доменах сутышкой катушки и традиционно выражены в Escherichia coli8. SAPN вакцины кандидатов были разработаны для различных заболеваний, таких как малярия, ОРВИ, грипп, токсоплазмоз, и ВИЧ-19,10,11,12,13 , 14 Год , 15 лет , 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19. Конструкция каждого кандидата SAPN специфична для патогена, представляющих интерес, однако, производство, очистка и сворачивание методы, как правило, широко применимы.
Одной из наших текущих интересов является эффективная вакцина против ВИЧ-1. В RV144-единственном этапе III клинических испытаний вакцины против ВИЧ-1, которые продемонстрировали скромную эффективность-снижение риска инфекции коррелировалось с igG антитела к V1V2 петли белка конверт20,21. Родной, как тримерпрезентация этого региона считается важным для защитной иммуногенности22. Чтобы представить v1V2 цикл как можно ближе к родной, как конформация, как это возможно, мы разработали доказательство принципа SAPN вакцины кандидата, который содержал ВИЧ-1 конверт после слияния шести-сугнительная расслоение (SHB), чтобы представить V1V2 петли в правильной конформации9 . Этот кандидат был признан известными моноклональными антителами к белку конверта ВИЧ-1. Мыши, иммунизированные V1V2-SHB-SAPN, подняли V1V2 специфические антитела, которые, самое главное, привязанык gp70 V1V2, правильным конформационным эпитопам 9. Ядро SHB-SAPN может иметь другие функции, выходящие за рамки роли носителя цикла ВИЧ-1 V1V2. Здесь мы описываем подробную методологию выражения, очищения, складывания и проверки ядра SHB-SAPN. Выбор последовательности, дизайн наночастиц, молекулярное клонирование и трансформация кишечной палочки были ранее описаны9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

Самосборка белковых наночастиц (SAPN) функционирует как повторяющиеся антигенные дисплеи и может быть использована для разработки широкого спектра вакцин против различных инфекционных заболеваний. В этой статье мы демонстрируем метод получения ядра SAPN, содержащего сборку шестисугликсового пучка (SHB), способного представлять антигены в тримерной конформации. Мы описываем выражение SHB-SAPN в системе кишечной палочки, а также необходимые шаги очистки белка. Мы включили шаг мытья изопропанола для уменьшения остаточного бактериального липополисахарида. Как индикация тождественности протеина и чистоты, протеин промединировал с известными моноклональными антителами в западных анализах побелки. После повторного сворачивания размер частиц снизился в ожидаемом диапазоне (от 20 до 100 нм), что было подтверждено динамическим рассеянием света, анализом отслеживания наночастиц и электронной микроскопией передачи. Описанная здесь методология оптимизирована для SHB-SAPN, однако, с небольшими изменениями она может быть применена к другим конструкциям SAPN. Этот метод также легко переносимый для крупномасштабного производства для производства GMP для вакцин для человека.

Полностью собранный SHB-SAPN, показанный здесь, построен на белковых последовательностях(рисунок 1A),которые, по прогнозам, сложить в частицу, которая содержит 60 копий мономера (рисунок1B). Рисунок 2 содержит наброски метода производства, очистки и идентификации ядра SHB-SAPN. E. coli из глицерола, который содержал вектор экспрессии pPep-T с генной последовательностью ядра SHB-SAPN, был индуцирован в BL21 (DE3) E. coli. Бактериальные клетки успешно выращивались и лисицировались под денатурированием и уменьшением условий.
Общий клеточный лисат был использован для очистки мономеров SHB-SAPN fPLC с помощью колонки Ni2 (рисунок 3A). Хроматограф FPLC показывает, что белок eluted как на 150 мМ и 500 мМ имидазол(рисунок 3A). Хроматограмма также показывает два других пика на 185 мл и 210 мл общий объем, соответствующий изопропанол мыть и имидазол амантиазол атакжем, соответственно. Фракции и чистота рекомбинантного белка были определены градиентными гелями SDS-PAGE(рисунок 3B). Белок, представляющий интерес, был в основном расположен в фракциях 68-u201279 (общий объем 278-2012300 мл). Эти фракции были объединены для дальнейшего анализа. Западная подательная яма с анти-Его антитела (N-терминал) и 167-D-IV антитела (C-терминус) показали, что объединенные фракции были действительно белок интереса(Рисунок 4A,B). Эти помарки также продемонстрировали наличие мультимер SHB-SAPN. Более предыдущие фракции смыва и elution клонили содержать более высокую концентрацию multimerized протеина и поэтому были исключены.
Образцы, содержащие интересующие белок мономеры, были сложены в полностью собранный SHB-SAPN путем диализа. Распределение размеров частиц было определено анализом DLS и наночастиц(рисунок 5A,B). DLS идентифицировала частицы с гидродинамическим диаметром 67 нм, в то время как система NTA измеряла средний размер 81 нм. Небольшие различия в размерах были обусловлены методами размеров частиц, однако размер обоих анализов находился вожидаемом диапазоне 20-х 2012100 нм 8,24,25. SHB-SAPNs были визуализированы TEM и изображения показали хорошо сформированные отдельные частицы с распределением размера, полученных от двух методов размеров частиц(рисунок 5C).
Во время очистки белка, колонка была промыта изопропанол, чтобы уменьшить загрязнение LPS в конечном SHB-SAPN продукта. Чтобы проверить, приемлем ли уровень эндотоксина для иммунизации, концентрация ЛПС в пробах SHB-SAPN, очищенных с помощью или без шага по мытью изопропанола, была определена кинетической проверкой LAL. Результаты показали, что изопропанол мыть снизили уровни эндотоксина от 0,25 EU/мкг до 0,010 EU/мкг белка SHB-SAPN (Таблица 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> Рисунок 1: последовательность и структура белка SHB-SAPN. (A) Аминокислотная последовательность мономера SHB-SAPN. (B) Компьютерная модель структуры полностью собранного ядра SHB-SAPN, состоящая из 60 белковых мономеров. Цветовая схема для аминокислотных последовательностей: Серый и HisTag; Зеленый и пентамлер; Темно-синий - де Ново разработанный триммер; Светло-голубой и шестиселиток пучок. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> Рисунок 2: Flowchart протокол для производства SHB-SAPN. Цветовая схема: Черный - выражение белкового мономера в кишечной палочке; Темно-серое очищение мономеров; Среднесеровская идентификация мономеров; Светло-серый - переукрапывание и характеристика; Белый и полностью собранный продукт SHB-SAPN. В шагах, помеченных темным и средним серым цветом, белок находится под денатурированием и уменьшением условий. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> Рисунок 3: Очистка белка мономеров SHB-SAPN. (A) Хроматограф из очистки FPLC. Зеленая линия над хроматограммой указывает на шаги очищения. Голубая линия в хроматограмме представляет оптическую плотность фракций на длине волны 280 нм. Черная линия показывает, какой процент буфера B (8 M мочевины, 20 мм Трис, 50 мМ фосфат натрия монобасный, 5 мМ TCEP, 500 мМ Имидазол, рН 8.5), который был использован в каждом этапе очистки. (B) SDS-PAGE гели объединенных фракций из lysate (L), протекать через (FT), первая стирка (W1), изопропанол мыть (W2), третья стирка (W3), и отдельные фракции из 150 мМ имидазол (E150) и 500 мм имидазола (E500) elution шаги elution из 150 мМ имидазола (E150) и 500 мм имидазола (E500) elution Очистки. Молекулярные маркеры в первой полосе (M) идентифицируют полосы между 10 и 250 kDa. Целевой белок указывается черной стрелкой. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> Рисунок 4: Идентификация белка по западному побочке. Все полосы загружаются с 100 нг белка. (A) Результаты западного пятно с анти-6x HisTag. (B) Результаты западного пятно с 167-D-IV ВИЧ-1 моноклональных антител. Полосы помечены как: M и молекулярный маркер веса; 1 - лизат; 2 - Поток через; 3 - первая стирка; 4 - изопропанол мыть (вторая стирка); 5 - третья стирка; 6 - объединенные фракции объема 56'u201261 (первый пик elution), 7 фракций объема 62'u201267 (между двумя пиками), 8 - объединенные фракции объема 68'u201278 (второй пик elution). Целевой белок с ожидаемым размером полосы 18,07 кДа, как мономерная полоса SHB-SAPN указывается черной стрелкой. Дополнительные полосы в полосах 7 и 8 являются димеры, тримеры, и мультимеры SHB-SAPN (красная стрелка). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> Рисунок 5: Характеристика повторно сложенного SHB-SAPN. (A). Распределение размера частиц, как это определено DLS. (B) Размер частиц, определяемый отслеживанием наночастиц (система). (C) Визуализация частиц SHB-SAPN tEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Образец</td>
			<td>Эндотоксин (ЕС/мл)</td>
			<td>Эндотоксин (ЕС/мкг белка)</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN с Изопропанол умывкой</td>
			<td>2.02</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN без Исопропанола Уош</td>
			<td>(gt;50);</td>
			<td>0,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Отрицательный контроль</td>
			<td>Ниже уровня обнаружения</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Уровни эндотоксинов повторно сложенных SHB-SAPNs. Уровни эндотоксинов в пробах SHB-SAPN, очищенных с помощью или без изопропанола, представлены как эндотоксинные единицы/мл, так и эндотоксинные единицы/мг белка SHB-SAPN.

Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Здесь приводится подробный метод, описывающий очистку, сворачивание и характеристику самосборки белковых наночастиц (SAPN) для использования в разработке вакцины.

Производство E.coli-выраженные самосборки белковых наночастиц для вакцин, требующих тримерной эпитопной презентации

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Самосборка белковых наночастиц, или SAPNs, может быть использована для разработки вакцин против различных инфекционных заболеваний. Этот метод, который мы описываем здесь, может быть использован для очистки, повторного использования и характеристики SAPNs, содержащих шести-спиральный пучок. Эта наночастица может представлять тримерные антигены в родной конформации.При небольших изменениях этот метод может быть применен к другим инновационным конструкциям вакцины SAPN. Кроме того, он может быть легко переносим на крупномасштабное производство для клинических испытаний. Для лиза собранного E.coli, выражаюго шести-спиральный пучок SAPN, используйте зонд с выходом звуковой связи 150 Вт с четырьмя секундами звуковой связи и шестью секундами отдыха, чтобы соникатировать перерасход бактериальных гранул в 40 миллилитров буфера без имидазола на льду в течение пяти минут.Центрифуга клеточного лизата для создания очищенного супернатанта и переноса супернатанта в стерильную 150-миллилитровую колбу. Затем довнесите образец до конечного объема в 100 миллилитров со свежим буфером без имидазола. Чтобы изолировать белок интереса, откройте программное обеспечение FPLC и нажмите на опцию New Method.В меню «Настройки метода» откройте меню высадки столбца и выберите порт C1 3. В меню высадки по технике выберите Affinity. В меню высадки типов столбцев выберите Другие, HisTrap HP и пять миллилитров.Объем столбца и коробки давления будут автоматически установлены к соответствующим значениям. Нажмите Нарисуйте описание метода и перетащите кнопки Equilibration и Sample Application, три кнопки Column Wash и кнопку Elution из всплывающего меню Phase Library рядом со стрелкой перед закрытием меню Phase Library. Нажмите Equilibration и установите значения, перечисленные в таблице для первоначального буфера B, 4%Final Buffer B, 4%и Объем столбца, пять.Нажмите Пример приложения. В коробке загрузки образца нажмите кнопку радиоприемка для инъекционного образца на колонке с помощью образца насоса и подтвердите, что коробка рядом с скоростью потока использования из настроек метода проверяется в коробке образца с системной насосной коробкой. Измените значение коробки Volume до 100 миллилитров и схему сбора фракций для включения.Отликуй размер фракции использования из коробки настроек метода и измените размер фракции на четыре миллилитра. Нажмите на первую кнопку Column Wash, установите значения, перечисленные в таблице, на initial Buffer B, 4%Final Buffer B, 4%и Column Volume, 10. Нажмите на схему сбора фракций Включите поле и отмять размер фракции использования из настроек метода.Измените размер фракции на четыре миллилитров и нажмите на вторую кнопку Column Wash. Установите значения в таблице для первоначального буфера B, 0%Final Buffer B, 0%и Объем столбца, пять. Нажмите на схему сбора фракций Включите поле и отмять размер фракции использования из настроек метода.Измените размер фракции на четыре миллилитров и нажмите на третью кнопку Column Wash. Установите значения в таблице для первоначального буфера B, 0%Final Buffer B, 0%и Объем столбца, 10. Нажмите кнопку Схема сбора фракций Включить и отмять размер фракции использования из коробки настроек метода.Затем измените размер фракции на четыре миллилитров. Нажмите кнопку Elution и нажмите правой кнопкой мыши на информацию в таблице. В всплывающем меню щелкните Удалите шаг и перетащите кнопку градиента isocratic на стол два раза, так что есть две записи.Установите значение для первой записи в Initial Buffer B, 30%Final Buffer B, 30%и Объем колонны, 10. Установите значение для второй записи в Initial Buffer B, 100%Final Buffer B, 100%и Объем колонны, 10. Нажмите кнопку «Схема сбора фракций» и нажмите кнопку «Размер фракции использования» из коробки настроек метода.Затем щелкните Save As и назовите очистку файла. Поместите насос трубки FPLC в буфер мытья без имидазола, и насос B трубки в 500-миллимоляйный буфер имидазола. Поместите образец насоса трубки в 100-миллилитровый образец и запустить программу очистки.Когда 60%isopropanol мыть необходимо, приостановить программу, переместить насос трубки из имидазола свободной мыть в 60%isopropanol мыть, и перезапустить программу. В конце стирки, приостановить программу еще раз, вернуть насос трубки имидазола свободной мыть буфера, и перезапустить программу очистки. Чтобы оценить чистоту очищенного белка, сначала объединить фракции из потока через, мыть один, мыть два, и мыть три шага, в отдельных 50-миллилитровых конических труб.Затем смешайте 15 микролитров из каждой пробной трубки с 15 микролитров буфера 2X Laemmli в отдельных 0,5-миллилитровых микроцентрифуговых трубках и денатурировать образцы при 95 градусах Цельсия в течение 10 минут. В конце инкубации, создать гель работает аппарат с тремя пятно-бесплатно четыре до 20%precast полиакриламинид гели в Tris-Глицин SDS-PAGE работает буфер. Загрузите восемь микролитров молекулярного маркера веса к первой скважине каждого геля и 30 микролитров денатурированного образца к другим скважинам.Запустите гели на 200 вольт, пока краситель фронт хитов нижней части геля и кратко промыть гели с деионизированной водой, прежде чем сразу же изображения с пятном свободной системы изображений. Затем определите фракции, содержащие белковые полосы с правильным размером, и объединить эти фракции. Для шести-спиральный пучок SAPN повторного сфасинга, добавить от 10 до 20 миллилитров слитка белка в 10 килодальтон молекулярного веса отрезаны диализа кассеты.Диализуйте кассету в восьми молярных мочевинах, 20-миллимолярной трисе, 5%глицероле и пятимимолярной TCEP при комнатной температуре за одну ночь. На следующее утро, уменьшить концентрацию мочевины в буфере диализа stepwise на два моляра каждые два часа, чтобы медленно диализуют мочевину от образца. Когда концентрация мочевины достигнет двух моляров, перемести диализный аппарат до четырех градусов по Цельсию и облизав образец на 120-миллимолярдную мочевину, 20-миллимолярдные три и 5%глицерол на ночь, чтобы закончить развал.На следующее утро снимите с кассеты слитый белок и отфильтруйте шестислойный пучок SAPN через 0,22-микрометровый фильтр фторида поливинилидена. Чтобы измерить средний размер частиц шестиполетного пучка SAPN, добавьте 45 микролитров шестиполетного пучка SAPN в одноразовый кювет и поместите кюветт в машину DLS. Затем создайте новый файл измерения и запустите заранее написанную стандартную операционную процедуру для белка в 120-миллимоляре мочевины, 20-миллимолярдных три и 5%глицерол буфера при 25 градусах по Цельсию.Затем начните измерение. Для каждого запуска будет рассчитан средний размер, PDI и результаты распределения. Машина будет читать образец пять раз.Этот полностью собранный шестислойный пучок SAPN построен на белковых последовательностях, которые, по прогнозам, складываются в частицу, которая содержит 60 копий мономера. Общий лизат клеток был использован для очистки шести-спирали расслоение SAPN мономеров FPLC с помощью колонки никеля, демонстрируя, что белок eluted на обоих 150 и 500-миллимолярновый имидазол. Хроматограмма также показывает два других пика на 185 и 210 миллилитров общего объема, соответствующего изопропанол мыть и имидазол-бесплатно мыть соответственно.Фракции и чистота рекомбинантного белка могут быть определены градиентом SDS-PAGE гелей с белком интереса в основном расположены в фракции 68 до 79. Западный анализ помарки с антителами anti-His и anti-167D4 показал что соединенные фракции были деиствительно протеином интереса. Помарки также продемонстрировали наличие шести-спирали расслоение SAPN мультимеров.Образцы, содержащие представляющие интерес, были сложены в полностью собранный шестислойный пучок SAPN путем диализа, а распределение размера частиц определялось анализом DLS и наночастиц. Визуализация с помощью электронной микроскопии передачи выявила хорошо сформироваваемые отдельные шестиу спирали пучка частиц SAPN с распределением размера, полученного из двух методов размера частиц. Наиболее важным шагом в этом протоколе является повторное сфасинг шести-спирали расслоение SAPN.Правильный рН и ионическая прочность буфера рефолсирования имеют важное значение. Используя изопропанол мыть во время очистки, мы смогли уменьшить загрязняющих LPS до очень низкого уровня. Тем не менее, LPS может быть уменьшена с помощью столбца обмена аниона по мере необходимости.Эта технология может быть легко адаптирована для применения человеком. Бактериальная выраженная SAPN уже была расширена для предстоящей фазы 1/2a клинических испытаний малярии.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Термодинамика Мембранные белки Складные Измеряется флуоресцентной спектроскопии

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Формулировка диблок Полимерные наночастицы через Nanoprecipitation Техника

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Культивирование прав нервные клетки-предшественники в 3-мерном самоорганизации пептидов Гидрогель

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Анализ целевой вирусного белка Наночастицы доставляется в HER2 + опухолей

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

ПМГК Наночастицы, образованные одним или двумя-эмульсии с витамином E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Гармоник Наночастицы регенеративной исследований

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Получение металлических наночастиц импульсной лазерной абляцией в жидкостях: инструмент для изучения антибактериальных свойств наночастиц

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Общий протокол для оптимизации производства гетерологичных белка с использованием автоматизированной технологии Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Поверхности функционализации наночастиц вирус гепатита Е, используя методы химической спряжение

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Производство белка эластина как гидрогели для инкапсуляции и иммуноокрашивания клеток в 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...