Name: immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00
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Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) und des Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020) unterstützt.

Alle im Protokoll enthaltenen Themen wurden von der Ethikkommission der Capital Medical University, Peking, China12genehmigt. Zu Beginn der Studie wurde von jedem Fach die schriftliche Zustimmung in Kenntnis der Sachlage eingeholt.
1. IgG-Isolierung
<ol><li>Herstellung der Chemikalien inklusive Bindungspuffer (Phosphatgepufferte Saline, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), Neutralisationspuffer: 10x PBS (pH = 6,6-6,8), Eluent: 0,1 M Ameisensäure (pH = 2,5), Neutralisationslösun...

<ol>
	<li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomics,+glycoproteomics+and+the+immune+system.">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).</li><li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics.">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li><li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Glycosylation+and+Inflammation.">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392 (2013).</li><li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases.">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65 (2018).</li><li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research.">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).</li><li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index.">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia.">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).</li><li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations.">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension:+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study.">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G.">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).</li><li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson's+disease.">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).</li><li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation.">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).</li><li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations.">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).</li><li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography.">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).</li><li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types.">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963 (2016).</li></ol>

UPLC dient als relative quantitative Analysemethode5,15. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass UPLC eine stabile Detektionstechnologie mit guter Reproduzierbarkeit und relativer quantitativer Genauigkeit ist. Die Menge an Glykanen in jedem Peak wird als Prozentsatz der gesamten integrierten Fläche mit UPLC ausgedrückt, was der relative Wert ist. Die relative Quantifizierung verbessert die Vergleichbarkeit von Testproben. Darüber hinaus werden 96 Well-Protein-...

N-Glykosylierung menschlicher Proteine ist eine häufige und wesentliche posttranslationale Modifikation1 und kann dazu beitragen, das Auftreten und die Entwicklung von Krankheiten relativ genau vorherzusagen. Aufgrund der Komplexität seiner Struktur, es wird erwartet, dass es mehr als 5.000 Glykanstrukturen, die großes Potenzial als diagnostische und prädiktive Biomarker für Krankheiten2. N-Glykane, die an Immunglobulin G (IgG) angeschlossen sind, haben sich als wesentlich für die Funktion von IgG erwiesen, und IgG-N-Glykosylierung beteiligt sich am Gleichgewicht zwischen den pro- und entzündungshemmenden Systemen3. Differential-IgG N-Glykosylierung ist an der Entwicklung und Progression von Krankheiten beteiligt, was sowohl eine Veranlagung als auch einen funktionellen Mechanismus darstellt, der an der Krankheitspathologie beteiligt ist. Die entzündliche Rolle der IgG N-Glykosylierung wurde mit Alterung, entzündlichen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Krebs assoziiert4. 
Mit der Entwicklung der Detektionstechnik Die folgenden Methoden werden am häufigsten in Glykomik mit hohem Durchsatz eingesetzt: hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie mit Fluoreszenzdetektion (UPLC-FLR), Multiplex-Kapillargelelektrophorese mit laserinduzierten Fluores Cence Detection (xCGE-LIF), matrixgestützte Laser-Desorption/Ionisationszeit-massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) und Flüssigchromatographie-Elektrospray-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS) . Diese Methoden haben frühere Mängel des niedrigen Flusses, instabile Ergebnisse und schlechte Empfindlichkeitsspezifität5,6überwunden.
UPLC ist weit verbreitet, um den Zusammenhang zwischen IgG N-Glykosylierung und bestimmten Krankheiten zu erforschen (d.h. Alterung7, Adipositas8, Dyslipidämie9, Typ-II-Diabetes10, Bluthochdruck11, ischämischer Schlaganfall12, und Parkinson-Krankheit13). Im Vergleich zu den anderen drei oben genannten Methoden hat UPLC die folgenden Vorteile5,14. Erstens bietet es eine relative quantitative Analysemethode, und die Datenanalyse, die die Gesamtflächennormalisierung umfasst, verbessert die Vergleichbarkeit jeder Stichprobe. Zweitens sind die Kosten für Ausrüstung und das erforderliche Know-how relativ gering, was die Implementierung und Umwandlung von Glykosylierungsbiomarkern in klinische Anwendungen erleichtert. Hier wird eine Einführung in UPLC vorgestellt, damit es weiter verbreitet werden kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-aminobenzamide, 2-AB</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well collection plate</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plate</td>
			<td>Pol</td>
			<td>0.45 um GHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well monolithic plate</td>
			<td>BIA Separations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate rotor</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant shaking incubator/rocker</td>
			<td>Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China</td>
			<td>ZWY-10313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>BEH column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric ovens</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>202-2AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empower 3.0</td>
			<td>Waters technology Co., Ltd, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoProfile 2-AB Labeling kit</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerator</td>
			<td>Qingdao Haier Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold 96-well plate</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q pure water meter</td>
			<td>Millipore Co., Ltd, America</td>
			<td>Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH tester</td>
			<td>Sartorius Co., Ltd, Germany</td>
			<td>PB-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>4672100, 0.5-10&#956;l &#38; 10-100&#956;l &#38; 20-200&#956;l &#38; 1000&#956;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td>
			<td>B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer liquid gun</td>
			<td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>4672100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low temperature refrigerator</td>
			<td>Thermo Co., Ltd, America</td>
			<td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-performance liquid chromatography</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>Acquity MLtraPerformance LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>725000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volatilizing machine/Dryer</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>NP-30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-bath</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>DK-98-IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>MP200B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography

Glycomics ist eine neue Spezialität in der Omics-Systemforschung, die ein erhebliches Potenzial bei der Entdeckung von Biomarkern der nächsten Generation für Krankheitsanfälligkeit, Wirkstoffzielforschung und Präzisionsmedizin bietet. Alternative IgG N-Glykane wurden bei mehreren häufigen chronischen Krankheiten berichtet und schlugen vor, großes Potenzial in klinischen Anwendungen zu haben (d. h. Biomarker für die Diagnose und Vorhersage von Krankheiten). IgG N-Glykane sind weithin charakterisiert mit dem Verfahren der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie (UPLC). UPLC ist eine stabile Detektionstechnologie mit guter Reproduzierbarkeit und hoher relativer quantitativer Genauigkeit. Darüber hinaus ist die Struktur von IgG N-Glycan klar getrennt, und Glyzanzusammensetzung und relative Häufigkeit im Plasma sind charakterisiert.

Wie in Abbildung 1dargestellt, wurden IgG N-Glykane in 24 anfänglichen IgG-Glykanspitzen (GPs) basierend auf Spitzenposition und Retentionszeit analysiert. Die N-Glyglykanstrukturen sind durch Massenspektrometrienachweis gemäß einer früheren Studie (Tabelle 1)15verfügbar. Um eine vergleichbare Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, wurde die Gesamtflächennormalisierung angewandt, be...

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Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Immunglobulin G (IgG) N-Glycanwird durch hydrophile Wechselwirkungschromatographie UPLC charakterisiert. Darüber hinaus ist die Struktur von IgG N-Glycan klar getrennt. Hier wird eine Einführung in diese experimentelle Methode vorgestellt, so dass sie in der Forschung weit verbreitet werden kann.

Immunglobulin G N-Glycan Analyse durch Ultra-Performance Liquid Chromatographie

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie ist etablierte Technologie für die genaue Analyse von IgG n-Glykin aufgrund seiner Empfindlichkeit scheint zu sein und es hat die Fähigkeit, eine spezifische Informationen von Glycan diese Methode ist einfach zu bedienen und hat eine Anzahl von verschiedenen relativ niedrigen Kosten von Schritten, hohe Reproduzierbarkeit Die Fähigkeit, Glykanisomere. Die Messungen von Protein enthaton im Plasma könnten attraktiv sein. in der Medizin.auch mit IgG in Glykose-Basis und solche und biologische enthalten die Bevölkerung assoziiert. Sie wissen, dass von unreinem Zustand verwendet wird, um IgG in Glykanen zu testen. Tatsächlich kann es n-Glykane von Protein testen.Dies ist erforderlich, in einem kreuzgebundenen Protein von zwei reinen Zustand kann auf das Protein angewendet werden Der ODER-Experimentalprozess ist relativ einfach, während der experimentelle Prozess standardisiert werden muss. Der Versuchdauert durchundgehend, und die experimentellen Schritte müssen auswendig gelernt werden, um die experimentellen Fähigkeiten zu beherrschen. Um die Proben vorzubereiten, tauen Sie die gefrorene Plasmaprobe auf.Dann Zentrifuge bei 80 mal G für 10 Minuten. Lassen Sie das Protein G monolithische Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Übertragen Sie 100 Mikrometer Probe in jeden Brunnen der Zwei-Milliliter-Sammelplatte.Fügen Sie ultrareines Wasser als eine Kontrollprobe hinzu. Verdünnen Sie die Proben mit einem X PBS um einbis sieben Volumenvolumenverhältnis. Reinigen Sie eine 0,45 Mikron hydrophile Polypropolen-Filterplatte mit 200 Mikroliter reinem Ultrawasser.Wiederholen Sie die Reinigung zwei weitere Male. Die verdünnten Proben in die Filterplatte geben und die Proben mit einer Vakuumpumpe mit Einem Druck von 266,6 bis 399,9 Pascal in die Sammelplatte filtern. Um das Protein G monolithische Platten vorzubereiten, entsorgen Sie zuerst den Speicherpuffer.Reinigen Sie die monolithischen Platten mit zwei Millilitern reinem Reinstwasser, zwei Millilitern eines X PBS, einem Milliliter 0,17 Molaren-Ameisensäure, zwei Millilitern 10 X PBS und zwei Millilitern eines X PBS sequenziell. Entfernen Sie die folgende Flüssigkeit mit einer Vakuumpumpe. Übertragen Sie die gefilterten Proben mit einer Mehrkanalpipette zur IgG-Bindung und -Reinigung auf die monolithische Proteinplatte G.Fügen Sie dann zwei Milliliter eines X PBS hinzu, um die monolithischen Platten zu reinigen. Entfernen Sie die PBS mit einer Vakuumpumpe, und wiederholen Sie die Reinigung zwei weitere Male. IgG mit einem Milliliter 0,17 Molaren-Ameisensäure illute und filteren die Proben per Vakuumpumpe in die Sammelplatte.Dann 170 Mikroliter eines molaren Ammoniumbicarbonats in die Sammelplatte geben. Detektieren Sie die IgG-Konzentration mit einem Absorptionsspektropetometer bei der optimalen Wellenlänge von 280 Nanometern. Das extrahierte IgG drei Stunden in einen Ofen stellen, um bei 60 Grad Celsius zu trocknen.Bestimmen Sie die menge, die gemäß ihrer Konzentration, wie im Manuskript beschrieben, beobachtet werden soll, und bewahren Sie sie bei minus 80 Grad Celsius auf. Sammeln Sie das getrocknete IgG und speichern Sie Chemikalien wie 1,33% SDS, vier Prozent IgePal und 5% PBS bei Raumtemperatur. Bereiten Sie Indoglycosidase F-Enzym durch Verdünnung von 250 Einheiten Enzym mit 250 Mikroliter reines Ultrawasser.Zur Denaturierung des IgG 30 Mikroliter 1,33%SDS hinzufügen und durch Wirbelmischen mischen. Die Probe für 10 Minuten in einen 65-Grad-Celsius-Ofen geben. Dann entfernen Sie es aus dem Ofen, und lassen Sie es für 15 Minuten abkühlen.Fügen Sie 10 Mikroliter von vier Prozent IgePal in die gleiche Probe, und legen Sie es auf einem Schüttel-Inkubator für fünf Minuten. Fügen Sie 20 Mikroliter von fünf X PBS und 30 bis 35 Mikroliter 0,1 Molnatriumhydroxid hinzu, um den pH-Wert auf 8,0 zu regulieren, und mischen Sie sie durch Wirbeln. Fügen Sie vier Mikroliter Endoglycosidase F Enzym, und mischen durch Wirbeln.Dann für 18 bis 20 Stunden in einem 37 Grad Celsius Wasserbad inkubieren. Am nächsten Tag die freigesetzten Gylkane bei 60 Grad Celsius in einen Ofen stellen, um zweieinhalb bis drei Stunden zu trocknen. Sparen Sie die Freisetzungglycans bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Messung.Bereiten Sie die beiden Aminobenzimid-Etikettierungsreagenz mit 24,5 Mikroliter DMSO, 10,5 Mikroliter Essigsäure, 0,7 Milligramm zweiaminobenzimid und sechs Milligramm Natriumcyanoborohydrid vor. Als nächstes beschriften Sie die Glykane in einem dunklen Raum, indem Sie 35 Mikroliter zweiaminobenzimid-Etikettierungsreagenz hinzufügen. Die beschrifteten Glcans für fünf Minuten auf einen Oszillator übertragen und dann drei Stunden bei 65 Grad Celsius in den Ofen geben.Danach auf Raumtemperatur für 30 Minuten übertragen. Die IgG n-Glykase, mit der wir sie kennzeichnen, um durch den fluoreszierenden Detektion von unreinem Zustand nachgewiesen zu werden. Pretreat eine 0,2 Mikron GHP Filterplatte mit 200 Mikroliter 70%Ethanol, 200 Mikroliter ultrareinem Wasser und 200 Mikroliter 96%aceto Nitril bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie dann den Abfall mit einer Vakuumpumpe. Um die beiden Aminobenzimid-markierten Glykane zu reinigen, fügen Sie der Probe 700 Mikroliter 100% Acetonitril hinzu und übertragen Sie sie für fünf Minuten in einen Schüttelinkubator. Zentrifuge bei 134 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Übertragen Sie den Überstand für zwei Minuten auf eine 0,2 Mikrometer GHP-Filterplatte und entfernen Sie das Filtrat mit dem Vakuum. Waschen Sie die beiden Aminobenzimid-beschrifteten Glykin mit 200 Mikroliter n96%Acetonitril bei vier Grad Celsius, und entfernen Sie das Filtrat mit einer Vakuumpumpe fünf- bis sechsmal. Erleuchten Sie zwei Aminobenzimid markiert Glykan mit 100 Mikroliter ultra reinem Wasser dreimal.Die beiden mit Aminobenzimid bezeichneten Glykane in einen Ofen geben, um bei 60 Grad Celsius dreieinhalb Stunden zu trocknen. Die beschrifteten n-Glykane bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Messung speichern. Öffnen Sie zunächst die Software, um die mobilen Phasen zu steuern.Waschen Sie UPLC-Instrumente mit 50% Lösungsmittel B und 50% Lösungsmittel C bei einer Durchflussrate von 0,2 Milliliter pro Minute für 30 Minuten. Dann mit 25% Lösungsmittel A und 75%Lösungsmittel B mit einer Durchflussrate von 0,2 Milliliter pro Minute für 20 Minuten waschen. Fügen Sie dann eine Durchflussrate von 0,4 Milliliter pro Minute hinzu.Lösen Sie die beschrifteten n-Glykane mit 25 Mikrolitern einer Mischung aus 100%Acetonitril und ultrareinem Wasser bei einem Volumenverhältnis von zwei bis eins auf. Dann Zentrifuge bei 134 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, und verwenden Sie ein Trockenerohr, um 10 Mikroliter des Überstandes in die UPLC-Instrumente zu laden. Trennen Sie die beschrifteten n-Glykane mit einer Durchflussrate von 0,4 Millilitern pro Minute mit einem linearen Gradienten von 75% bis 62%Acetonitril für 25 Minuten.Führen Sie dann einen analytischen Lauf von Dexteran Kalibrierleiter Glykopeptid-Säule auf einem UPLC bei 60 Grad Celsius. Detektieren Sie n-glykanische Leuchtstoffröhren bei X-Zitatund-Emissionswellenlängen von 330 Nanometern bzw. 420 Nanometern. Wie in dieser Abbildung gezeigt, wurden IgG n-Glykane in 24 anfänglicheN IgG-Glykanspitzen basierend auf Spitzenposition und Retentionszeit analysiert.Die n-glykanischen Strukturen sind in 24 Arten durch Massenspektrometriedede verfügbar. Um die Wiederholbarkeit und Stabilität des Verfahrens zu beschwichtigen, wurde die Standardprobe sechsmal parallel getestet. Die Glyzinpeaks mit relativ geringen Anteilen wiesen hohe Messfehler von mehr als 10 % des Variationskoeffizienten auf.In dem Stück und wichtig für die Bildung zu einer etablierten IgG n-glykanische Struktur, insbesondere für die Einrichtung von Terminal Daher ist anstelle von 3.3 IgG n-Glyse in gefunden e.V. die Bedeutung von IgG entscheidend. Glycane von sind dafür bekannt, anders zu sein. Mit den Entwicklungen in der Glykan-Prototomik, kombiniert in Glykanen, um Informationen zu diesem zu erkunden, so dass es als Potenzial für die heutige Diagnose verwendet werden kann.Nach dieser Technikentwicklung bietet es eine neue Möglichkeit, die

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In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Messung der Herzfrequenz in Mouse von Nichtinvasive M-Mode-Echokardiographie

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

VDJ-Seq: Tiefe Sequenzierung Analyse Rearranged Immunglobulin-Schwerketten-Gen zu Klonale Entwicklung Muster der B Zell-Lymphom Reveal

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomalen miRNA-Analyse in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) der Patienten Plasma durch qPCR: ein gangbarer Flüssiges Biopsy-Tool

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Räumliche Quantifizierung von Drogen in der Lungentuberkulose Läsionen durch Laser Capture Microdissection Flüssigkeit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

Einsatz von Biochip mikrofluidischen Technologie zur Erkennung Serum Allergen-spezifische Immunglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Bewertung der akuten Inhalationstoxizität von Luftpartikeln durch Aussetzen kultivierter menschlicher Lungenzellen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Qualitätskontrollierte Sputumanalyse mittels Durchflusszytometrie

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...