Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett samarbetsavtal (W81XWH-11-2-0174) mellan Henry M Jackson Foundation för befordran av militär medicin, Inc., och det amerikanska försvarsdepartementet. Anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV antikropp mottogs från Dr Susan Zolla-Pazner genom NIH AIDS reagens program.

<ol>
	<li>Karch, C. P., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+technologies:+From+whole+organisms+to+rationally+designed+protein+assemblies.">Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies.</a> Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).</li><li>Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Immunologic+Properties+of+Soluble+Versus+Particulate+Antigens.">Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens.</a> Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).</li><li>Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+basis+for+enhanced+immunity+of+nanoparticle+vaccines.">Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).</li><li>Yeates, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Principles+for+Designing+Highly+Symmetric+Self-Assembling+Protein+Nanomaterials.">Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).</li><li>Marcandalli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Potent+Neutralizing+Antibody+Responses+by+a+Designed+Protein+Nanoparticle+Vaccine+for+Respiratory+Syncytial+Virus.">Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus.</a> Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decorating+Self-Assembled+Peptide+Cages+with+Proteins.">Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins.</a> ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).</li><li>Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembling+Protein+Nanoparticles:+implications+for+HIV-1+vaccine+development.">Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development.</a> Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).</li><li>Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+design+of+peptides+that+self-assemble+into+regular+polyhedral+nanoparticles).">Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles).</a> Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+displaying+HIV-1+Env+V1V2+loop+in+a+native-like+trimeric+conformation+as+vaccine+antigen.">Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen.</a> Nanomedicine. , (2018).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+P.+falciparum+specific+coiled-coil+domain+to+construct+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+to+prevent+malaria.">The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-adjuvanted+nanoparticle+based+vaccine+against+infectious+bronchitis+virus.">A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus.</a> PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).</li><li>Wahome, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+display+of+4E10+and+2F5+epitopes+on+self-assembling+protein+nanoparticles+as+a+potential+HIV+vaccine.">Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+novel+immunogenic+nanoparticle+platform+for+Toxoplasma+peptide+vaccine+in+HLA+transgenic+mice.">Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice.</a> Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonadjuvanted+polypeptide+nanoparticle+vaccine+confers+long-lasting+protection+against+rodent+malaria.">A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria.</a> Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibody+and+CD8++T-cell+responses+to+the+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+protein+induced+by+a+nanoparticle+vaccine.">Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine.</a> PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).</li><li>Seth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+targeting+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+delivered+in+three+Army+Liposome+Formulation+adjuvants.">Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants.</a> Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+nanoparticles+with+built-in+flagellin+domains+increases+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+falciparum+based+vaccine.">Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine.</a> Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanovaccine+confers+robust+immunity+against+Toxoplasma.">Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma.</a> NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+self-adjuvanted+protein+nanoparticles+provides+protection+against+lethal+influenza+challenge.">Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge.</a> Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).</li><li>Haynes, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-correlates+analysis+of+an+HIV-1+vaccine+efficacy+trial.">Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial.</a> New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).</li><li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand.">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).</li><li>O&#39; Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+gp120+V1V2+loop:+structure,+function+and+importance+for+vaccine+development.">The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development.</a> Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).</li><li>Babapoor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Vaccine+Using+Nanoparticle+Platform+to+Present+Immunogenic+M2e+against+Avian+Influenza+Infection.">A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection.</a> Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).</li><li>Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+self-assembling+protein+nanoparticle+architectures+for+applications+in+vaccine+design.">Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design.</a> Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).</li><li>Indelicato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+Governing+the+Self-Assembly+of+Coiled-Coil+Protein+Nanoparticles.">Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles.</a> Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).</li><li>Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+assemblies+and+their+biomedical+applications.">Nanoscale assemblies and their biomedical applications.</a> Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).</li><li>Rey, F. A., Lok, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Features+of+Enveloped+Viruses+and+Implications+for+Immunogen+Design+for+Next-Generation+Vaccines.">Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines.</a> Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Endotoxins.">Bacterial Endotoxins.</a> United States Pharmacopeia (USP). , (2011).</li><li>. Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/media/76255/download">https://www.fda.gov/media/76255/download</a> (1993)</li></ol>

De synpunkter som uttrycks är de av författarna och bör inte tolkas som representerar ståndpunkter den amerikanska armén eller försvarsdepartementet. Peter Burkhard har ett intresse för företaget som heter alpha-O peptider AG och har patent på tekniken. De andra författarna har ingen anknytning eller ekonomiskt engagemang med något företag med ett ekonomiskt intresse i ämnet som presenteras i detta dokument.

Nanoteknik ger många fördelar och lösningar för subenhet vaccinutveckling. Nanovaccines kan upprepade gånger presentera antigener som partiklar till värd immunsystemet ökar immunogeniciteten26. Även om det finns många olika typer av nanovaccines, tror vi att de som består av de Novo utformat protein verkar vara den starkaste metoden för vaccinutveckling1. De kan vara konstruerade utan någon sekvens homologi till värden proteiner och presentera antigen av intresse i nära infödda-liknande konformation samtidigt som låg produktionskostnad och hög produkt avkastning. Ett utmärkt exempel på detta tillvägagångssätt är SAPN teknik, som vi har tillämpat på vacciner mot flera infektionssjukdomar7. Ta itu med svårigheterna i HIV-1 vaccinutveckling, har vi konstruerat en unik SHB-SAPN kärna för att effektivt presentera V1V2 antigen i en infödd-liknande trimeric konformation9. Många vaccin mål, särskilt för virussjukdomar, är närvarande som trimerer27. Detta fenomen indikerar att vår sapn design har stora konsekvenser för utvecklingen av subenhet vacciner.
I den här metoden visar vi hur man producerar SHB-SAPNs i ett E. coli -uttryckssystem. Vi uttryckte hög avkastning av protein (om 6 mg/100 mL kultur). Proteinet innehöll 10 histidines och var lättrenat med hjälp av en immobiliserad metallaffinitetskromatografi med ni2 + kolonn. Denna längd av hans-taggen konstaterades vara den optimala för den högsta protein avkastningen. Det renade proteinet innehöll full längd av det designade proteinet, vilket indikeras av närvaron av både N-terminalen HisTag och C-terminalen heptad REPEAT. Vi utnyttjade allmänt accepterade tekniker och optimerade dem för uttryck, produktion och karakterisering av SHB-SAPN kärna. Brist av produktionen av det hellångt protein under utvecklingen av en sapn som innehåller ett nytt protein epitop kunde indikera ett uttrycks problem av genen i den värdcellen. Om det händer måste genen och uttrycks systemet omformas och anpassas till det beskrivna protokollet. Modifiering av ultraljudsbehandling tid eller intensitet kan också öka koncentrationen av det förutspådda fullängds proteinet.
Omvikta partiklar var i det förväntade storleksintervallet (20 till 100 nm)8,24,25 som bestäms av DLS och nanopartiklar spårningsanalys. Dessa resultat bekräftades ytterligare med hjälp av TEM. Om det finns problem i detta steg, är det normalt på grund av ett problem med pH eller jonisk styrka av vika buffert. När stor storlek partiklar upptäcks på partikel dimensionering tekniker, det indikerar aggregering, som kan undvikas genom att öka pH i vika buffert. Om partiklarna inte upptäcks av DLS, kontrollera koncentrationen av proteinet och kontrollera pH i bufferten. Den slutliga protein koncentrationen för DLS bör vara minst 100 μg/mL. Om koncentrationen inte är problemet, indikerar det överflödet av små, ofullständigt bildade partiklar, vars koncentration kan reduceras genom att minska pH. Alternativt kan natriumkloridkoncentrationen justeras till det optimala intervallet för att minimera närvaron av partiklar med oönskad storlek.
Slutligen, genom att använda en isopropanol tvätta steg under rening vi kunde minska kontaminerande LPS från värden E. coli till 0,01 EU/μg av sapn som är under Food and Drug Administration (FDA) gräns på 5 EU/kg kroppsvikt för injicerbara produkter 28. denna nivå kan minskas ytterligare genom att använda en anjonväxling kolumn även känd som Q kolumn. Om höga halter av endotoxin fortfarande finns, kontrollera alla material som användes för att förbereda buffert. Kom ihåg att endast använda depyrogenated glas och endotoxin fri plasticware i denna metod.
Dessa resultat indikerar att vi framgångsrikt har utvecklat en metod för att producera SHB-SAPN kärna som kan användas för prekliniska immuniseringsstudier. Denna metod med endast smärre ändringar, om någon, kan tillämpas på rening av SHB-SAPNs när ett antigen av intresse tillsätts. Med den här metoden som utgångspunkt är en av de stora förändringarna i elutionssteget. Olika proteiner eluera vid olika imidazolkoncentrationer som måste bestämmas experimentellt. Den andra stora skillnaden kan vara sammansättningen av vika buffert. Optimering skulle kräva att testa olika pH-förhållanden samt Joniska styrkor.
Med tanke på det framtida arbetet behövs endast två smärre modifieringar för att möjliggöra mänsklig tillämpning av SHB-SAPN. Den första är att uttrycket vektorn måste ändras till ett kanamycin motstånd valbar markör på grund av ampicillin allergi hos människor29. Det andra stora kravet på proteintillverkning för humant bruk är att producera SHB-SAPN i animaliska produkter-fria medier. En småskalig studie indikerade redan en rimlig avkastning av protein i en växtbaserad media. Det arbete som presenteras här är lätt skalbar för ultimat GMP produktion som demonstreras med en malariavaccin kandidat, FMP01416. Denna storskaliga FMP014-SAPN produktion ingår både anjonbyte och cation Exchange steg för att ytterligare minska LPS och ni2 + innehåll från slutprodukten. Denna bakterie-uttryckt SAPN har redan skalats upp för en kommande fas 1/2a klinisk prövning.

Medan traditionell vaccinutveckling har fokuserat på inaktiverade eller försvagade patogener, har fokus för moderna vacciner skiftat mot subenhet vacciner1. Detta tillvägagångssätt kan leda till ett mer målinriktat svar och potentiellt mer effektiva vaccinkandidater. Men en av de viktigaste nackdelarna är att subenhet vacciner inte partiklar som hela organismer som kan resultera i minskad immunogenicitet2. En nanopartikel som ett repetitivt antigen visningssystem kan ha fördelarna med både den riktade subenhet-vaccinmetoden samt partikel karaktären hos hela organismen1,3.
Bland de befintliga typerna av nanovaccines, rationellt utformade protein sammansättningar möjliggör utformning och utveckling av vaccinkandidater som kan presentera flera kopior av antigen potentiellt i en infödd-liknandekonformation1,4 ,5,6. Ett exempel på dessa protein sammansättningar är självassemblerande proteinnanopartiklar (SAPNs)7. SAPNs är baserade på coiled-Coil domäner och är traditionellt uttrycks i Escherichia coli8. Sapn-vaccinkandidater har utvecklats för en rad olika sjukdomar som malaria, sars, influensa, toxoplasmos, och hiv-19,10,11,12,13 , fjorton , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. utformningen av varje sapn kandidat är specifik för patogenen av intresse, dock, produktion, rening och omläggning tekniker är i allmänhet i stort sett tillämpliga.
Ett av våra nuvarande intressen är ett effektivt HIV-1-vaccin. I RV144 – den enda kliniska fas III-prövningen av ett hiv-1-vaccin som visade måttlig effekt – var den minskade infektionsrisken korrelerad med IgG-antikroppar mot V1V2-slingan av kuvert proteinet20,21. Den infödda-liknande trimeric presentationen av denna region tros vara viktig för skyddande immunogenicitet22. För att presentera V1V2 loop i så nära infödda-liknande konformation som möjligt, vi utvecklat ett bevis på principen SAPN vaccinkandidat som innehöll HIV-1 kuvert efter fusion Six-Helix Bundle (SHB) att presentera V1V2 slingan i rätt konformation9 . Denna kandidat erkändes av kända monoklonala antikroppar mot HIV-1 kuvert protein. Möss immuniserade med V1V2-SHB-sapn upp V1V2 specifika antikroppar, som, viktigast av allt, bunden till gp70 V1V2, rätt överensstämande epitoper9. SHB-SAPN Core kan ha andra funktioner utöver rollen som bärare för HIV-1 V1V2 loop. Här beskriver vi en detaljerad metodik för uttrycket, rening, refolding, och validering av SHB-SAPN kärna. Sekvensvalet, nanopartiklar-designen, den molekylära kloningen och omvandlingen av E. coli har beskrivits tidigare9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

Självassemblerande proteinnanopartiklar (SAPNs) fungerar som repetitiva antigen skärmar och kan användas för att utveckla ett brett spektrum av vacciner för olika infektionssjukdomar. I denna artikel visar vi en metod för att producera en SAPN kärna som innehåller en sex-Helix bunt (SHB) församling som kan presentera antigener i en trimeric konformation. Vi beskriver uttrycket av SHB-SAPN i ett E. coli -system, liksom de nödvändiga protein reningsstegen. Vi inkluderade en isopropanol tvätta steg för att minska resterande bakteriell lipopolysackarid. Som en indikation på protein identitet och renhet, proteinet reagerade med kända monoklonala antikroppar i västerländska blot analyser. Efter uppfällning, föll storleken på partiklarna i det förväntade intervallet (20 till 100 nm), vilket bekräftades av dynamisk ljusspridning, nanopartiklar spårningsanalys, och transmissionselektronmikroskopi. Den metod som beskrivs här är optimerad för SHB-SAPN, men med endast smärre ändringar kan den tillämpas på andra SAPN konstruktioner. Denna metod är också lätt att överföra till storskalig produktion för GMP-tillverkning för humanvaccin.

Den färdigmonterade SHB-SAPN som visas här bygger på proteinsekvenser (figur 1a) som förutspås vika in i en partikel som innehåller 60 exemplar av monomeren (figur 1b). I figur 2 finns en beskrivning av metoden för produktion, rening och identifiering av SHB-sapn-kärnan. E. coli från ett glycerolbestånd som innehöll en Ppep-T-uttrycksvektor med gensekvens av SHB-sapn-kärnan INDUCERADES i BL21 (de3) E. coli. Bakterieceller framgångsrikt odlas och lyseras under denaturering och minska villkor.
Total cell lysate användes för att rena SHB-SAPN monomerer av FPLC med en ni2 + kolonn (figur 3a). FPLC-kromatografen visar att proteinet eluerat både vid 150 mM och 500 mM Imidazol (figur 3a). Kromatogrammet visar också två andra toppar vid 185 mL och 210 mL total volym motsvarande isopropanoltvätt respektive Imidazol-fri tvätt. Fraktionerna och renheten hos det rekombinanta proteinet identifierades med hjälp av gradientbaserade SDS-PAGE Gels (figur 3b). Proteinet av intressera var i första hand lokaliserat i fraktioner 68 \ u201279 (278 \ u2012300 mL räkna samman volym). Dessa fraktioner kombinerades för ytterligare analyser. Western blot med anti-his antikropp (N-Terminal) och 167-D-IV antikropp (C-terminus) indikerade att de poolade fraktionerna verkligen var proteinet av intresse (figur 4a, B). Dessa blotting visade också närvaron av SHB-sapn multimers. Tidigare tvättningar och elutionsfraktioner tenderade att innehålla en högre koncentration av multimeriserat protein och exkluderades därför.
Proverna som innehöll proteinmonomerer av intresse var vikt i den färdigmonterade SHB-SAPN genom dialys. Partikelstorleksfördelningen fastställdes med hjälp av DLS-och nanopartikelspårningsanalys (figur 5a, B). DLS identifierade partiklar med en Z-genomsnittlig hydrodynamisk diameter på 67 nm medan NTA-systemet mätte en medelstorlek på 81 nm. Den lilla storleksskillnader berodde på partikel dimensionering tekniker, men storleken från båda analyserna var i det förväntade intervallet 20 \ u2012100 nm8,24,25. SHB-SAPNs visualiserades genom TEM och bilderna visade välformade enskilda partiklar med den storleksfördelning som erhålls från de två partikel storleks teknikerna (figur 5c).
Vid rening av proteinet tvättades kolonnen med isopropanol för att minska LPS-föroreningen i den slutliga SHB-SAPN-produkten. För att kontrollera om endotoxinhalten var godtagbar för immunisering bestämdes koncentrationen av LP-skivor i SHB-SAPN-prover som renats med eller utan isopropanoltvättsteg av en kinetisk LAL-analys. Resultaten visade att isopropanoltvätten minskade endotoxinhalten från > 0,25 EU/μg till 0,010 EU/μg SHB-SAPN-protein (tabell 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> Figur 1: SHB-SAPN proteinsekvens och struktur. Aaminosyresekvensen i SHB-sapn-monomeren. Bdatormodell av strukturen hos den FÄRDIGMONTERADE SHB-sapn-kärnan bestående av 60 proteinmonomerer. Färgschema för aminosyresekvenser: Grey = HisTag; Grön = pentamer; Mörkblå = de Novo konstruerade Trimer; Ljusblå = sex-Helix bunt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> Figur 2: flödesschemat för protokoll för SHB-SAPN produktion. Färgschema: svart = uttryck av proteinet monomer i E. coli; Mörkgrå = monomerrening; Medium Grey = monomeridentifiering; Ljusgrå = vika och karaktärisering; Vit = färdigmonterad SHB-SAPN produkt. I steg märkta med mörk och medium grå, är proteinet under denaturering och minska förhållanden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> Figur 3: Proteinrening av SHB-SAPN monomerer. Akromatograf från FPLC-rening. Gröna linjen ovanför kromatogrammet indikerar reningsstegen. Blå linje i kromatogrammet representerar den optiska densiteten av fraktioner vid 280 nm våglängd. Den svarta linjen visar vilken procent av buffert B (8 M urea, 20 mM Tris, 50 mM natriumfosfat monobasic, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazol, pH 8,5) som användes i varje skede av rening. B) geler av de poolade fraktionerna från lysat (L), flöde genom (ft), första tvättningen (W1), isopropanoltvätt (W2), tredje tvätten (W3) och enskilda fraktioner från 150 mm Imidazol (E150) och 500 mm Imidazol (E500) elueringsteg i Rening. Molekyl markörer i den första körfältet (M) identifiera band mellan 10 och 250 kDa. Målproteinet indikeras med en svart pil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> Figur 4: identifiering av proteinet genom Western blot. Alla körfält är laddade med 100 ng av protein. (A) resultat av en västerländsk blot med anti-6X histag. B) resultat av en västerländsk blot med en 167-D-IV hiv-1 monoklonal antikropp. Körfält är märkta som: M = molekylvikt markör; 1 = lysate; 2 = flöde genom; 3 = första tvätten; 4 = isopropanoltvätt (andra tvätten); 5 = tredje tvätten; 6 = poolade volymfraktioner 56 \ u201261 (första elutionstoppen), 7 = poolade volymfraktioner 62 \ u201267 (mellan de två topparna), 8 = poolade volymfraktioner 68 \ u201278 (andra elutionstoppen). Målprotein med den förväntade band storleken 18,07 kDa som monomer SHB-sapn band indikeras av en svart pil. Extra ränder i körfält 7 och 8 är dimers, trimers och multimers av SHB-SAPN (röd pil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> Figur 5: karaktärisering av den omvikta SHB-SAPN. A) partikelstorleksfördelning enligt DLS. Bpartikelstorlek som bestäms av nanopartikelspårning (system). Cvisualisering av SHB-sapn-partiklarna genom tem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Prov</td>
			<td>Endotoxin (EU/mL)</td>
			<td>Endotoxin (EU/μg protein)</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN med Isopropanoltvätt</td>
			<td>2,02</td>
			<td>0,01</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN utan Isopropanoltvätt</td>
			<td>> 50</td>
			<td>> 0,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Negativ kontroll</td>
			<td>Under detekterings nivå</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Endotoxinhalter av revikta SHB-SAPNs. Endotoxinhalten i SHB-SAPN-prover som renats med eller utan en isopropanoltvätt presenteras både som endotoxin enheter/mL och endotoxin enheter/μg SHB-SAPN protein.

Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

En detaljerad metod finns här som beskriver rening, refolding, och karakterisering av självassemblerande proteinnanopartiklar (SAPNs) för användning i vaccinutveckling.

Produktion av E. coli-uttryckt Självassemblerande Proteinnanopartiklar för vacciner som kräver trimeric Epitope presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Självmonterande proteinnanopartiklar, eller SAPNs, kan användas för att utveckla vacciner mot olika infektionssjukdomar. Denna metod som vi beskriver här kan användas för att rena, återfoldera och karakterisera SAPNs som innehåller en sex-helix bunt. Denna nanopartikel kan presentera trimeriska antigener i en infödd-liknande konformation.Med smärre modifieringar kan denna metod tillämpas på andra innovativa SAPN-vaccinkonstruktioner. Vidare kan den enkelt överföras till storskalig produktion för kliniska prövningar. För lys av skördas E.coli uttrycker sex-helix bunt SAPN, använd en sond med ultraljudsbehandling produktionen av 150 watt med fyra sekunder av ultraljudsbehandling och sex sekunders vila, att sonicate resuspended bakteriell pellets i 40 milliliter av imidazole-fri buffert på is i fem minuter.Centrifugera cellulären lysate för att generera en klargjord supernatant och överföra supernatanten till en steril kolv på 150 milliliter. Ta sedan med provet upp till en slutlig volym på 100 milliliter med färsk imidazolfri buffert. Om du vill isolera proteinet av intresse öppnar du FPLC-programvaran och klickar på alternativet Ny metod.Öppna menyn Kolumnposition i menyn Metodinställningar och välj C1 Port 3. Välj Tillhörighet i menyn Visad av teknik. I dropdown-menyn Kolumntyp väljer du Övriga, HisTrap HP och och fem milliliter.Kolonnvolymen och Tryckboxarna kommer automatiskt att ställas in på lämpliga värden. Klicka på Metodkontur och dra knapparna Jämvikt och Exempelprogram, tre knappar för Spalttvätt och knappen Elution från menyn Fasbiblioteks popup bredvid pilen innan du stänger menyn Fasbibliotek. Klicka på Jämvikt och ange de värden som anges i tabellen till Initial buffert B, 4%Slutlig buffert B, 4%och Kolumnvolym, fem.Klicka på Exempelprogram. I rutan Provinläsning klickar du på alternativknappen för Injicera prov på kolumn med Provpump, och bekräfta att rutan bredvid använd flödeshastighet från metodinställningar är markerad i rutan Provinsprutning med systempump. Ändra värdet för rutan Volume till 100 milliliter, och fraktionssamlingsschema att aktivera.Rensa bort rutan Använd fraktionsstorlek från metodinställningar och ändra Fraktionsstorlek till fyra milliliter. Klicka på den första column wash-knappen, ställ in de värden som anges i tabellen till Initial buffert B, 4%Slutlig buffert B, 4%och Kolumnvolym, 10. Klicka på rutan Fraktionssamlingsschema aktivera och oklicka på inställningarna Använd fraktionsstorlek från metodinställningar.Ändra fraktionsstorleken till fyra milliliter och klicka på den andra knappen Spalttvätt. Ange värdena i tabellen till Inledande buffert B, 0%Slutlig buffert B, 0%och Kolumnvolym, fem. Klicka på rutan Fraktionssamlingsschema aktivera och oklicka på inställningarna Använd fraktionsstorlek från metodinställningar.Ändra Fraktionsstorlek till fyra milliliter och klicka på den tredje knappen Spalttvätt. Ange värdena i tabellen till Inledande buffert B, 0%Slutlig buffert B, 0%och Kolumnvolym, 10. Klicka på knappen Fraktionssamlingsschema aktivera och oklicka på rutan Använd fraktionsstorlek från metodinställningar.Ändra sedan Fraktionsstorlek till fyra milliliter. Klicka på Elution-knappen och högerklicka på informationen i tabellen. I popup-menyn klickar du på Ta bort steg och drar knappen Isokratisk övertoning till bordet två gånger, så att det finns två poster.Ange värdet för den första transaktionen till Inledande buffert B, 30%Slutlig buffert B, 30%och Kolumnvolym, 10. Ange värdet för den andra transaktionen till Initial buffert B, 100%Slutlig buffert B, 100%och Kolumnvolym, 10. Klicka på knappen Fraktionssamlingsschema aktivera och klicka på rutan Använd fraktionsstorlek från metodinställningar.Klicka sedan på Spara som och namnge filreningen. Placera pumpen En slang av FPLC i den imidazolfria tvättbufferten, och pumpen B-slangen i bufferten för 500 millimolar imidazol. Placera provpumpslangen i 100-milliliterprovet och kör reningsprogrammet.När 60%-isopropanoltvätten behövs, pausa programmet, flytta pumpen A tubing från den imidazolfria tvätten i 60%-isopropanoltvätten och starta om programmet. I slutet av tvätten, pausa programmet igen, returnera pumpen A tubing till den imidazolfria tvättbufferten och starta om reningsprogrammet. För att bedöma renheten hos det renade proteinet, först kombinera fraktionerna från flödet genom, tvätta en, tvätta två, och tvätta tre steg, i enskilda 50-milliliter koniska rör.Blanda därefter 15 mikroliter från varje provrör med 15 mikroliter 2X Laemmli-buffert i enskilda 0,5-milliliter mikrocentrifugrör och denaturera proverna vid 95 grader Celsius i 10 minuter. I slutet av inkubationen, inrätta en gel kör apparat med tre fläckfri fyra till 20%pregärna polyakrylamid geler i Tris-Glycine SDS-PAGE kör buffert. Ladda åtta mikroliter av molekylviktsmarkör till den första brunnen av varje gel och 30 mikroliter av denaturerat prov till de andra brunnarna.Kör gelerna på 200 volt tills färgämnet fronten träffar botten av gelen och kort skölj gelerna med avjoniserat vatten innan omedelbart avbildning med en fläck-fri bildhantering system. Sedan, identifiera de fraktioner som innehåller proteinband med rätt storlek och pool dessa fraktioner. För sex-helix bunt SAPN refolding, tillsätt 10 till 20 milliliter av poolade protein till en 10 kilodalton molekylär vikt cut-off dialys kassett.Dialys kassetten i åtta molar urea, 20-millimolar Tris, 5%glycerol, och fem-millimolar TCEP vid rumstemperatur över natten. Nästa morgon, minska ureakoncentrationen i dialysbufferten stegvis med två molar varannan timme för att långsamt dialysera ureaen av provet. När ureakoncentrationen når två molar, flytta dialysapparaturen till fyra grader Celsius och dialysa provet i 120-millimolar urea, 20-millimolar Tris och 5%glycerol över natten för att avsluta omvikningen.Nästa morgon, ta bort refolded protein från kassetten och filtrera sex-helix bunt SAPN genom en 0,22-mikrometer polyvinyliden fluorid sprutfilter. För att mäta medelvärdet partikelstorleken på sex-helix bunt SAPN, tillsätt 45 mikroliter av sex-helix bunt SAPN till en disponibel cuvette och placera cuvette i DLS-maskinen. Skapa sedan en ny mätfil och kör en förskriven standardprocedur för protein i 120-millimolar urea, 20-millimolar Tris och 5%glycerol buffert vid 25 grader Celsius.Starta sedan mätningen. Z-genomsnittets storlek, PDI: t och distributionsresultaten kommer att beräknas för varje körning. Maskinen kommer att läsa provet fem gånger.Detta fullt monterade sex-helix bunt SAPN är byggd på protein sekvenser som förutspås vikas in i en partikel som innehåller 60 kopior av monomer. Total cell lysate användes för att rena sex-helix bunt SAPN monomerer av FPLC med hjälp av en nickel kolumn, visar att proteinet elueras vid både 150 och 500-millimolar imidazole. Kromatogrammet visar också två andra toppar på 185 och 210 milliliter total volym som motsvarar isopropanol tvätt och imidazol-fri tvätt respektive.Fraktionerna och renheten hos det rekombinanta proteinet kunde identifieras genom gradient SDS-PAGE geler med det protein av intresse som primärt ligger i fraktion 68 till och med 79. Western blot analys med anti-Hans och anti-167D4 antikroppar visade att de poolade fraktioner var verkligen protein av intresse. Blottorna visade också närvaron av sex-helix bunt SAPN multimers.De prover som innehöll proteinmonomerer av intresse viktes in i den fullt monterade sex-helix bunt SAPN genom dialys och partikel storlek distribution bestämdes av DLS och nanopartikel spårning analys. Visualisering genom överföring elektronmikroskopi avslöjade välformade enskilda sex-helix bunt SAPN partiklar med storlek distribution erhålls från de två partikel dimensionering tekniker. Viktigaste steget i det här protokollet är återvikningen av sex-helix bunt SAPN.Den korrekta pH och joniska styrkan i refolding buffert är väsentliga. Med hjälp av en isopropanol tvätt under rening, kunde vi minska förorenande LPS till en mycket låg nivå. Dock kan LPS minskas ytterligare med hjälp av en anjonutbyte kolumn som behövs.Denna teknik kan enkelt anpassas för mänsklig tillämpning. En bakteriell-uttryckt SAPN har redan skalats upp för en kommande fas 1/2a malaria klinisk prövning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Termodynamik för membranprotein Folding Mätt fluorescensspektroskopi

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulering av Diblock polymera nanopartiklar genom Nanoprecipitation Teknik

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Odling av mänskliga neurala stamceller i en 3-dimensionell självorganiserande Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Analys av riktad virala protein Nanopartiklar levereras till HER2 + tumörer

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanopartiklar för regenerativ forskning

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Produktion av metall nanopartiklar genom pulserad laserablation i vätskor: Ett verktyg för att studera de antibakteriella egenskaperna hos nanopartiklar

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generiskt protokoll för optimering av heterologa proteinproduktion med hjälp av automatiserad Microbioreactor teknik

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Ytan funktionalisering av hepatit E Virus nanopartiklar med kemiska konjugation metoder

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Produktionen av Elastin-liknande Protein hydrogeler för inkapsling och immunfärgning av celler i 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...