Name: immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) en de Australische-Chinese samenwerkings beurs (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).

Alle onderwerpen die in het protocol zijn opgenomen, zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Capital Medical University, Peking, China12. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van elk onderwerp aan het begin van de studie.
1. IgG-isolatie
<ol><li>Bereid de chemicaliën inclusief bindende buffer (fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutraliserende buffer: 10x PBS (pH = 6,6-6.8), eluent: 0,1 M mierenzuur (pH = 2,5), ne...

<ol>
	<li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomics,+glycoproteomics+and+the+immune+system.">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).</li><li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics.">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li><li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Glycosylation+and+Inflammation.">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392 (2013).</li><li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases.">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65 (2018).</li><li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research.">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).</li><li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated,+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform.">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).</li><li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages.">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).</li><li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index.">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia.">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).</li><li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations.">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension:+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study.">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G.">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).</li><li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson's+disease.">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).</li><li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation.">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).</li><li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations.">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).</li><li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography.">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).</li><li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types.">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963 (2016).</li></ol>

UPLC dient als relatieve kwantitatieve analysemethode5,15. De resultaten geven aan dat UPLC een stabiele detectietechnologie is met een goede reproduceerbaarheid en relatieve kwantitatieve nauwkeurigheid. De hoeveelheid glycanen in elke piek wordt uitgedrukt als een percentage van het totale geïntegreerde gebied met behulp van UPLC, wat de relatieve waarde is. De relatieve kwantificering verbetert de vergelijkbaarheid van de test monsters. Daarnaast worden 96 we...

N-glycosylatie van menselijke eiwitten is een gemeenschappelijke en essentiële post-translationele modificatie1 en kan het optreden en de ontwikkeling van ziekten relatief nauwkeurig voorspellen. Vanwege de complexiteit van de structuur, wordt verwacht dat er meer dan 5.000 ontwikkelen structuren, het bieden van grote potentie als diagnostische en voorspellende biomarkers voor ziekten2. N-glycans gekoppeld aan immunoglobuline G (IgG) zijn essentieel gebleken voor de functie van IgG, en IgG N-glycosylatie neemt deel aan de balans tussen de Pro-en ontstekingsremmende systemen3. Differentiële IgG N-glycosylatie is betrokken bij ziekte ontwikkeling en progressie, die zowel een aanleg als een functioneel mechanisme dat betrokken is bij ziekte pathologie representeren. De ontstekings functie van IgG N-glycosylation is geassocieerd met veroudering, ontstekingsziekten, auto-immuunziekten, en kanker4.
Met de ontwikkeling van detectietechnologie worden de volgende methoden het meest gebruikt in hoge doorvoer glycomics: hydrofiele interactie chromatografie (HILIC) Ultra-Performance vloeistofchromatografie met fluorescentiedetectie (UPLC-FLR), multiplex capillaire gel elektroforese met laser geïnduceerde fluorescentiedetectie (xCGE-LIF), matrix-geassisteerde Laser desorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF-MS), en vloeibare chromatografie elektro spray massaspectrometrie (LC-ESI-MS) . Deze methoden hebben overwonnen eerdere tekortkomingen van lage flux, instabiele resultaten, en slechte gevoeligheid specificiteit5,6.
UPLC wordt veel gebruikt om de associatie te onderzoeken tussen IgG N-glycosylatie en bepaalde ziekten (d.w.z. veroudering7, obesitas8, dyslipidemie9, type II diabetes10, hypertensie11, ischemische beroerte12, en de ziekte van Parkinson13). In vergelijking met de andere drie bovengenoemde methoden heeft UPLC de volgende voordelen5,14. Ten eerste biedt het een relatieve kwantitatieve analysemethode en de gegevensanalyse die de totale gebieds normalisatie omvat, verbetert de vergelijkbaarheid van elk monster. Ten tweede zijn de kosten van apparatuur en vereiste expertise relatief laag, wat het gemakkelijker maakt om glycosylatie biomarkers in klinische toepassingen te implementeren en te transformeren. Hier gepresenteerd is een inleiding tot UPLC, zodat het meer op grote schaal kan worden gebruikt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-aminobenzamide, 2-AB</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well collection plate</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plate</td>
			<td>Pol</td>
			<td>0.45 um GHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well monolithic plate</td>
			<td>BIA Separations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate rotor</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant shaking incubator/rocker</td>
			<td>Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China</td>
			<td>ZWY-10313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>BEH column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric ovens</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>202-2AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empower 3.0</td>
			<td>Waters technology Co., Ltd, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoProfile 2-AB Labeling kit</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerator</td>
			<td>Qingdao Haier Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold 96-well plate</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q pure water meter</td>
			<td>Millipore Co., Ltd, America</td>
			<td>Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH tester</td>
			<td>Sartorius Co., Ltd, Germany</td>
			<td>PB-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>4672100, 0.5-10&#956;l &#38; 10-100&#956;l &#38; 20-200&#956;l &#38; 1000&#956;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td>
			<td>B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer liquid gun</td>
			<td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>4672100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low temperature refrigerator</td>
			<td>Thermo Co., Ltd, America</td>
			<td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-performance liquid chromatography</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>Acquity MLtraPerformance LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>725000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volatilizing machine/Dryer</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>NP-30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-bath</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>DK-98-IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>MP200B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography

Glycomics is een nieuwe subspecialiteit in het omics-systeem onderzoek dat een significant potentieel biedt bij het ontdekken van de volgende generatie biomarkers voor ziekte gevoeligheid, detectie van drugs doel en precisie geneeskunde. Alternatieve IgG N-glycans zijn gemeld bij verschillende gemeenschappelijke chronische ziekten en suggereerden veel potentieel in klinische toepassingen (d.w.z. biomarkers voor diagnose en voorspelling van ziekten). IgG N-glycans worden op grote schaal gekenmerkt door de methode van hydrofiele interactie chromatografie (HILIC) Ultra-Performance vloeistofchromatografie (UPLC). UPLC is een stabiele detectietechnologie met een goede reproduceerbaarheid en een hoge relatieve kwantitatieve nauwkeurigheid. Bovendien, de structuur van IgG N-ontwikkelen is duidelijk gescheiden, en ontwikkelen samenstelling en relatieve overvloed in plasma worden gekenmerkt.

Zoals weergegeven in Figuur 1, werden IgG N-glycans geanalyseerd in 24 initiële IgG ontwikkelen pieken (GPS) op basis van piekpositie en retentietijd. De N-glycan structuren zijn beschikbaar via massaspectrometrie detectie volgens een eerdere studie (tabel 1)15. Om ervoor te zorgen dat de resultaten vergelijkbaar waren, werd de totale oppervlakte-normalisatie toegepast, waarbij de hoeveelheid glycane...

Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Immunoglobuline G (IgG) N-glycan wordt gekenmerkt met behulp van hydrofiele interactie CHROMATOGRAFIE UPLC. Daarnaast is de structuur van IgG N-glycan duidelijk gescheiden. Hier gepresenteerd is een inleiding tot deze experimentele methode, zodat het op grote schaal kan worden gebruikt in onderzoeksinstellingen.

Immunoglobuline G N-Glycan-analyse door Ultra-prestatie vloeistofchromatografie

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Ultra-performance vloeibare chromatografie is gevestigde technologie voor nauwkeurige analyse van IgG n-glycan Vanwege de gevoeligheid lijkt te zijn en het heeft de mogelijkheid om een specifieke informatie van glycan Deze methode is gemakkelijk te gebruiken en heeft het aantal verschillende relatief lage kosten van stappen, hoge reproduceerbaarheid De mogelijkheid om glycan isomers. De metingen van eiwitten in plasma kunnen aantrekkelijk zijn. in de geneeskunde.ook geassocieerd met IgG in glycose basis en dergelijke en biologische met de bevolking. Je weet dat van onzuivere toestand wordt gebruikt om IgG te testen in glycanen. Eigenlijk kan het n-glycanen van eiwitten testen.Dit is nodig in een grensoverschrijdend eiwit van twee zuivere toestand kan worden toegepast op het eiwit De OR experimenteel proces is relatief eenvoudig, terwijl het experimentele proces moet worden gestandaardiseerd. Het end-to-end experimentele proces duurt drie dagen om te werken, en de experimentele stappen moeten worden onthouden om de experimentele vaardigheden onder de knie te krijgen. Ontdooi om de monsters voor te bereiden, ontdooi het bevroren plasmamonster.Dan, centrifuge op 80 keer G gedurende 10 minuten. Laat het eiwit G monolithische plaat 30 minuten op kamertemperatuur. Breng 100 micrometer monster over in elke put van de twee-milliliter verzamelplaat.Voeg ultra zuiver water toe als één controlemonster. Verdun de monsters met één X PBS met één tot zeven volumeverhouding. Reinig een 0,45 micron hydrofiele polypropolene filterplaat met 200 microliter ultra zuiver water.Herhaal de reiniging twee keer extra. Breng de verdunde monsters over in de filterplaat en filtreer de monsters in de collectieve plaat met een vacuümpomp met druk op 266,6 tot 399,9 Pascals. Om het eiwit G monolithische platen te bereiden, gooi je eerst de opslagbuffer weg.Reinig de monolithische platen met twee milliliter ultra zuiver water, twee milliliter van één X PBS, een milliliter 0,17 molaire mierenzuur, twee milliliter 10 X PBS en twee milliliter van één X PBS sequentieel. Verwijder de volgende vloeistof met behulp van een vacuümpomp. Breng met behulp van een meerkanaalspipet de gefilterde monsters over naar de eiwit G monolithische plaat voor IgG binding en reiniging.Voeg vervolgens twee milliliter van één X PBS toe om de monolithische platen schoon te maken. Verwijder de PBS met behulp van een vacuümpomp en herhaal de reiniging twee keer. Illute IgG met een milliliter 0,17 molaire mierenzuur, en filter de monsters in de opvangplaat door vacuümpomp.Voeg vervolgens 170 microliter van één molar ammoniumbicarbonaat toe aan de verzamelplaat. Detecteer de IgG-concentratie met behulp van een absorptiespecttropetometer op de optimale golflengte van 280 nanometer. Plaats de geëxtraheerde IgG in een oven om drie uur lang op 60 graden Celsius te drogen.Bepaal het bedrag dat moet worden waargenomen op basis van de concentratie zoals beschreven in het manuscript, en bewaar het in min 80 graden Celsius. Verzamel de gedroogde IgG en bewaar chemicaliën, waaronder 1,33%SDS, vier procent IgePal en 5%PBS bij kamertemperatuur. Bereid indoglycosidase F enzym door verdunnen 250 eenheden enzym met 250 microliter van ultra zuiver water.Om de IgG te denatureren, voeg 30 microliters van 1,33% SDS toe en meng door vortexing. Breng het monster in een oven van 65 graden Celsius gedurende 10 minuten. Haal het vervolgens uit de oven en laat het 15 minuten afkoelen.Voeg 10 microliters van vier procent IgePal in hetzelfde monster, en plaats het op een schudden incubator voor vijf minuten. Voeg 20 microliter van vijf X PBS en 30 tot 35 microliter van 0,1 molaire natriumhydroxide toe om de pH tot 8,0 te reguleren en meng door vortexing. Voeg vier microliters van endoglycosidase F enzym, en meng door vortexing.Dan, incubeer voor 18 tot 20 uur in een 37 graden Celsius waterbad. De volgende dag, plaats de vrijgelaten gylcans in een oven op 60 graden Celsius te drogen voor twee en een half tot drie uur. Bewaar de release glycans op min 80 graden Celsius tot verdere meting.Bereid de twee amino benzimide labelen reagens met 24,5 microliter DMSO, 10,5 microliter azijnzuur, 0,7 milligram van twee amino benzimide, en zes milligram natriumcyanoborohydride. Vervolgens, in een donkere kamer, label de glycanen door het toevoegen van 35 microliter van twee amino benzimide etikettering reagens. Breng de gelabelde glcans vijf minuten naar een oscillator en breng het vervolgens drie uur naar de oven bij 65 graden Celsius.Daarna breng je het 30 minuten op kamertemperatuur. De IgG n-glycase, we zullen het labelen met om ontdekt te worden door de fluorescerende detectie van onzuivere toestand. Pretreat een 0,2 micron GHP filterplaat met 200 microliter van 70%ethanol, 200 microliters ultra zuiver water en 200 microliter van 96%aceto nitril bij vier graden Celsius.Verwijder vervolgens het afval met behulp van een vacuümpomp. Om de twee amino benzimide gelabeld glycans te zuiveren, voeg 700 microliters van 100% acetonitril aan het monster, en breng het naar een schudden incubator gedurende vijf minuten. Centrifuge op 134 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Breng de supernatent twee minuten naar een GHP-filterplaat van 0,2 micron en verwijder het filtraat met behulp van het vacuüm. Was de twee amino benzimide gelabeld glycan met 200 microliter van 96%acetonitril op vier graden Celsius, en verwijder het filtraat met behulp van een vacuümpomp vijf tot zes keer. Illute twee amino benzimide gelabeld glycan met 100 microliter van ultra zuiver water drie keer.Breng de twee amino benzimide gelabeld glycan in een oven te drogen op 60 graden Celsius voor drie en een half uur. Bewaar de gelabelde n-glycans bij min 80 graden Celsius tot verdere meting. Open eerst de software om de mobiele fasen te bedienen.Was UPLC-instrumenten met 50%solvent B en 50%solvent C bij de stroomsnelheid van 0,2 milliliter per minuut gedurende 30 minuten. Was vervolgens met 25%oplosmiddel A en 75%oplosmiddel B bij een debiet van 0,2 milliliter per minuut gedurende 20 minuten. Voeg vervolgens een stroomsnelheid van 0,4 milliliter per minuut toe.Los de gelabelde n-glycans op met 25 microliter van een mengsel van 100%acetonitril en ultra zuiver water met een volumeverhouding van twee tot één. Dan, centrifugeren op 134 keer G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius, en gebruik een droge pijp om 10 microliters van de supernatent te laden in de UPLC-instrumenten. Scheid de gelabelde n-glycanen met een stroomsnelheid van 0,4 milliliter per minuut met een lineair verloop van 75% tot 62% acetonitril gedurende 25 minuten.Voer vervolgens een analytische uitgevoerd door Dexteran kalibratie ladder glycopeptide kolom op een UPLC op 60 graden Celsius. Detecteer n-glycan fluorescerende stoffen bij X citatie en emissiegolflengten van respectievelijk 330 nanometer en 420 nanometer. Zoals blijkt uit deze figuur, IgG n-glycanen werden geanalyseerd in 24 initiële IgG glycan pieken op basis van piekpositie en retentietijd.De n-glycan structuren zijn verkrijgbaar in 24 soorten door middel van massaspectrometrie detectie. Om de herhaalbaarheid en stabiliteit van de methode te insten, werd het standaardmonster zes keer parallel getest. De glycan pieken met relatief kleine proporties vertoonden hoge meetfouten van meer dan 10% van de variatiecoëfficiënt.In het stuk en belangrijk voor de vorming van een gevestigde van IgG n-glycan structuur, met name voor de oprichting van terminal Daarom, in plaats van 3,3 IgG n-glycase gevonden in is van cruciaal belang in dit het belang van IgG. Glycans uit staan bekend als anders. Met de ontwikkelingen in glycan prototomics, gecombineerd in glycanen om informatie te verkennen om dit zodanig dat Het kan worden gebruikt als een potentieel voor de diagnose van vandaag.Na deze techniekontwikkeling biedt het een nieuwe manier om de

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Muis Model van Intraluminale mCaO: herseninfarct Evaluatie door cresyl Violet Staining

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Netvliesloslating Model in Knaagdieren door Subretinal Injectie van natriumhyaluronaat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Meting van de hartslag in de Muis door invasieve M-mode echocardiografie

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolatie van menselijke lymfatische endotheelcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analyse van Rearranged immunoglobuline zware keten gen Klonale Evolution Patronen van B cel lymfoom Reveal

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomaal miRNA analyse in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) patiënten Plasma Through qPCR: een haalbare Liquid biopsie Tool

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Ruimtelijke kwantificering van Drugs in longtuberculose laesies door Laser vangen Microdissection vloeistof chromatografie massaspectrometrie (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

Toepassing van Biochip Microfluidic technologie te detecteren Serum allergeen-specifieke Immunoglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Beoordeling van de acute inademingstoxiciteit van deeltjes in de lucht door gecultiveerde menselijke longcellen bloot te stellen op de Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Kwaliteitsgecontroleerde sputumanalyse door flowcytometrie

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...