Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por un acuerdo de cooperación (W81XWH-11-2-0174) entre la Fundación Henry M Jackson para el Avance de la Medicina Militar, Inc., y el Departamento de Defensa de los Estados Unidos. El anticuerpo anti-VIH-1 gp41 mAb 167-D IV fue recibido de la Dra. Susan Zolla-Pazner a través del Programa de Reactivos de SIDA de NIH.

<ol>
	<li>Karch, C. P., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+technologies:+From+whole+organisms+to+rationally+designed+protein+assemblies.">Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies.</a> Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).</li><li>Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Immunologic+Properties+of+Soluble+Versus+Particulate+Antigens.">Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens.</a> Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).</li><li>Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+basis+for+enhanced+immunity+of+nanoparticle+vaccines.">Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).</li><li>Yeates, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Principles+for+Designing+Highly+Symmetric+Self-Assembling+Protein+Nanomaterials.">Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).</li><li>Marcandalli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Potent+Neutralizing+Antibody+Responses+by+a+Designed+Protein+Nanoparticle+Vaccine+for+Respiratory+Syncytial+Virus.">Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus.</a> Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decorating+Self-Assembled+Peptide+Cages+with+Proteins.">Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins.</a> ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).</li><li>Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembling+Protein+Nanoparticles:+implications+for+HIV-1+vaccine+development.">Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development.</a> Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).</li><li>Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+design+of+peptides+that+self-assemble+into+regular+polyhedral+nanoparticles).">Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles).</a> Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+displaying+HIV-1+Env+V1V2+loop+in+a+native-like+trimeric+conformation+as+vaccine+antigen.">Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen.</a> Nanomedicine. , (2018).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+P.+falciparum+specific+coiled-coil+domain+to+construct+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+to+prevent+malaria.">The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-adjuvanted+nanoparticle+based+vaccine+against+infectious+bronchitis+virus.">A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus.</a> PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).</li><li>Wahome, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+display+of+4E10+and+2F5+epitopes+on+self-assembling+protein+nanoparticles+as+a+potential+HIV+vaccine.">Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+novel+immunogenic+nanoparticle+platform+for+Toxoplasma+peptide+vaccine+in+HLA+transgenic+mice.">Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice.</a> Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonadjuvanted+polypeptide+nanoparticle+vaccine+confers+long-lasting+protection+against+rodent+malaria.">A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria.</a> Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibody+and+CD8++T-cell+responses+to+the+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+protein+induced+by+a+nanoparticle+vaccine.">Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine.</a> PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).</li><li>Seth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+targeting+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+delivered+in+three+Army+Liposome+Formulation+adjuvants.">Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants.</a> Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+nanoparticles+with+built-in+flagellin+domains+increases+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+falciparum+based+vaccine.">Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine.</a> Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanovaccine+confers+robust+immunity+against+Toxoplasma.">Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma.</a> NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+self-adjuvanted+protein+nanoparticles+provides+protection+against+lethal+influenza+challenge.">Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge.</a> Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).</li><li>Haynes, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-correlates+analysis+of+an+HIV-1+vaccine+efficacy+trial.">Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial.</a> New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).</li><li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand.">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).</li><li>O&#39; Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+gp120+V1V2+loop:+structure,+function+and+importance+for+vaccine+development.">The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development.</a> Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).</li><li>Babapoor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Vaccine+Using+Nanoparticle+Platform+to+Present+Immunogenic+M2e+against+Avian+Influenza+Infection.">A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection.</a> Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).</li><li>Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+self-assembling+protein+nanoparticle+architectures+for+applications+in+vaccine+design.">Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design.</a> Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).</li><li>Indelicato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+Governing+the+Self-Assembly+of+Coiled-Coil+Protein+Nanoparticles.">Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles.</a> Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).</li><li>Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+assemblies+and+their+biomedical+applications.">Nanoscale assemblies and their biomedical applications.</a> Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).</li><li>Rey, F. A., Lok, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Features+of+Enveloped+Viruses+and+Implications+for+Immunogen+Design+for+Next-Generation+Vaccines.">Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines.</a> Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Endotoxins.">Bacterial Endotoxins.</a> United States Pharmacopeia (USP). , (2011).</li><li>. Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/media/76255/download">https://www.fda.gov/media/76255/download</a> (1993)</li></ol>

Las opiniones expresadas son las de los autores y no deben interpretarse como las posiciones del Ejército de los Estados Unidos o del Departamento de Defensa. Peter Burkhard tiene un interés en la empresa llamada Alpha-O Peptides AG y tiene patentes sobre la tecnología. Los demás autores no tienen afiliación o participación financiera con ninguna empresa con un interés financiero en el tema presentado en este documento.

La nanotecnología proporciona muchas ventajas y soluciones para el desarrollo de vacunas subunidades. Las nanovacunas pueden presentar antígenos repetidamente como partículas al sistema inmunitario huésped aumentando la inmunogenicidad26. Si bien hay muchos tipos diferentes de nanovacunas, creemos que las compuestas por proteína según novo parecen ser el enfoque más fuerte para el desarrollo de vacunas1. Pueden ser diseñados sin ninguna homología de secuencia a las proteínas anfitrionas y presentar el antígeno de interés en una conformación similar a la nativa, al tiempo que proporcionan un bajo costo de producción y altos rendimientos del producto. Un ejemplo de este enfoque es la tecnología SAPN, que hemos aplicado a las vacunas contra múltiples enfermedades infecciosas7. Abordando las dificultades en el desarrollo de la vacuna VIH-1, hemos diseñado un núcleo único SHB-SAPN para presentar eficazmente el antígeno V1V2 en una conformación trimé nativasimilar9. Muchas metas de vacunas, en particular para enfermedades virales, están presentes como recortadores27. Este fenómeno indica que nuestro diseño de SAPN tiene amplias implicaciones para el desarrollo de vacunas subunidades.
En este método, demostramos cómo producir SHB-SAPNs en un sistema de expresión de E. coli. Expresamos altos rendimientos de proteína (alrededor de 6 mg/100 ml de cultivo). La proteína contenía 10 histidinas y fue fácilmente purificada usando una cromatografía de afinidad de metal inmovilizada con columna Ni2+. Esta longitud de la His-Tag se encontró que es el óptimo para el mayor rendimiento proteico. La proteína purificada contenía la longitud completa de la proteína diseñada como lo indica la presencia tanto de la repetición HisTag de N-terminal como de la heptad terminal C. Utilizamos técnicas ampliamente aceptadas y las optimizamos para la expresión, producción y caracterización del núcleo SHB-SAPN. La falta de producción de la proteína de longitud completa durante el desarrollo de un SAPN que contenga un nuevo epítopo proteico podría indicar un problema de expresión del gen en la célula huésped. Si sucede, el gen y el sistema de expresión deben ser rediseñados y adaptados al protocolo descrito. La modificación del tiempo de sonicación o la intensidad también puede aumentar la concentración de la proteína de longitud completa pronosticada.
Las partículas redobladas estaban en el rango de tamaño esperado (20 a 100 nm)8,24,25 según lo determinado por el ANÁLISis de seguimiento de DLS y nanopartículas. Estos resultados se confirmaron aún más mediante el uso de TEM. Si hay problemas en este paso, normalmente se debe a un problema con el pH o la fuerza iónica del búfer de redoblamiento. Cuando se detectan partículas de gran tamaño en las técnicas de tamaño de partículas, indica la agregación, que se puede evitar aumentando el pH del búfer de redoblamiento. Si las partículas no son detectadas por DLS, verifique la concentración de la proteína y verifique el pH del tampón. La concentración final de proteína para DLS debe ser de al menos 100 g/ml. Si la concentración no es el problema, indica la abundancia de partículas pequeñas e incompletamente formadas, cuya concentración puede reducirse disminuyendo el pH. Alternativamente, la concentración de cloruro de sodio se puede ajustar al rango óptimo para minimizar la presencia de partículas con tamaño no deseado.
Por último, mediante el uso de un paso de lavado de isopropanol durante la purificación pudimos reducir la contaminación del LPS desde el huésped E. coli a 0,01 UE / g de SAPN que está por debajo del límite de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de 5 UE/kg de peso corporal para productos inyectables 28. Este nivel se puede reducir aún más mediante el uso de una columna de intercambio de aniones también conocida como columna Q. Si todavía hay altos niveles de endotoxina, compruebe todos los materiales que se utilizaron para la preparación de tampón. Recuerde utilizar sólo cristalería despirogenada y cristalería libre de endotoxinas en este método.
Estos resultados indican que hemos desarrollado con éxito un método para producir el núcleo SHB-SAPN que se puede utilizar para estudios de inmunización preclínica. Este método con sólo ligeras modificaciones, si las hay, se puede aplicar a la purificación de SHB-SAPNs cuando se añade un antígeno de interés. El uso de este método como punto de partida uno de los cambios principales se encuentra en el paso de elución. Diferentes proteínas eluyen a diferentes concentraciones de imidazol que deben determinarse experimentalmente. La otra diferencia importante podría ser la composición del búfer de redoblamiento. La optimización requeriría probar diferentes condiciones de pH, así como fortalezas iónicas.
Teniendo en cuenta el trabajo futuro, sólo se necesitan dos ligeras modificaciones para permitir la aplicación humana del SHB-SAPN. La primera es que el vector de expresión necesita ser cambiado a un marcador seleccionable de resistencia a la kanamicina debido a la alergia a la ampicilina en los seres humanos29. El otro requisito importante de la fabricación de proteínas para uso humano es producir el SHB-SAPN en medios libres de productos animales. Un estudio a pequeña escala ya indicó un rendimiento razonable de proteína en un medio de base vegetal. El trabajo presentado aquí es fácilmente escalable para la producción definitiva de GMP como se ha demostrado con un candidato a la vacuna contra el paludismo, FMP01416. Esta producción FMP014-SAPN a gran escala incluía tanto el intercambio de aniones como los pasos de intercambio catiónico para reducir aún más el contenido de LPS y Ni2+ del producto final. Este SAPN con expreses bacterianos ya se ha ampliado para un próximo ensayo clínico de Fase 1/2a.

Si bien el desarrollo de vacunas tradicionales se ha centrado en los patógenos inactivados o atenuados, el enfoque de las vacunas modernas se ha desplazado hacia las vacunas subunidades1. Este enfoque puede conducir a una respuesta más específica y potencialmente más eficaces a los candidatos a vacunas. Sin embargo, uno de los principales inconvenientes es que las vacunas subunidades no sonpartículas como organismos enteros, lo que puede resultar en una inmunogenicidad reducida 2. Una nanopartícula como sistema de visualización de antígenos repetitivo puede tener los beneficios tanto del enfoque de la vacuna subunidad dirigida como de la naturaleza particulada de todo el organismo1,3.
Entre los tipos existentes de nanovacunas, los conjuntos de proteínas racionalmente diseñados permiten el diseño y desarrollo decandidatos a vacunas que pueden presentar múltiples copias del antígeno potencialmente en una conformación nativa 1,4 ,5,6. Un ejemplo de estos conjuntos de proteínas son las nanopartículas de proteínaauto (SAPN)7. Los SAPN se basan en dominios de bobina sin bobina y se expresan tradicionalmente en Escherichia coli8. Se han desarrollado candidatos a vacunas SAPN para una variedad de enfermedades como elpaludismo, el SRAS, la gripe, la toxoplasmosis y el VIH-1 9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. El diseño de cada candidato a SAPN es específico del patógeno de interés, sin embargo, las técnicas de producción, purificación y redistribución son generalmente ampliamente aplicables.
Uno de nuestros intereses actuales es una vacuna eficaz contra el VIH-1. En RV144, el único ensayo clínico de fase III de una vacuna contra el VIH-1 que demostró una eficacia modesta, el menor riesgo de infección se correlacionó con los anticuerpos IgG con el bucle V1V2 de la proteína envolvente20,21. Se cree que la presentación trimérica nativa de esta región es importante para la inmunogenicidad protectora22. Para presentar el bucle V1V2 lo más cerca posible de la conformación nativa, desarrollamos una prueba de la principal vacuna SAPN candidata que contenía el paquete de seis hélices posterior a la fusión del sobre VIH-1 (SHB) para presentar el bucle V1V2 en la conformación correcta9 . Este candidato fue reconocido por anticuerpos monoclonales conocidos a la proteína de envoltura VIH-1. Los ratones inmunizados con V1V2-SHB-SAPN elevaron anticuerpos específicos V1V2, que, lo más importante, están vinculados a gp70 V1V2, los epítopos conformacionales correctos9. El núcleo SHB-SAPN podría tener otras funciones más allá del papel como portador para el bucle HIV-1 V1V2. Aquí describimos una metodología detallada para la expresión, purificación, redistribución y validación del núcleo SHB-SAPN. La selección de la secuencia, el diseño de nanopartículas, la clonación molecular y la transformación de E. coli se han descrito previamente9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

Las nanopartículas de proteínas autoensambladas (SAPN) funcionan como pantallas de antígeno repetitivo y se pueden utilizar para desarrollar una amplia gama de vacunas para diferentes enfermedades infecciosas. En este artículo demostramos un método para producir un núcleo SAPN que contiene un conjunto de paquete de seis hélices (SHB) que es capaz de presentar antígenos en una conformación trimé. Describimos la expresión del SHB-SAPN en un sistema de E. coli, así como los pasos de purificación de proteínas necesarios. Incluimos un paso de lavado de isopropanol para reducir el lipopolisacárido bacteriano residual. Como una indicación de la identidad y pureza de la proteína, la proteína reaccionó con anticuerpos monoclonales conocidos en los análisis de manchas occidentales. Después de volver a plegar, el tamaño de las partículas cayó en el rango esperado (20 a 100 nm), que fue confirmado por dispersión dinámica de la luz, análisis de seguimiento de nanopartículas y microscopía electrónica de transmisión. La metodología descrita aquí está optimizada para el SHB-SAPN, sin embargo, con sólo ligeras modificaciones se puede aplicar a otras construcciones de SAPN. Este método también es fácilmente transferible a la producción a gran escala para la fabricación de GMP para vacunas humanas.

El SHB-SAPN completamente ensamblado que se muestra aquí se basa en secuencias proteicas (Figura1A)que se prevé que se plieguen en una partícula que contenga 60 copias del monómero (Figura1B). La Figura 2 proporciona un esquema del método para la producción, purificación e identificación del núcleo SHB-SAPN. E. coli de una población de glicerol que contenía un vector de expresión pPep-T con secuencia genética del núcleo SHB-SAPN fueron inducidos en BL21 (DE3) E. coli. Las células bacterianas se cultivaron con éxito y se lisó bajo condiciones de desnaturalización y reducción.
El lisato de célula total se utilizó para purificar los monómeros SHB-SAPN mediante FPLC utilizando una columna Ni2+ (Figura3A). El cromatógrafo FPLC demuestra que la proteína eluyó tanto a 150 mM como a 500 mM de imidazol (Figura3A). El cromatograma también muestra otros dos picos a 185 ml y 210 ml de volumen total correspondiente al lavado de isopropanol y al lavado sin imidazol, respectivamente. Las fracciones y la pureza de la proteína recombinante fueron identificadas por geles SDS-PAGE gradiente (Figura3B). La proteína de interés se localizó principalmente en las fracciones 68-u201279 (278-u2012300 mL de volumen total). Estas fracciones se combinaron para análisis posteriores. Western blot con anticuerpo anti-His (N-terminal) y 167-D-IV anticuerpo (C-terminus) indicó que las fracciones agrupadas eran de hecho la proteína de interés (Figura4A,B). Estas manchas también demostraron la presencia de los multimers SHB-SAPN. Los lavados anteriores y las fracciones de elución tendían a contener una mayor concentración de proteína multimerizada y, por lo tanto, estaban excluidos.
Las muestras que contenían los monómeros proteicos de interés se plegaron en el SHB-SAPN completamente ensamblado mediante diálisis. La distribución del tamaño de partícula se determinó mediante el análisis de seguimiento de DLS y nanopartículas (Figura5A,B). El DLS identificó partículas con un diámetro hidrodinámico medio Z de 67 nm, mientras que el sistema NTA midió un tamaño medio de 81 nm. Las ligeras diferencias de tamaño se debieron a las técnicas de dimensionamiento de partículas, sinembargo, el tamaño de ambos análisis estaba en el rango esperado de 20-u2012100 nm 8,24,25. Los SHB-SAPN fueron visualizados por TEM y las imágenes mostraban partículas individuales bien formadas con la distribución del tamaño obtenida de las dos técnicas de dimensionamiento de partículas (Figura5C).
Durante la purificación de la proteína, la columna fue lavada con isopropanol para disminuir la contaminación por LPS en el producto final SHB-SAPN. Para verificar si el nivel de endotoxina era aceptable para la inmunización, la concentración de LPS en muestras SHB-SAPN purificadas con o sin el paso de lavado de isopropanol se determinó mediante un ensayo cinético de LAL. Los resultados indicaron que el lavado de isopropanol disminuyó los niveles de endotoxina de >0,25 UE/g a 0,010 EU/g de proteína SHB-SAPN (Tabla 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> Figura 1: Secuencia y estructura proteica SHB-SAPN. (A) La secuencia de aminoácidos del monómero SHB-SAPN. (B) Modelo informático de la estructura del núcleo SHB-SAPN completamente ensamblado que consta de 60 monómeros proteicos. Esquema de color para secuencias de aminoácidos: Gris - HisTag; Verde - pentamer; Borde de diseño azul oscuro de novo; Paquete azul claro de seis hélices. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> Figura 2: Diagrama de flujo de la protocolo para la producción SHB-SAPN. Esquema de color: Negro - expresión del monómero proteico en E. coli; Gris oscuro - purificación de monómeros; Gris medio - identificación del monómero; Gris claro : redoblamiento y caracterización; Blanco: producto SHB-SAPN completamente ensamblado. En pasos etiquetados con gris oscuro y medio, la proteína está bajo condiciones desnaturalizantes y reductoras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> Figura 3: Purificación de proteínas de los monómeros SHB-SAPN. (A) Cromatógrafo de la purificación FPLC. La línea verde sobre el cromatograma indica los pasos de purificación. La línea azul en el cromatograma representa la densidad óptica de las fracciones a 280 nm de longitud de onda. La línea negra muestra qué porcentaje del tampón B (urea de 8 M, Tris de 20 mM, fosfato sódico de 50 mM monobásico, 5 mM TCEP, 500 mM de Imidazol, pH 8.5) que se utilizó en cada etapa de la purificación. (B) Geles SDS-PAGE de las fracciones agrupadas del lisado (L), el flujo a través (FT), el primer lavado (W1), el lavado de isopropanol (W2), el tercer lavado (W3) y las fracciones individuales de los pasos de elucion de 150 mM de imidazol (E150) y 500 mM de imidazol (E500) Purificación. Los marcadores moleculares en el primer carril (M) identifican bandas entre 10 y 250 kDa. La proteína diana está indicada por una flecha negra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> Figura 4: Identificación de la proteína por mancha occidental. Todos los carriles están cargados con 100 ng de proteína. (A) Resultados de una mancha occidental con anti-6x HisTag. (B) Resultados de una mancha occidental con un anticuerpo monoclonal 167-D-IV HIV-1. Los carriles están etiquetados como: M - marcador de peso molecular; 1 o lisado; 2 - Flujo a través; 3o primer lavado; 4o lavado de isopropanol (segundo lavado); 5o tercer lavado; 6 fracciones de volumen agrupado 56-u201261 (primer pico de elución), 7 facciones de volumen agrupado 62-u201267 (entre los dos picos), 8 fracciones de volumen agrupado 68-u201278 (segundo pico de elución). La proteína objetivo con el tamaño de banda esperado de 18,07 kDa como la banda monomérica SHB-SAPN está indicada por una flecha negra. Las bandas adicionales en los carriles 7 y 8 son dimers, trimers y multimers del SHB-SAPN (flecha roja). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> Figura 5: Caracterización del SHB-SAPN redoblado. (A). Distribución del tamaño de partícula determinada por DLS. ( B ) Tamañodepartícula determinado por el seguimiento de nanopartículas (sistema). (C) Visualización de las partículas SHB-SAPN por TEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Muestra</td>
			<td>Endotoxina (EU/mL)</td>
			<td>Endotoxina (UE/g de proteína)</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN con lavado de isopropanol</td>
			<td>2.02</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN sin lavado de isopropanol</td>
			<td>>50</td>
			<td>>0.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Control negativo</td>
			<td>Por debajo del nivel de detección</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Niveles de endotoxina de SHB-SAPN sióndos. Los niveles de endotoxina en muestras SHB-SAPN purificadas con o sin un lavado de isopropanol se presentan tanto como unidades de endotoxina/ml como endotoxinas/g de proteína SHB-SAPN.

Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Aquí se proporciona un método detallado que describe la purificación, el enjuimiento y la caracterización de nanopartículas de proteínas autoensamblables (SAPN) para su uso en el desarrollo de vacunas.

Producción de E. coli-expresada Nanopartículas de Proteína Auto-Ensamblaje para Vacunas Que Requieren Presentación de Epitope Trimérico

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Las nanopartículas proteicas autoensambladas, o SAPN, se pueden utilizar para desarrollar vacunas contra diversas enfermedades infecciosas. Este método que describimos aquí se puede utilizar para purificar, refoldear y caracterizar SAPN que contienen un paquete de seis hélices. Esta nanopartícula puede presentar antígenos triméricos en una conformación nativa.Con ligeras modificaciones, este método se puede aplicar a otras construcciones innovadoras de vacunas SAPN. Además, puede ser fácilmente transferible a la producción a gran escala para ensayos clínicos. Para la lisis de E.coli cosechada que expresa el paquete de seis hélices SAPN, utilice una sonda con la salida de sonicación de 150 vatios con cuatro segundos de sonicación y seis segundos de descanso, para sonicar pellets bacterianos resuspendidos en 40 mililitros de imidazol-libre sobre el hielo durante cinco minutos.Centrifugar el izado celular para generar un sobrenadante clarificado y transferir el sobrenadante a un matraz estéril de 150 mililitros. A continuación, lleve la muestra a un volumen final de 100 mililitros con tampón fresco libre de imidazol. Para aislar la proteína de interés, abra el software FPLC y haga clic en la opción Nuevo método.En el menú Configuración del método, abra el menú desplegable Posición de columna y seleccione C1 Puerto 3. En el menú desplegable Se muestra por técnica, seleccione Afinidad. En el menú desplegable Tipo de columna, seleccione Otros, HisTrap HP y cinco mililitros.Los cuadros Volumen de columna y Presión se establecerán automáticamente en los valores adecuados. Haga clic en Esquema del método y arrastre los botones Equilibrio y Aplicación de ejemplo, tres botones de lavado de columnas y Elución del menú emergente Biblioteca de fases junto a la flecha antes de cerrar el menú Biblioteca de fases. Haga clic en Equilibrio y establezca los valores enumerados en la tabla en Búfer inicial B, 4%Búfer final B, 4% y Volumen de columna, cinco.Haga clic en Aplicación de ejemplo. En el cuadro Carga de muestra, haga clic en el botón de opción Inyectar muestra en columna con bomba de muestra y confirme que la casilla situada junto a Usar caudal de configuración de método está marcada en la casilla Inyección de muestra con bomba de sistema. Cambie el valor del cuadro Volumen a 100 mililitros y el Esquema de colección de fracciones a Habilitar.Haga clic en el cuadro Usar tamaño de fracción de configuración de método y cambie el Tamaño de fracción a cuatro mililitros. Haga clic en el primer botón de lavado de columnas, establezca los valores enumerados en la tabla en Búfer inicial B, 4%Búfer final B, 4% y volumen de columna, 10. Haga clic en el cuadro Habilitar esquema de colección de fracciones y haga clic en Usar tamaño de fracción desde configuración de método.Cambie el Tamaño de fracción a cuatro mililitros y haga clic en el segundo botón De lavado de columnas. Establezca los valores de la tabla en Búfer inicial B, 0%Búfer final B, 0% y Volumen de columna, cinco. Haga clic en el cuadro Habilitar esquema de colección de fracciones y haga clic en Usar tamaño de fracción desde configuración de método.Cambie el Tamaño de fracción a cuatro mililitros y haga clic en el tercer botón de lavado de columnas. Establezca los valores de la tabla en Búfer inicial B, 0%Búfer final B, 0% y Volumen de columna, 10. Haga clic en el botón Habilitar esquema de colección de fracciones y haga clic en el cuadro Usar tamaño de fracción desde configuración de método.A continuación, cambie el Tamaño de fracción a cuatro mililitros. Haga clic en el botón Elution y haga clic con el botón derecho en la información de la tabla. En el menú emergente, haga clic en Eliminar paso y arrastre el botón Degradado isocrático a la tabla dos veces, de modo que haya dos entradas.Establezca el valor de la primera entrada en Búfer inicial B, 30%Búfer final B, 30% y Volumen de columna, 10. Establezca el valor de la segunda entrada en Búfer inicial B, 100%Búfer final B, 100% y Volumen de columna, 10. Haga clic en el botón Habilitar esquema de colección de fracciones y haga clic en el cuadro Usar tamaño de fracción desde configuración de método.A continuación, haga clic en Guardar como y asigne un nombre a la purificación de archivos. Coloque la bomba Un tubo del FPLC en el tampón de lavado libre de imidazol y el tubo B de la bomba en el tampón de imidazol de 500 mililitros. Coloque el tubo de la bomba de muestra en la muestra de 100 mililitros y ejecute el programa de purificación.Cuando se necesite el lavado 60%isopropanol, detenga el programa, mueva el tubo A de la lava sin imidazol al lavado 60%isopropanol y reinicie el programa. Al final del lavado, detenga el programa de nuevo, devuelva la bomba A tubo al tampón de lavado libre de imidazol y reinicie el programa de purificación. Para evaluar la pureza de la proteína purificada, primero combine las fracciones del flujo a través, lave una, lave dos y lave tres pasos, en tubos cónicos individuales de 50 mililitros.A continuación, mezcle 15 microlitros de cada tubo de muestra con 15 microlitros de tamplio 2X Laemmli en tubos de microcentrífuga individuales de 0,5 mililitros y desnaturalizar las muestras a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Al final de la incubación, configure un aparato de funcionamiento de gel con tres geles de poliacrilamida prefabricados de cuatro a 20% prefabricados en el tampón de funcionamiento Tris-Glycine SDS-PAGE. Cargue ocho microlitros de marcador de peso molecular en el primer pozo de cada gel y 30 microlitros de muestra desnaturalada a los otros pozos.Ejecute los geles a 200 voltios hasta que el frente del tinte llegue a la parte inferior del gel y enjuague brevemente los geles con agua desionizada antes de tomar imágenes inmediatamente con un sistema de imágenes sin manchas. A continuación, identifique las fracciones que contienen bandas de proteínas con el tamaño correcto y acoja estas fracciones. Para el plego de seis hélices SAPN, agregue de 10 a 20 mililitros de proteína agrupada a un casete de diálisis de peso molecular de 10 kilodalton.Dializa el cassette en ocho urea molar, Tris de 20 mililitros, 5% glicerol y TCEP de cinco mililitrolares a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, disminuya la concentración de urea en el tampón de diálisis de forma escalonada en dos molares cada dos horas para dializar lentamente la urea fuera de la muestra. Cuando la concentración de urea alcance dos molares, mueva el aparato de diálisis a cuatro grados centígrados y marque la muestra en urea de 120 mililitros, Tris de 20 mililitros y 5% de glicerol durante la noche para terminar el plegado.A la mañana siguiente, retire la proteína reombrada del cassette y filtre el paquete de seis hélices SAPN a través de un filtro de jeringa de fluoruro de polivinilideno de 0,22 micras. Para medir el tamaño medio de partícula del paquete de seis hélices SAPN, añada 45 microlitros de paquete de seis hélices SAPN a una cubeta desechable y coloque la cubeta en la máquina DLS. A continuación, cree un nuevo archivo de medición y ejecute un procedimiento operativo estándar preescrito para proteínas en urea de 120 mililitros, Tris de 20 mililitros y tampón de glicerol al 5% de glicerol a 25 grados centígrados.A continuación, inicie la medición. El tamaño medio Z, la PDI y los resultados de distribución se calcularán para cada ejecución. La máquina leerá la muestra cinco veces.Este paquete de seis hélices completamente ensamblado SAPN se basa en secuencias de proteínas que se prevé que se plieguen en una partícula que contiene 60 copias del monómero. El lisato celular total se utilizó para purificar los monómeros SAPN de seis hélices por FPLC utilizando una columna de níquel, lo que demuestra que la proteína eluía tanto en imidazol de 150 y 500 milpiés. El cromatograma también muestra otros dos picos en 185 y 210 mililitros de volumen total correspondiente al lavado de isopropanol y el lavado libre de imidazol respectivamente.Las fracciones y la pureza de la proteína recombinante podrían identificarse mediante geles SDS-PAGE de gradiente con la proteína de interés ubicada principalmente en la fracción 68 a 79. El análisis de manchas occidentales con anticuerpos anti-his y anti-167D4 indicaba que las fracciones agrupadas eran de hecho la proteína de interés. Las manchas también demostraron la presencia del paquete de seis hélices SAPN multimers.Las muestras que contenían los monómeros proteicos de interés se plegaron en el paquete de seis hélices completamente ensamblado SAPN por diálisis y distribución del tamaño de partícula fue determinado por el análisis de seguimiento de nanopartículas y DLS. La visualización por microscopía electrónica de transmisión reveló partículas SAPN de paquete individual de seis hélices bien formadas con la distribución del tamaño obtenida de las dos técnicas de tamaño de partículas. El paso más importante en este protocolo es el refolding del paquete de seis hélices SAPN.El pH correcto y la fuerza iónica del tampón de plegado son esenciales. Usando un lavado de isopropanol durante la purificación, pudimos reducir la contaminación de LPS a un nivel muy bajo. Sin embargo, LPS se puede reducir aún más utilizando una columna de intercambio de aniones según sea necesario.Esta tecnología se puede adaptar fácilmente para aplicaciones humanas. Ya se ha ampliado un SAPN expresado por bacterias para un ensayo clínico de malaria de próxima fase 1/2a.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Termodinámica del plegado de proteínas de membrana medido por espectroscopia de fluorescencia

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Investigación

Bioingeniería

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulación de nanopartículas poliméricas mediante la técnica de dibloque Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Análisis de la proteína viral dirigida Nanopartículas Entregado a tumores HER2 +

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Armónica Nanopartículas para Regenerativa de Investigación

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Producción de nanopartículas metálicas por ablación por láser pulsado en líquidos: una herramienta para estudiar las propiedades antibacterianas de las nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Protocolo genérico para la optimización de la producción de proteína heteróloga utilizando tecnología Microbioreactor automatizada

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Funcionalización superficial de nanopartículas de Virus de Hepatitis E métodos de conjugación química

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el Immunostaining de células en 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...