Name: immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation i Kina (81673247 & 81872682) og australsk-Kina Collaborative tilskud (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).

Alle de emner, der indgår i protokollen er blevet godkendt af den etiske komité af Capital Medical University, Beijing, Kina12. Et skriftligt informeret samtykke blev indhentet fra hvert emne i undersøgelsens begyndelse.
1. IgG isolation
<ol><li>Klargør kemikalierne, herunder bindings buffer (fosfat bufferet saltvand, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutraliserende buffer: 10x PBS (pH = 6.6-6.8), eluent: 0,1 M myresyre (pH = 2,5), neutraliserende opløsning til eluent: 1...

<ol>
	<li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomics,+glycoproteomics+and+the+immune+system.">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).</li><li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics.">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li><li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Glycosylation+and+Inflammation.">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392 (2013).</li><li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases.">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65 (2018).</li><li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research.">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).</li><li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated,+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform.">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).</li><li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages.">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).</li><li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index.">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia.">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).</li><li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations.">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension:+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study.">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G.">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).</li><li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson's+disease.">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).</li><li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation.">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).</li><li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations.">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).</li><li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography.">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).</li><li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types.">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963 (2016).</li></ol>

Uplc fungerer som en relativ kvantitativ analysemetode5,15. Resultaterne indikerer, at UPLC er en stabil detekterings teknologi med god reproducerbarhed og relativ kvantitativ nøjagtighed. Mængden af glycaner i hver spids udtrykkes som en procentdel af det samlede integrerede område ved hjælp af UPLC, som er den relative værdi. Den relative kvantificering forbedrer sammenligneligheden af testprøverne. Derudover bruges 96 brønd protein G plader til at rense...

N-glykosylering af humane proteiner er en fælles og vigtig post-translationel modifikation1 og kan hjælpe med at forudsige forekomsten og udviklingen af sygdomme relativt nøjagtigt. På grund af kompleksiteten af sin struktur, forventes det, at der er mere end 5.000 Les strukturer, giver stort potentiale som diagnostiske og forudsigende biomarkører for sygdomme2. N-glycans knyttet til immunglobulin G (IgG) har vist sig at være afgørende for igg's funktion, og IgG N-glykosylation deltager i balancen mellem Pro-og anti-inflammatoriske systemer3. Differential IgG N-glykosylering er involveret i sygdomsudvikling og progression, der repræsenterer både en disposition og funktionelle mekanisme involveret i sygdoms patologi. Den inflammatoriske rolle IgG N-glykosylation har været forbundet med aldring, inflammatoriske sygdomme, autoimmune sygdomme, og kræft4.
Med udviklingen af detekterings teknologi, er følgende metoder mest udbredte i høj gennemløb Glycomics: hydrofile Interaction kromatografi (HILIC) ultra-performance væskekromatografi med fluorescens detektion (UPLC-FLR), multiplex kapillar gel elektroforese med Laser induceret fluorescens detektion (xCGE-LIF), matrix-assisteret Laser Desorption/ionisering tid-of-Flight massespektrometri (MALDI-TOF-MS), og væskekromatografi elektro spray massespektrometri (LC-ESI-MS) . Disse metoder har overvundet tidligere mangler af lav flux, ustabile resultater, og dårlig følsomhed specificitet5,6.
Uplc er almindeligt anvendt til at udforske sammenslutningen mellem IgG N-glykosylering og visse sygdomme (dvs. aldrende7, fedme8, dyslipidæmi9, type II diabetes10, hypertension11, iskæmisk slagtilfælde12, og Parkinsons sygdom13). Sammenlignet med de andre tre ovennævnte metoder har uplc følgende fordele:5,14. For det første giver det en relativ kvantitativ analysemetode, og den dataanalyse, der involverer total område normalisering forbedrer sammenligneligheden af hver prøve. For det andet er udgifterne til udstyr og nødvendig ekspertise relativt lave, hvilket gør det lettere at implementere og omdanne glykosylations biomarkører til kliniske anvendelser. Præsenteret her er en introduktion til UPLC, så det kan være mere almindeligt anvendt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-aminobenzamide, 2-AB</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well collection plate</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plate</td>
			<td>Pol</td>
			<td>0.45 um GHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well monolithic plate</td>
			<td>BIA Separations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate rotor</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant shaking incubator/rocker</td>
			<td>Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China</td>
			<td>ZWY-10313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>BEH column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric ovens</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>202-2AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empower 3.0</td>
			<td>Waters technology Co., Ltd, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoProfile 2-AB Labeling kit</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerator</td>
			<td>Qingdao Haier Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold 96-well plate</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q pure water meter</td>
			<td>Millipore Co., Ltd, America</td>
			<td>Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH tester</td>
			<td>Sartorius Co., Ltd, Germany</td>
			<td>PB-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>4672100, 0.5-10&#956;l &#38; 10-100&#956;l &#38; 20-200&#956;l &#38; 1000&#956;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td>
			<td>B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer liquid gun</td>
			<td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>4672100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low temperature refrigerator</td>
			<td>Thermo Co., Ltd, America</td>
			<td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-performance liquid chromatography</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>Acquity MLtraPerformance LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>725000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volatilizing machine/Dryer</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>NP-30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-bath</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>DK-98-IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>MP200B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography

Glycomics er en ny subspecialitet i omik system Research, der giver betydelige muligheder for at opdage næste generations biomarkører for sygdoms følsomhed, Drug Target Discovery, og Precision Medicine. Alternative IgG N-glycaner er blevet rapporteret i flere almindeligt forekommende kroniske sygdomme og foreslog at have et stort potentiale i kliniske anvendelser (dvs. biomarkører til diagnosticering og forudsigelse af sygdomme). IgG N-glycans er bredt karakteriseret ved hjælp af metoden til hydrofile interaktion kromatografi (hilic) ultra-performance væskekromatografi (uplc). UPLC er en stabil detekterings teknologi med god reproducerbarhed og høj relativ kvantitativ nøjagtighed. Desuden er strukturen af IgG N-Les klart adskilt, og Les sammensætning og relativ overflod i plasma er karakteriseret.

Som vist i figur 1blev IgG N-glycans analyseret i 24 indledende IgG Les toppe (GPS) baseret på Peak position og retentionstiden. N-glycan-strukturerne er tilgængelige gennem massespektrometri-detektion i henhold til en tidligere undersøgelse (tabel 1)15. For at sikre, at resultaterne var sammenlignelige, blev det samlede areal normalisering anvendt, hvor mængden af glycaner i hver spids blev udtry...

Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Immunglobulin G (IgG) N-glycan er karakteriseret ved anvendelse af hydrofile interaktions KROMATOGRAFI uplc. Desuden er strukturen af IgG N-glycan klart adskilt. Præsenteret her er en introduktion til denne eksperimentelle metode, så det kan være meget udbredt i forskning indstillinger.

Immunglobulin G N-glycan-analyse ved ultra-præstations væskekromatografi

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Ultra-performance flydende kromatografi er etableret teknologi til nøjagtig analyse af IgG n-glycan På grund af sin følsomhed synes at være, og det har evnen til at give en specifik information om glycan Denne metode er nem at bruge og har antal forskellige relativt lave omkostninger til stigninger, høj reproducerbarhed Evnen til glycan isomerer. Målinger af protein i plasma kan være attraktive. inden for medicin.også forbundet med IgG i glycose base og sådan og biologisk indeholdende befolkningen. Du ved, at af urene tilstand bruges til at teste IgG i glycaner. Faktisk kan det teste n-glycaner af protein.Dette er nødvendigt i et tværbundet protein af to rene tilstand kan anvendes på Protein OR eksperimentelle proces er relativt enkel, mens den eksperimentelle proces skal standardiseres. Den end-to-end eksperimentelle proces tager tre dage at operere, og de eksperimentelle skridt skal huskes for at mestre de eksperimentelle færdigheder. For at forberede prøverne skal den frosne plasmaprøve optøes.Derefter centrifuge på 80 gange G i 10 minutter. Lad proteinet G monolitisk plade ved stuetemperatur i 30 minutter. Overfør 100 mikrometer prøve i hver brønd af den to milliliteropsamlingsplade.Tilsæt ultra rent vand som en kontrolprøve. Prøverne fortyndes med et X PBS med et til syv volumenprocentforhold. Rengør en 0,45 mikron hydrofil polypropolen filterplade med 200 mikroliter ultra rent vand.Gentag rengøringen yderligere to gange. De fortyndede prøver overføres til filterpladen, og prøverne filtreres ind i den kollektive plade ved hjælp af en vakuumpumpe med tryk ved 266,6 til 399,9 Pascal. For at forberede proteinet G monolitiske plader skal du først kassere opbevaringsbufferen.De monolitiske plader rengøres med to milliliter ultra rent vand, to milliliter en X PBS, en milliliter 0,17 kindtandmætomsyre, to milliliter 10 X PBS og to milliliter en X PBS sekventielt. Fjern følgende væske ved hjælp af en vakuumpumpe. Ved hjælp af en multikanalrør overføres de filtrerede prøver til proteinet G monolitisk plade til IgG-binding og rengøring.Derefter tilsættes to milliliter en X PBS for at rengøre de monolitiske plader. Fjern PBS med en vakuumpumpe, og gentag rengøringen to gange. Illute IgG med en milliliter 0,17 kindtandmædersyre, og filtrer prøverne ind i opsamlingspladen med vakuumpumpe.Derefter tilsættes 170 mikroliter af en molære ammoniumbikarbonat i opsamlingspladen. IgG-koncentrationen skal registreres ved hjælp af et absorptionsspektropetometer ved den optimale bølgelængde på 280 nanometer. Placer den ekstraherede IgG i en ovn til tørre ved 60 grader Celsius i tre timer.Bestemme mængden, der skal observeres i henhold til dens koncentration som beskrevet i manuskriptet, og bevare det i minus 80 grader Celsius. Saml den tørrede IgG, og gemme kemikalier, herunder 1.33% SDS, fire procent IgePal og 5% PBS ved stuetemperatur. Forbered indoglycosidase F enzym ved at fortynde 250 enheder af enzym med 250 mikroliter af ultra rent vand.At protese IgG, tilføje 30 mikroliter af 1,33% SDS og blandes ved vortexing. Overfør prøven i en 65 grader Celsius ovn i 10 minutter. Derefter skal du fjerne det fra ovnen, og lad det køle af i 15 minutter.Tilføj 10 mikroliter på fire procent IgePal i samme prøve, og læg den på en rystende inkubator i fem minutter. Der tilsættes 20 mikroliter på fem X PBS og 30 til 35 mikroliter 0,1 molarnatriumhydroxid for at regulere pH til 8,0, og blandes ved vortexing. Tilføj fire mikroliter af endoglycosidase F enzym, og bland ved vortexing.Derefter inkuberes i 18 til 20 timer i et 37 grader Celsius vandbad. Den næste dag, placere de frigivne gylcans i en ovn ved 60 grader Celsius til tørre i to og en halv til tre timer. Gem frigivelseglykanerne på minus 80 grader Celsius indtil videre måling.Forbered de to aminobeniamid mærkning reagens med 24,5 mikroliter af DMSO, 10.5 mikroliter eddikesyre, 0.7 milligram af to amino benzimid, og seks milligram natrium cyanoborohydrid. Dernæst i et mørkt rum, mærke glycanerne ved at tilføje 35 mikroliter af to aminobensmørd mærkning reagens. Overfør de mærkede glcans til en oscillator i fem minutter, og derefter overføre den til ovnen i tre timer ved 65 grader Celsius.Derefter overføres den til stuetemperatur i 30 minutter. IgG n-glycase, vil vi mærke det med for at blive opdaget af fluorescerende opdage af urene tilstand. Forbehandle en 0,2 mikron GHP filterplade med 200 mikroliter af 70% ethanol, 200 mikroliter ultra rent vand, og 200 mikroliter af 96% aceto nitril ved fire grader Celsius.Fjern derefter affaldet ved hjælp af en vakuumpumpe. For at rense de to aminobensmamid mærket glycaner, tilsættes 700 mikroliter af 100%acetonitril til prøven, og overføre det til en rystende inkubator i fem minutter. Centrifuge ved 134 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius.Overfør supernatenten til en 0,2 mikron GHP filterplade i to minutter, og fjern filtratet ved hjælp af vakuum. Vask de to aminobensmamid mærket glycan med 200 mikroliter på 96%acetonitril ved fire grader Celsius, og fjern filtratet ved hjælp af en vakuumpumpe fem til seks gange. Illute to aminobensmamid mærket glycan med 100 mikroliter ultra rent vand tre gange.Overfør de to aminobensmerede glycaner i en ovn for at tørre ved 60 grader Celsius i tre en halv time. Gem de mærkede n-glycaner ved minus 80 grader Celsius indtil videre måling. Først skal du åbne softwaren for at styre de mobile faser.UPLC-instrumenter vaskes med 50% opløsningsmiddel B og 50% opløsningsmiddel C ved strømningshastigheden på 0,2 milliliter pr. minut i 30 minutter. Derefter vaskes med 25% opløsningsmiddel A og 75% opløsningsmiddel B ved en strømningshastighed på 0,2 milliliter i minuttet i 20 minutter. Tilføj derefter en strømningshastighed på 0,4 milliliter pr. minut.De mærkede n-glycaner opløses med 25 mikroliter af en blanding af 100%acetonitril og ultra rent vand ved et forhold mellem to og et volumen. Derefter centrifuge ved 134 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius, og brug et tørt rør til at indlæse 10 mikroliter af supernatenten i UPLC instrumenter. De mærkede n-glycaner adskilles ved en strømningshastighed på 0,4 milliliter pr. minut med en lineær gradient på 75% til 62%acetonitril i 25 minutter.Derefter udføre en analytisk køre af Dexteran kalibrering stigen glycopeptid kolonne på en UPLC ved 60 grader Celsius. Detekter n-glycan-lysstofrør ved X-citation og emissionsbølgelængder på henholdsvis 330 nanometer og 420 nanometer. Som vist i dette tal blev IgG n-glycans analyseret i 24 indledende IgG glycan toppe baseret på spidsbelastning og retentionstid.N-glycanstrukturerne fås i 24 typer gennem massespektrometridetektering. For at esytre metodens repeterbarhed og stabilitet blev standardprøven testet parallelt seks gange. Glycantoppene med relativt små proportioner viste høje målefejl på mere end 10 % variationskoefficient.I stykket og vigtigt at danne til en etableret af IgG n-glycan struktur, især for oprettelse af terminal Derfor, i stedet for 3,3 IgG n-glycase fundet i er afgørende i denne betydningen af IgG. Glycaner fra er kendt for at være anderledes. Med udviklingen i glycan prototomics, kombineret i glycans at udforske oplysninger til dette, således at det kan bruges som et potentiale for nutidens diagnose.Efter denne teknikudvikling giver det en ny måde at udforske

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Nethindeløsning Model i Gnavere ved subretinal Injektion af Natriumhyaluronats

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

I livmoderen Måling af Puls i mus ved Noninvasiv M-mode Ekkokardiografi

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering af human lymfeendotelceller af Multi-parameter Fluorescens-aktiveret cellesortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

VDJ-Seq: Dybt sekventering Analyse af omarrangeret Immunoglobulin tungkædegen at afsløre Klonal Evolution Mønstre af B-celle lymfom

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal miRNA analyse i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) Patienter &#39;plasma Gennem qPCR: En gennemførlige Liquid biopsi værktøj

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Rumlige kvantificering af narkotika i lungetuberkulose læsioner af Laser fange Microdissection Liquid Chromatography massespektrometri (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

Anvendelse af Biochip mikrofluid teknologi at detektere Serum Allergen-specifikt immunglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Vurdering af de luftbårne partiklers akutte toksicitet ved indånding ved at udsætte dyrkede humane lungeceller ved luftflydende interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Kvalitetsstyret spytanalyse efter flowcytometri

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...