Name: production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00
Duration: 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Bu çalışma Henry M Jackson Askeri Tıbbın İlerlemesi Vakfı, Inc. ve ABD Savunma Bakanlığı arasında yapılan bir işbirliği anlaşması (W81XWH-11-2-0174) tarafından desteklenmiştir. Anti-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV antikor NIH AIDS Reaktif Programı ile Dr Susan Zolla-Pazner alındı.

<ol>
	<li>Karch, C. P., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+technologies:+From+whole+organisms+to+rationally+designed+protein+assemblies.">Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies.</a> Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).</li><li>Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Immunologic+Properties+of+Soluble+Versus+Particulate+Antigens.">Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens.</a> Frontiers in Immunology. 9, 598 (2018).</li><li>Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+basis+for+enhanced+immunity+of+nanoparticle+vaccines.">Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).</li><li>Yeates, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Principles+for+Designing+Highly+Symmetric+Self-Assembling+Protein+Nanomaterials.">Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).</li><li>Marcandalli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Potent+Neutralizing+Antibody+Responses+by+a+Designed+Protein+Nanoparticle+Vaccine+for+Respiratory+Syncytial+Virus.">Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus.</a> Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).</li><li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decorating+Self-Assembled+Peptide+Cages+with+Proteins.">Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins.</a> ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).</li><li>Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembling+Protein+Nanoparticles:+implications+for+HIV-1+vaccine+development.">Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development.</a> Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).</li><li>Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+design+of+peptides+that+self-assemble+into+regular+polyhedral+nanoparticles).">Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles).</a> Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+displaying+HIV-1+Env+V1V2+loop+in+a+native-like+trimeric+conformation+as+vaccine+antigen.">Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen.</a> Nanomedicine. , (2018).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+P.+falciparum+specific+coiled-coil+domain+to+construct+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+to+prevent+malaria.">The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-adjuvanted+nanoparticle+based+vaccine+against+infectious+bronchitis+virus.">A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus.</a> PLoS One. 13 (9), e0203771 (2018).</li><li>Wahome, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+display+of+4E10+and+2F5+epitopes+on+self-assembling+protein+nanoparticles+as+a+potential+HIV+vaccine.">Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+novel+immunogenic+nanoparticle+platform+for+Toxoplasma+peptide+vaccine+in+HLA+transgenic+mice.">Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice.</a> Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonadjuvanted+polypeptide+nanoparticle+vaccine+confers+long-lasting+protection+against+rodent+malaria.">A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria.</a> Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibody+and+CD8++T-cell+responses+to+the+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+protein+induced+by+a+nanoparticle+vaccine.">Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine.</a> PLoS One. 7 (10), e48304 (2012).</li><li>Seth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+targeting+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+delivered+in+three+Army+Liposome+Formulation+adjuvants.">Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants.</a> Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).</li><li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+nanoparticles+with+built-in+flagellin+domains+increases+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+falciparum+based+vaccine.">Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine.</a> Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).</li><li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanovaccine+confers+robust+immunity+against+Toxoplasma.">Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma.</a> NPJ Vaccines. 2, 24 (2017).</li><li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+self-adjuvanted+protein+nanoparticles+provides+protection+against+lethal+influenza+challenge.">Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge.</a> Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).</li><li>Haynes, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-correlates+analysis+of+an+HIV-1+vaccine+efficacy+trial.">Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial.</a> New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).</li><li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand.">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).</li><li>O&#39; Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+gp120+V1V2+loop:+structure,+function+and+importance+for+vaccine+development.">The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development.</a> Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).</li><li>Babapoor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Vaccine+Using+Nanoparticle+Platform+to+Present+Immunogenic+M2e+against+Avian+Influenza+Infection.">A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection.</a> Influenza Research and Treatment. 2011, 126794 (2011).</li><li>Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+self-assembling+protein+nanoparticle+architectures+for+applications+in+vaccine+design.">Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design.</a> Royal Society Open Science. 4 (4), 161092 (2017).</li><li>Indelicato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+Governing+the+Self-Assembly+of+Coiled-Coil+Protein+Nanoparticles.">Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles.</a> Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).</li><li>Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+assemblies+and+their+biomedical+applications.">Nanoscale assemblies and their biomedical applications.</a> Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740 (2013).</li><li>Rey, F. A., Lok, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Features+of+Enveloped+Viruses+and+Implications+for+Immunogen+Design+for+Next-Generation+Vaccines.">Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines.</a> Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Endotoxins.">Bacterial Endotoxins.</a> United States Pharmacopeia (USP). , (2011).</li><li>. Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/media/76255/download">https://www.fda.gov/media/76255/download</a> (1993)</li></ol>

İfade edilen görüşler yazarların görüşleridir ve ABD Ordusu veya Savunma Bakanlığı'nın konumlarını temsil edecek şekilde yorumlanmamalıdır. Peter Burkhard Alpha-O Peptidler AG adlı şirket bir ilgi ve teknoloji patentleri vardır. Diğer yazarların bu yazıda sunulan konuyla ilgili mali çıkarları olan herhangi bir şirketle herhangi bir ilişkisi veya mali ilişkisi yoktur.

Nanoteknoloji, alt ünite aşısı gelişimi için birçok avantaj ve çözüm sağlar. Nanoaşılar art arda immünjenite artan konak bağışıklık sistemine partiküller olarak antijenler sunabilir26. Nanoaşılar birçok farklı türleri olmakla birlikte, biz de novo tasarlanmış protein oluşan olanlar aşıgelişimi1 için güçlü bir yaklaşım gibi görünüyor inanıyoruz. Onlar ev sahibi proteinler için herhangi bir dizi homoloji olmadan tasarlanmış olabilir ve düşük üretim maliyeti ve yüksek ürün verimleri sağlarken yerli gibi konformasyon yakın ilgi antijeni mevcut. Bu yaklaşımın en önemli örneklerinden biri, birden fazla bulaşıcı hastalığakarşı aşılara uyguladığımız SAPN teknolojisidir 7. HIV-1 aşı gelişimindeki güçlükleri ele almakiçin, V1V2 antijenini yerli benzeri trimerik konformasyon 9'da etkilibir şekilde sunmak için benzersiz bir SHB-SAPN çekirdeği tasarladık. Birçok aşı hedefleri, özellikle viral hastalıklar için, trimers27olarak mevcuttur. Bu fenomen, SAPN tasarımımızın alt birim aşılarının geliştirilmesi nde geniş etkileri olduğunu göstermektedir.
Bu yöntemde, E. coli ifade sisteminde SHB-SAPN'lerin nasıl üretilebildiğini gösteriyoruz. Biz protein yüksek verim (kültür yaklaşık 6 mg/100 mL) ifade etti. Protein 10 histidin içeriyordu ve Ni2+ sütunlu immobilize metal afinite kromatografisi kullanılarak kolayca saflaştırılmıştı. His-Tag bu uzunluğu en yüksek protein verimi için en uygun olduğu bulunmuştur. Saflaştırılmış protein, hem N-terminal HisTag hem de C terminali heptad tekrarının varlığıyla belirtildiği gibi tasarlanmış proteinin tam uzunlukta içeriyordu. Yaygın olarak kabul edilen tekniklerden yararlandık ve Bunları SHB-SAPN çekirdeğinin ifade, üretim ve karakterizasyonu için optimize ettik. Yeni bir protein epitopu içeren bir SAPN gelişimi sırasında tam uzunlukta protein üretimi eksikliği konak hücrede genin bir ekspresyon sorunu gösterebilir. Bu durumda, gen ve ifade sistemi yeniden tasarlanmalı ve açıklanan protokole uyarlanmalıdır. Sonication zaman veya yoğunluk modifikasyonu da öngörülen tam uzunlukta protein konsantrasyonu artırabilir.
Katlanmış parçacıklar dls ve nanopartikül izleme analizi tarafındanbelirlenen beklenen boyut aralığında (20 ila 100 nm) 8,24,25 idi. Bu sonuçlar TEM kullanılarak da teyit edilerek doğrulandı. Bu adımda sorunlar varsa, normalde yeniden katlanır arabelleğin pH veya iyonik gücü ile ilgili bir sorun nedeniyle. Parçacık boyutlandırma tekniklerinde büyük boyutlu parçacıklar tespit edildiğinde, yeniden katlanan arabelleğin pH'ını artırarak önlenebilecek bir toplamayı gösterir. Parçacıklar DLS tarafından tespit edilmezse, protein konsantrasyonu doğrulamak ve tampon pH kontrol edin. DLS için son protein konsantrasyonu en az 100 μg/mL olmalıdır. Konsantrasyon sorun değilse, pH azaltarak konsantrasyonu azaltılabilir küçük, eksik oluşan parçacıkların bolluğunu gösterir. Alternatif olarak, sodyum klorür konsantrasyonu istenmeyen boyutu ile parçacıkların varlığını en aza indirmek için optimum aralığına ayarlanabilir.
Son olarak, arınma sırasında bir izopropanol yıkama adımı kullanarak, enjektabl ürünler için 5 AB/kg vücut ağırlığı sınırının altında olan ev sahibi E. coli'den 0,01 AB/μg SAPN'e kadar kontamine LPS'yi azaltmayı başardık. 28. Bu düzey, Q sütunu olarak da bilinen bir aniyon değişim sütunu kullanılarak daha da azaltılabilir. Yüksek düzeyde endotoksin hala mevcutsa, tampon hazırlama için kullanılan tüm malzemeleri kontrol edin. Bu yöntemde sadece depyrogenated cam ve endotoksin ücretsiz plastik kullanmayı unutmayın.
Bu sonuçlar, klinik öncesi bağışıklama çalışmaları için kullanılabilecek SHB-SAPN çekirdeğini üretmek için başarılı bir yöntem geliştirdiğimizi göstermektedir. Sadece küçük değişiklikler ile bu yöntem, varsa, ilgi bir antijen eklendiğinde SHB-SAPNs saflaştırma uygulanabilir. Başlangıç noktası olarak bu yöntemi kullanarak önemli değişikliklerden biri elüsyon adımındadır. Farklı proteinler deneysel olarak belirlenmelidir farklı imidazol konsantrasyonlarında elute. Diğer önemli fark, yeniden katarabelleğin bileşimi olabilir. Optimizasyon farklı pH koşullarının yanı sıra iyonik güçlü yönlerini test gerektirir.
Gelecekteki çalışmalar göz önüne alındığında, SHB-SAPN'nin insan tarafından uygulanmasına izin vermek için yalnızca iki küçük değişiklik gereklidir. Birincisi, ekspresyon vektörü insanlarda ampisilin alerjisi nedeniyle bir kanamisin direnci seçilebilir marker değiştirilmesi gerekiyor29. İnsan kullanımı için protein üretiminin bir diğer önemli gereksinimi hayvansal ürün içermeyen ortamda SHB-SAPN üretmektir. Küçük ölçekli bir çalışma zaten bir bitki tabanlı medya protein makul bir verim gösterdi. Burada sunulan çalışma kolayca bir sıtma aşısı adayı, FMP01416ile gösterildiği gibi nihai GMP üretimi için ölçeklenebilir. Bu büyük ölçekli FMP014-SAPN üretimi, son üründeki LPS ve Ni2+ içeriğini daha da azaltmak için hem anyon değişimini hem de katyon değişim adımlarını içeriyordu. Bu bakteriyel ifade SAPN zaten yaklaşan bir Faz 1/2a klinik çalışma için ölçeklendirildi.

Geleneksel aşı geliştirme inaktive veya zayıflatılmış patojenler üzerinde duruldu iken, modern aşıların odakalt birim aşılar doğru kaymıştır 1. Bu yaklaşım daha hedefli bir yanıta ve potansiyel olarak daha etkili aşı adaylarına yol açabilir. Ancak, ana dezavantajlarından biri alt birim aşıları azaltılmış immünojenite neden olabilir bütün organizmalar gibi partiküller değildir2. Tekrarlayan bir antijen görüntü sistemi olarak bir nanopartikül hem hedeflenen alt birim aşı yaklaşımının yararları hem de tüm organizmanın partikül doğasıolabilir 1,3.
Nanoaşılar mevcut türleri arasında, rasyonel tasarlanmış protein derlemeleri tasarım ve antijen potansiyel bir yerli gibi konformasyon1,4 içinde antijen birden fazla kopyasını sunabilir aşı adaylarının geliştirilmesi için izin ,5,6. Bu protein derlemelerine bir örnek, kendi kendini biraraya getirenprotein nano tanecikleridir (SAPNs) 7. SAPN'ler bobin etki alanlarını temel alır ve geleneksel olarak Escherichia coli8ile ifade edilir. SAPN aşı adayları sıtma, SARS, grip, toksoplazmoz ve HIV-1 9,10,11,12,13 gibi çeşitli hastalıklar için geliştirilmiştir. , 14.000 , 15.000 , 16.02.20 , 17.000 , 18.000 , 19. Her SAPN adayının tasarımı ilgi patojenine özgüdür, ancak üretim, arınma ve yeniden katlama teknikleri genel olarak uygulanabilir.
Şu anki ilgi alanlarımızdan biri etkili bir HIV-1 aşısı. RV144-mütevazı etkinliğini gösteren bir HIV-1 aşısının sadece Faz III klinik çalışmada-enfeksiyon riskinin azalması igg antikorları ile zarfprotein20V1V2 döngüsü ile ilişkili oldu,21. Bu bölgenin yerli gibi trimerik sunumu koruyucu immünojenite için önemli olduğu düşünülmektedir22. V1V2 döngüyü mümkün olduğunca yerli-benzer konformasyona yakın olarak sunmak için, V1V2 halkasını doğru konformasyona sunmak için HIV-1 zarf füzyon sonrası altı sarlis demeti (SHB) içeren sapn aşı adayının bir kanıtı geliştirdik9 . Bu aday HIV-1 zarf protein bilinen monoklonal antikorlar tarafından kabul edildi. V1V2-SHB-SAPN ile aşılanmış fareler V1V2 spesifik antikorlar kaldırdı, en önemlisi, gp70 V1V2 bağlı,doğru konformasyonel epitops9 . SHB-SAPN çekirdeği, HIV-1 V1V2 döngüsü için taşıyıcı rolün ötesinde başka işlevlere de sahip olabilir. Burada, SHB-SAPN çekirdeğinin ifade edilmesi, saflaştırılması, yeniden katlanması ve doğrulanması için ayrıntılı bir metodoloji açıklıyoruz. Sıra seçimi, nanopartikül tasarımı, moleküler klonlama ve E. coli dönüşümü daha önce9tarif edilmiştir .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26181</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40ul Cuvette Pack of 100 with Stoppers</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &#181;l</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>4561093</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-6X His tag antibody [HIS.H8]</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab18184</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 gp41 Monoclonal (167-D IV)</td>
			<td>AIDS Reagent Repository</td>
			<td>11681</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT Substrate, Solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0302-01 &#160;</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-108</td>
			<td>A variety of sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 400 mesh, Copper approx. grid hole size: 42&#181;m</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>01754-F</td>
			<td>25 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare&#160;5 mL HisTrap HP Prepacked Columns</td>
			<td>GE HealthCare</td>
			<td>45-000-325</td>
			<td>5 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alkaline Phosphatase)</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab97020</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3196-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant NonFat Dry Milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1003</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetic-QCL Kinetic Chormogenic LAL Assay</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>50650U</td>
			<td>192 Test Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent Grade Multi-well Plates</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>25-340</td>
			<td>1 plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Media E. coli Expression Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K6803</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Millex Sterile Syringe 0.22 mm Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>250 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human IgG Fc-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>9040-04 &#160;</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C601003</td>
			<td>20 vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant,</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610363</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 12 mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66810</td>
			<td>8 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP329-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Biosynth International</td>
			<td>C-1818</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate, Reagent, A.C.S</td>
			<td>Electron Micoscopy Services</td>
			<td>541-09-3</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP169-500</td>
			<td>2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>pack of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromLab Software ver 4</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12009390</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch 2 Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F14-14 x 50cy Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>096-145075</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708270</td>
			<td>Gel Imager for Stain free Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>1400</td>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>For Protein Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software NTA</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1282-0000</td>
			<td>Incubator/Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGC Quest 10 Chromatography System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7880001</td>
			<td>FPLC to aid in protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella, INC</td>
			<td>91000S</td>
			<td>To clean grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Universal Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>To run gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker Shaker</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF5536A</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifer 450</td>
			<td>Branson</td>
			<td>also known as 096-145075&#160;</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75-006-580</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer Packs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704158</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>For Western</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>EF3030A</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Particle Sizing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of e. coli-expressed self-assembling protein nanoparticles for vaccines requiring trimeric epitope presentation

Kendi kendine biraraya gelen protein nano partikülleri (SAPN'ler) tekrarlayan antijen görüntüler olarak işlev görür ve farklı bulaşıcı hastalıklar için çok çeşitli aşılar geliştirmek için kullanılabilir. Bu makalede, trimerik bir konformasyonda antijenleri sunabilen altı sarli stok (SHB) bir montaj içeren bir SAPN çekirdeği üretmek için bir yöntem gösterin. SHB-SAPN ifadesini bir E. coli sisteminde ve gerekli protein arıtma adımlarında tanımlıyoruz. Biz artık bakteriyel lipopolisakkarit azaltmak için bir izopropanol yıkama adımı dahil. Protein kimliğinin ve saflığın bir göstergesi olarak, protein Batı leke analizlerinde bilinen monoklonal antikorlarla reaksiyona girer. Yeniden katlamadan sonra, parçacıkların boyutu beklenen aralıkta (20 ila 100 nm) düştü, dinamik ışık saçılma, nanopartikül izleme analizi ve iletim elektron mikroskopisi ile doğrulandı. Burada açıklanan metodoloji SHB-SAPN için optimize edilse de, diğer SAPN yapıları için yalnızca küçük değişiklikler uygulanabilir. Bu yöntem aynı zamanda kolayca insan aşıları için GMP üretimi için büyük ölçekli üretim aktarılabilir.

Burada tam olarak birleştirilmiş SHB-SAPN, monomerin 60 kopyasını içeren bir parçacık halinde katlanması öngörülen protein dizileri (Şekil1A)üzerine inşa edilmiştir (Şekil 1B). Şekil 2, SHB-SAPN çekirdeğinin üretimi, saflaştırılması ve tanımlanması için yöntemin ana hatlarını sağlar. SHB-SAPN çekirdeğinin gen dizilimi olan bir gliserol stoğundan e. coli BL21 (DE3) E. coli indüklendi. Bakteri hücreleri başarılı bir şekilde büyütüldü ve denatüre ve azaltıcı koşullar altında lized edildi.
SHB-SAPN monomerlerinin Ni2+ kolon (Şekil3A)kullanılarak FPLC ile arındırMak için toplam hücre lisate kullanılmıştır. FPLC kromatografisi proteinin hem 150 mM hem de 500 mM imidazol (Şekil3A)olarak eluted olduğunu göstermektedir. Kromatogram da sırasıyla, isopropanol yıkama ve imidazol içermeyen yıkama karşılık gelen 185 mL ve 210 mL toplam hacmi diğer iki zirveleri gösterir. Rekombinant proteinin fraksiyonları ve saflığı gradyan SDS-PAGE jelleri ile tanımlanmıştir (Şekil3B). İlgi proteini öncelikle 68\u201279 (278\u2012300 mL toplam hacim) kesirlerinde yer aldı. Bu kesirler daha fazla analiz için birleştirildi. Antik-His antikor (N-terminal) ve 167-D-IV antikor (C-terminus) ile Batı leke biraraya kesirler gerçekten ilgi proteini olduğunu belirtti (Şekil4A,B). Bu lekeler aynı zamanda SHB-SAPN multimerlerinin varlığını da göstermiştir. Daha önceki yıkar ve elüsyon fraksiyonları çok merized protein daha yüksek bir konsantrasyon içeren eğilimindedir ve bu nedenle dışlandı.
İlgi protein monomerleri içeren örnekler diyaliz ile tam olarak monte edilmiş SHB-SAPN içine katlandı. Partikül boyutu dağılımı DLS ve nanopartikül izleme analizi (Şekil5A,B)ile belirlendi. DLS, Z ortalama hidrodinamik çapı 67 nm iken NTA sistemi ortalama 81 nm boyutu ölçülen parçacıkları tanımladı. Hafif boyut farklılıkları parçacık boyutlandırma teknikleri nedeniyle, ancak her iki analizden boyutu 20\u2012100 nm8,24,25beklenen aralığında idi . SHB-SAPN'ler TEM tarafından görselleştirildi ve iki parçacık boyutlandırma tekniğinden elde edilen boyut dağılımı ile iyi biçimlendirilmiş bireysel parçacıklar görüldü (Şekil5C).
Proteinin saflaştırılması sırasında, son SHB-SAPN ürünündeki LPS kontaminasyonunu azaltmak için kolon izopropanol ile yıkandı. Endotoksin düzeyinin bağışıklama için kabul edilebilir olup olmadığını doğrulamak için, shb-SAPN örneklerinde LPS konsantrasyonu isopropanol yıkama adımı ile veya olmadan saflaştırılmış bir kinetik LAL tözü ile belirlendi. Sonuçlar, isopropanol yıkamanın endotoksin düzeylerini >0.25 AB/μg'den 0.010 EU/μg'ye düşürttettiğini göstermiştir (Tablo1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> Şekil 1: SHB-SAPN protein dizisi ve yapısı. (A) SHB-SAPN monomeramino asit dizisi. (B) 60 protein monomerden oluşan tam birleştirilmiş SHB-SAPN çekirdeğinin yapısının bilgisayar modeli. Amino asit dizileri için renk düzeni: Gri = HisTag; Yeşil = pentamer; Koyu mavi = de novo tasarlanmış düzeltici; Açık mavi = altı sarlis demeti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> Şekil 2: Akış şeması SHB-SAPN üretimi içinprotokol. Renk düzeni: Siyah = E. coliprotein monomer ifadesi ; Koyu gri = monomer arınma; Orta gri = monomer tanımlama; Açık gri = yeniden katlama ve karakterizasyon; White = tam olarak monte edilmiş SHB-SAPN ürünü. Koyu ve orta gri ile etiketlenmiş adımlarda, protein denatüre ve azaltıcı koşullar altındadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> Şekil 3: SHB-SAPN monomerlerinin protein saflaştırılması. (A) FPLC arıtma kromatograf. Kromatogramın üzerindeki yeşil çizgi arınma adımlarını gösterir. Kromatogramdaki mavi çizgi, 280 nm dalga boyundakların optik yoğunluğunu temsil eder. Siyah çizgi, arınmanın her aşamasında kullanılan tampon B (8 M üre, 20 mM Tris, 50 mM sodyum fosfat monobasic, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazol, pH 8.5) yüzde sinin kullanıldığını gösterir. (B) Lysate (L), flow through (FT), first wash (W1), isopropanol yıkama (W2), üçüncü yıkama (W3) ve 150 mM imidazol (E150) ve 500 mM imidazol (E500) elüsi basamaklarından ayrı kesirlerden oluşan SDS-PAGE jelleri Arıtma. Birinci şeritteki (M) moleküler belirteçler 10 ile 250 kDa arasındaki bantları tanımlar. Hedef protein siyah bir ok ile gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> Şekil 4: Proteinin batı lekesi ile tanımlanması. Tüm şeritler 100 ng proteinle dolu. (A) Anti-6x HisTag ile batı leke sonuçları. (B) 167-D-IV HIV-1 monoklonal antikor ile batı leke sonuçları. Şeritler şöyle etiketlenir: M = molekül ağırlık belirteci; 1 = lysate; 2 = Akış yoluyla; 3 = ilk yıkama; 4 = isopropanol yıkama (ikinci yıkama); 5 = üçüncü yıkama; 6 = havuzlu hacim kesirleri 56\u201261 (ilk elution peak), 7 = havuzlu hacim hizipleri 62\u201267 (iki tepe arasında), 8 = havuza hacim kesirleri 68\u201278 (ikinci elution tepe). Monomerik SHB-SAPN bandı olarak beklenen bant boyutu 18.07 kDa olan hedef protein siyah bir ok ile gösterilir. 7 ve 8 şeritli ekstra bantlama, SHB-SAPN'nin (kırmızı ok) dimers' i ve çok merhemleridir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> Şekil 5: Katlanmış SHB-SAPN'nin karakterizasyonu. (A). DLS tarafından belirlenen parçacık boyutu dağılımı. (B) Parçacık boyutu nanopartikül izleme (sistem) tarafından belirlenir. (C) SHB-SAPN partiküllerinin TEM tarafından görüntülenmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Örnek</td>
			<td>Endotoksin (AB/mL)</td>
			<td>Endotoksin (AB/protein)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isopropanol Yıkama ile SAPN</td>
			<td>2.02</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>İzopropanol Yıkama olmadan SAPN</td>
			<td>>50</td>
			<td>>0,25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Negatif Kontrol</td>
			<td>Algılama seviyesinin altında</td>
			<td>Yok</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Katlanmış SHB-SAPN'lerin endotoksin düzeyleri. İzopropanol yıkama lı veya onsuz saflaştırılan SHB-SAPN örneklerinde endotoksin düzeyleri hem endotoksin üniteleri/mL hem de SHB-SAPN proteininin endotoksin üniteleri/μg'si olarak sunulmuştur.

Watch this Scientific Journal Video about Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation at JoVE.com

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Aşı geliştirmede kullanılmak üzere kendi kendine biraraya gelen protein nano taneciklerinin (SAPN' ler) saflaştırılmasını, yeniden katlanması ve karakterizasyonu nun tanımlanmasını açıklayan ayrıntılı bir yöntem burada verilmiştir.

Trimerik Epitop Sunumu Gerektiren Aşılar için E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nano tanecikleri Üretimi

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Kendi kendine biraraya gelen protein nano tanecikleri veya SAPN'ler, çeşitli bulaşıcı hastalıklara karşı aşıgeliştirmek için kullanılabilir. Burada tanımladığımız bu yöntem, altı sarli sayılslı bir paket içeren SAPN'leri arındırmak, yeniden katlamak ve karakterize etmek için kullanılabilir. Bu nanopartikül, trimerik antijenleri yerli benzeri bir konformasyonda sunabilir.Hafif değişiklikler ile, bu yöntem diğer yenilikçi SAPN aşı yapıları uygulanabilir. Ayrıca, klinik çalışmalar için büyük ölçekli üretime kolayca aktarılabilir. Altı sarkaçlı demet SAPN ifade hasat E.coli lizis için, sonication dört saniye ve dinlenme altı saniye ile 150 watt sonication çıkış ile bir sonda kullanın, beş dakika boyunca buz üzerinde imidazol içermeyen tampon 40 mililitre resuspended bakteriyel pelet sonicate.Santrifüj hücresel lysate netleştirilmiş bir supernatant oluşturmak ve steril bir 150 mililitrelik şişe süpernatant transfer. Daha sonra, taze imidazol içermeyen tampon ile 100 mililitre lik son bir hacme kadar numuneyi getirin. İlgi çekici proteini izole etmek için FPLC yazılımını açın ve Yeni Yöntem seçeneğini tıklayın.Yöntem Ayarları menüsünde Sütun Konumu açılır menüsünü açın ve C1 Port 3'ünü seçin. Gösterilen Teknik açılır menüsünde Affinity'yi seçin. Sütun Türü açılır menüsünde Diğerleri, HisTrap HP ve beş mililitreyi seçin.Sütun Hacmi ve Basınç kutuları otomatik olarak uygun değerlere ayarlanır. Faz Kitaplığı menüsünü kapatmadan önce Aşama Kitaplığı açılır menüsünden Yöntem Anahattı'nı tıklatın ve Equilibration ve Sample Application düğmelerini, üç Sütun Yıkama düğmesini ve Faz Kitaplığı açılır menüsünden Elution düğmesini sürükleyin. Equilibration'ı tıklatın ve tabloda listelenen değerleri Başlangıç Arabelleği B, %4 Nihai Arabellek B, %4 ve Sütun Hacmi, beş olarak ayarlayın.Örnek Uygulama'yı tıklatın. Örnek Yükleme kutusunda, Örnek Pompalı Sütundaki Örnek Enjekte için radyo düğmesini tıklayın ve Yöntem Ayarlarından Kullanım Akış Hızı'nın yanındaki kutunun Sistem Pompası kutusuyla Örnek Enjeksiyon'da işaretlendiğini onaylayın. Birim kutusu değerini 100 mililitre ve Kesir Toplama Düzenini Etkinleştirme olarak değiştirin.Yöntem Ayarları kutusundan Kesir Boyutunu Kullan'a tıklayın ve Kesir Boyutunu dört mililitreye değiştirin. İlk Sütun Yıkama düğmesine tıklayın, tabloda listelenen değerleri Başlangıç Arabellek B, %4 Nihai Arabellek B, %4 ve Sütun Hacmi, 10 olarak ayarlayın. Kesir Toplama Düzeni Etkinleştir kutusunu tıklatın ve Yöntem Ayarlarından Kesir Boyutunu Kullan'a tıklayın.Kesir Boyutunu dört mililitreye değiştirin ve ikinci Sütun Yıka düğmesini tıklatın. Tablodaki değerleri Başlangıç Arabellek B, %0 Son Arabellek B, %0 ve Sütun Hacmi, beş olarak ayarlayın. Kesir Toplama Düzeni Etkinleştir kutusunu tıklatın ve Yöntem Ayarlarından Kesir Boyutunu Kullan'a tıklayın.Kesir Boyutunu dört mililitreye değiştirin ve üçüncü Sütun Yıl düğmesini tıklatın. Tablodaki değerleri Başlangıç Arabellek B, %0 Son Arabellek B, %0 ve Sütun Hacmi, 10 olarak ayarlayın. Kesir Toplama Düzeni Etkinleştir düğmesini tıklatın ve Yöntem Ayarları kutusundan Kesir Boyutunu Kullan'a tıklayın.Daha sonra, Kesir Boyutunu dört mililitreye değiştirin. Elution butonuna tıklayın ve tablodaki bilgileri sağ tıklatın. Açılan menüde, Adım Sil'i tıklatın ve iki giriş olması için Izokratik gradyan düğmesini iki kez tabloya sürükleyin.İlk Arabellek B, %30 Son Arabellek B, %30 ve Sütun Hacmi, 10'a ilk girişin değerini ayarlayın. İlk Arabellek B,%100 Son Arabellek B, %100 ve Sütun Hacmi, 10'a ikinci girişin değerini ayarlayın. Kesir Toplama Düzeni Etkinleştir düğmesini tıklatın ve Yöntem Ayarları kutusundan Kesir Boyutunu Kullan'ı tıklatın.Ardından, Farklı Kaydet'i tıklatın ve dosya temizlemeyi adlandırın. Pompa imidazol içermeyen yıkama tampon içine FPLC bir tüp yerleştirin, ve 500-milimolar imidazol tampon içine pompa B boru. Numune pompa borularını 100 mililitrelik numuneye yerleştirin ve arıtma programını çalıştırın.% 60 izopropanol yıkama gerektiğinde, programı duraklatmak, % 60 izopropanol yıkama içine imidazol içermeyen yıkama pompa bir tüp hareket ve programı yeniden başlatın. Yıkama sonunda, programı tekrar duraklatın, pompa imidazol içermeyen yıkama tampon bir tüp dönmek ve arıtma programı yeniden başlatın. Saflaştırılmış proteinin saflığını değerlendirmek için, önce akıştan kesirleri birleştirin, birini yıkayın, iki tane yıkayın ve tek tek 50 mililitrelik konik tüplerde üç adımyı yıkayın.Daha sonra, her numune tüpünden 15 mikrolitre ile 15 mikrolitre 2X Laemmli tamponu tek tek 0,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde karıştırın ve numuneleri 10 dakika boyunca 95 derecede denatüre edin. Kuluçka sonunda, Tris-Glycine SDS-PAGE çalışan tampon üç lekesiz dört ila% 20 prekast poliakrilamid jelleri ile bir jel çalışan cihaz kurmak. Her jelin ilk kuyusuna sekiz mikrolitre molekül ağırlık belirteci ve diğer kuyulara 30 mikrolitre denatüre numune yükleyin.Boya ön jelin altına çarpana kadar 200 volt jelleri çalıştırın ve lekesiz görüntüleme sistemi ile hemen görüntüleme den önce jelleri deiyonize suyla kısa bir süre durulayın. Daha sonra, doğru boyutta protein bantları içeren kesirleri belirleyin ve bu kesirleri birleştirin. Altı sarkaçlı paket SAPN yeniden katlama için, 10 kilodalton moleküler ağırlık kesme diyaliz kaseti havuzlu protein 10 ila 20 mililitre ekleyin.Diyaliz sekiz azı üre kaset, 20-milimolar Tris, 5%gliserol, ve oda sıcaklığında beş milimolar TCEP gece oda sıcaklığında. Ertesi sabah, diyaliz tamponunda üre konsantrasyonunu adım adım iki azı her iki saatte bir azaltarak üreyi yavaşça numuneden uzaklaştırın. Üre konsantrasyonu iki azı yağı ulaştığında, diyaliz cihazını dört santigrat dereceye taşıyın ve numuneyi 120 milimolar üre, 20 milimolar Tris ve %5 gliserol bir gecede yeniden katlamayı tamamlamak için diyalize alın.Ertesi sabah, kasetten katlanmış proteini çıkarın ve altı sarlis demeti SAPN'i 0,22 mikrometrelik poliviniliden florür şırınga filtresinden filtreleyin. Altı sarlis demeti SAPN'in ortalama parçacık boyutunu ölçmek için, tek kullanımlık bir cuvette'ye 45 mikrolitre altı sarli sifonlu sapn ekleyin ve cuvette'yi DLS makinesine yerleştirin. Sonra, yeni bir ölçüm dosyası oluşturmak ve 120-milimolar üre protein için önceden yazılmış standart işletim prosedürü çalıştırmak, 20-milimolar Tris, ve 5% gliserol tampon 25 santigrat derece.Sonra, ölçüm e başlayın. Z ortalaması boyutu, PDI ve dağıtım sonuçları her çalıştırma için hesaplanır. Makine örneği beş kez okuyacak.Bu tamamen birleştirilmiş altı sarkaçlı demet SAPN, monomerin 60 kopyasını içeren bir parçacık halinde katlanması öngörülen protein dizileri üzerine kurulmuştur. Altı sarlis demeti SAPN monomerlerinin nikel kolon kullanılarak FPLC ile arındırMak için toplam hücre lisatı kullanıldı ve proteinin hem 150 hem de 500 milimolar imidazole eluted olduğunu gösterdi. Kromatogram da sırasıyla isopropanol yıkama ve imidazol içermeyen yıkama karşılık gelen 185 ve 210 mililitre toplam hacmi diğer iki zirveleri gösterir.Rekombinant proteinin fraksiyonları ve saflığı, öncelikle 68'den 79'a kadar olan kısmıbulunan ilgi proteini ile degrade SDS-PAGE jelleri ile tanımlanabilir. Anti-His ve anti-167D4 antikorları ile Batı leke analizi havuzlu fraksiyonları gerçekten ilgi protein olduğunu gösterdi. Lekeler ayrıca altı sarlis demeti SAPN multimers varlığını gösterdi.İlgiprotein monomerleri içeren numuneler diyaliz ile tam biraraya getirilmiş altı sarmallı demet SAPN içine katlandı ve parçacık boyutu dağılımı DLS ve nanopartikül izleme analizi ile belirlendi. İletim elektron mikroskobu ile görselleştirme, iki parçacık boyutlandırma tekniğinden elde edilen boyut dağılımı ile iyi biçimlendirilmiş bireysel altı sarmallı sapn parçacıkları ortaya çıkardı. Bu protokoldeki en önemli adım, altı sarlis demeti SAPN'in yeniden katlamasıdır.Yeniden katlanır arabelleğin doğru pH ve iyonik mukavemeti esastır. Arınma sırasında izopropanol yıkama kullanarak, çok düşük bir seviyeye kirletici LPS azaltmak başardık. Ancak, LPS gerektiğinde bir aniyon değişim sütunu kullanılarak daha da azaltılabilir.Bu teknoloji insan uygulaması için kolayca adapte edilebilir. Bakteriyel ifade edilmiş bir SAPN zaten yaklaşan bir faz 1/2a sıtma klinik deneme için ölçeklendirildi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanoprecipitation Tekniği Diblock Polimerik Nanopartiküller formülasyonu

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Hedefli Viral Protein analizi HER2 + tümörler için teslim Nanopartiküller

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Rejeneratif Araştırma harmonik nanopartiküller

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Sıvılardaki Darbeli Lazer-Ablasyonuyla Metal Nanopartikül Üretimi: Nanopartiküllerin Antibakteriyel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Alet

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Otomatik Microbioreactor teknolojisini kullanarak Contegra Protein üretim duruma getirilmesi için genel iletişim kuralı

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...