Name: immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מן הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (81673247 & 81872682) ו אוסטרליה-סין מענק שיתופי (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).

כל הנושאים הכלולים בפרוטוקול אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית קפיטל, בייג, סין12. הסכמה מושכלת בכתב הושגה מכל נושא בתחילת המחקר.
1. בידוד IgG
<ol><li>הכן את הכימיקלים כולל מאגר מחייב (מתמיסת מלח מאוחסן באגירה, PBS): 1x pbs (ph = 7.4), לנטרל מאגר: 10x pbs (ph = 6.6-6.8), הללו?...

<ol>
	<li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomics,+glycoproteomics+and+the+immune+system.">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).</li><li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics.">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li><li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Glycosylation+and+Inflammation.">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392 (2013).</li><li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases.">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65 (2018).</li><li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research.">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).</li><li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated,+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform.">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).</li><li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages.">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).</li><li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index.">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia.">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).</li><li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations.">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension:+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study.">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G.">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).</li><li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson's+disease.">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).</li><li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation.">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).</li><li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations.">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).</li><li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography.">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).</li><li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types.">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963 (2016).</li></ol>

הוא משמש כשיטה לניתוח יחסי כמותי5,15. התוצאות מצביעות על כך שהוא טכנולוגיית גילוי יציבה עם השגות ודיוק כמותי יחסית. כמות הגליקנים בכל שיא מתבטאת כאחוז של השטח המשולב הכולל באמצעות ה-, המהווה את הערך היחסי. הקוונפיקציה היחסית משפרת את יכולת ההשוואה של דגימות ה?...

N-הגליקוזילציה של חלבונים אנושיים הוא שינוי שכיח וחיוני לאחר השינוי1 ועשוי לסייע לחזות את התרחשות ופיתוח של מחלות באופן יחסי יחסית. בשל המורכבות של המבנה שלה, הוא צפוי כי יש יותר מ 5,000 מבנים גליקן, מתן פוטנציאל גדול כמו ביואריטים אבחון חזוי עבור מחלות2. N-גליקנים המחוברים למערכת החיסונית (igg) הוכחו כחיוניים לתפקוד igg, ו-Igg N-הגליסילציה משתתפת באיזון בין המערכות הפרו-דלקתיות3. IgG N-גליסיציה דיפרנציאלית מעורבת בפיתוח מחלות והתקדמות, המייצגים הן מנגנון נטייה ופונקציונלי המעורבים בפתולוגיה של מחלות. התפקיד הדלקתי של IgG N-הגליסיציה נקשר עם הזדקנות, מחלות דלקתיות, מחלות אוטואימוניות, סרטן4.
עם פיתוח של טכנולוגיית האיתור, השיטות הבאות נמצאות בשימוש נרחב ביותר גליקומיס תפוקה גבוהה: הידרופיפילית אינטראקציה כרומטוגרפיה (HILIC) כרומטוגרפיה נוזלית מאוד ביצועים עם גילוי של קרינה פלואורסצנטית (הייטק-FLR), אלקטרופורזה במגה-קרן עם ג'ל לייזר לגילוי קרינה בלייזר (xCGE-אבל), מטריקס בסיוע לייזר בעזרת מטריצות של זמן הטיסה המסה ספקטרומטריה (מאלדי-תוף-MS), וכרומטוגרפיה נוזלית ממסת המסה (LC-ESI-MS) . שיטות אלה התגברו על חסרונות קודמים של שטף נמוך, תוצאות לא יציבות, ורגישות ירודה ספציפיות5,6.
האגודה משמשת רבות לחקר הקשר בין igg N-הגליקוציה ומחלות מסוימות (כלומר, הזדקנות7, השמנה8, דיסליפידמיה9, סוכרת type10, יתר לחץ דם11, איסכמי שבץ12, פרקינסון מחלה13). בהשוואה לשלושת השיטות הנ ל, היתרונות הבאים הם5,14. ראשית, הוא מספק שיטת ניתוח כמותי יחסי, וניתוח הנתונים הכרוך בנרמול השטח הכולל משפר את יכולת ההשוואה של כל דוגמה. שנית, עלות הציוד והמומחיות הנדרשת נמוכה יחסית, מה שמקל על היישום וטרנספורמציה של ביוגליציה ליישומים קליניים. המוצג כאן הוא מבוא ל-, כדי שניתן יהיה להשתמש בו באופן נרחב יותר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-aminobenzamide, 2-AB</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well collection plate</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plate</td>
			<td>Pol</td>
			<td>0.45 um GHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well monolithic plate</td>
			<td>BIA Separations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate rotor</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant shaking incubator/rocker</td>
			<td>Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China</td>
			<td>ZWY-10313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>BEH column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric ovens</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>202-2AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empower 3.0</td>
			<td>Waters technology Co., Ltd, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoProfile 2-AB Labeling kit</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerator</td>
			<td>Qingdao Haier Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold 96-well plate</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q pure water meter</td>
			<td>Millipore Co., Ltd, America</td>
			<td>Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH tester</td>
			<td>Sartorius Co., Ltd, Germany</td>
			<td>PB-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>4672100, 0.5-10&#956;l &#38; 10-100&#956;l &#38; 20-200&#956;l &#38; 1000&#956;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td>
			<td>B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer liquid gun</td>
			<td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>4672100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low temperature refrigerator</td>
			<td>Thermo Co., Ltd, America</td>
			<td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-performance liquid chromatography</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>Acquity MLtraPerformance LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>725000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volatilizing machine/Dryer</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>NP-30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-bath</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>DK-98-IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>MP200B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography

גלילקומיקס הוא התמחות משנה חדשה ב-omics מחקר מערכת המציעה פוטנציאל משמעותי בגילוי בסמנים הדור הבא עבור הרגישות למחלות, גילוי התרופה היעד, ואת התרופה דיוק. אלטרנטיבי IgG N-גליקנים דווחו במספר מחלות כרוניות נפוצות, הציע פוטנציאל גדול ביישומים קליניים (כלומר, ביוארקרס לאבחון וחיזוי של מחלות). IgG N-גליקנים מאופיינים באופן נרחב באמצעות שיטה של אינטראקציה הידרופיפילית (hilic) כרומטוגרפית נוזלית במיוחד. היחידה היא טכנולוגיית גילוי יציבה עם שגיאות מידע ודיוק כמותי קרוב יחסית. בנוסף, המבנה של IgG N-גליקן מופרד בבירור, וניתן לאפיין את ההלחנה והשפע היחסי בפלזמה.

כפי שמוצג באיור 1, מנתחים Igg N-גליקנים לתוך 24 הראשונים igg גליקן הפסגות (GPs) מבוסס על מיקום שיא וזמן השמירה. מבני N-גליקן זמינים דרך זיהוי ספקטרומטר המסה לפי מחקר קודם (שולחן 1)15. כדי להבטיח כי התוצאות היו דומות, החלה נורמליזציה בש?...

Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

אימונוגלובולין G (IgG) N-גליקן מאופיין באמצעות כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופילית. בנוסף, המבנה של IgG N-גליקן מופרד בבירור. המוצג כאן הוא מבוא לשיטה ניסיונית זו, כך שניתן להשתמש בה באופן נרחב בהגדרות מחקר.

אימונוגלובולין G N-גליקן ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית במיוחד

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים הוקמה טכנולוגיה לניתוח מדויק של IgG n-glycan בשל הרגישות שלה נראה ויש לו את היכולת לספק מידע ספציפי של גליצן שיטה זו היא קלה לשימוש ויש לו מספר שונים עלות נמוכה יחסית של במרווחים, רבייה גבוהה היכולת isomers גליצן. המדידות של חלבון בפלזמה יכול להיות אטרקטיבי. ברפואה.קשור גם עם IgG בבסיס גליקוז כזה ביולוגי המכיל את האוכלוסייה. אתה יודע של מצב טמא משמש לבדיקת IgG בגליקנים. למעשה, זה יכול לבדוק n-גלייקנים של חלבון.זה נחוץ בחלבון חוצה גבולות של שני מצבים טהורים ניתן להחיל על חלבון תהליך הניסוי OR הוא פשוט יחסית בעוד התהליך הניסיוני צריך להיות סטנדרטי. תהליך הניסוי מקצה לקצה אורך שלושה ימים, ויש לשנן את הצעדים הניסיוניים כדי לשלוט במיומנויות הניסוי. כדי להכין את הדגימות, להפשיר את דגימת הפלזמה הקפואה.ואז, צנטריפוגה ב 80 פעמים G במשך 10 דקות. השאירו את צלחת החלבון G מונוליטית בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. מעבירים 100 מיקרומטרים של דגימה לכל באר של צלחת האיסוף של שני מיליליטר.הוסף מים טהורים במיוחד כדגימה אחת לבקרה. לדלל את הדגימות עם X PBS אחד על ידי אחד עד שבעה נפח לפי יחס נפח. נקה צלחת מסנן פוליפרופילן הידרופילית 0.45 מיקרון עם 200 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד.חזור על הניקוי פעמיים נוספות. מעבירים את הדגימות המדוללים לתוך לוחית המסנן, ומסננים את הדגימות לתוך הצלחת הקולקטיבית באמצעות משאבת ואקום בלחץ של 266.6 עד 399.9 פסקל. כדי להכין את החלבון G צלחות מונוליטיות, תחילה להשליך את מאגר האחסון.נקה את הלוחות המונוליתיים עם שני מיליליטר של מים טהורים במיוחד, שני מיליליטר של X PBS אחד, מיליליטר אחד של חומצה פורמית טוחנת 0.17, שני מיליליטר של 10 X PBS, ושני מיליליטר של X PBS אחד ברצף. הסר את הנוזל הבא באמצעות משאבת ואקום. בעזרת צינור רב-ערוצי, מעבירים את הדגימות המסוננים לצלחת המונוליטית G של החלבון לצורך כריכה וניקוי של IgG.לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של X PBS אחד כדי לנקות את הלוחות מונוליטיים. הסר את ה- PBS באמצעות משאבת ואקום, וחזור על הניקוי פעמיים נוספות. Illute IgG עם מיליליטר אחד של חומצה פורמית טוחנת 0.17, ולסנן את הדגימות לתוך צלחת האיסוף על ידי משאבת ואקום.לאחר מכן, מוסיפים 170 מיקרוליטרים של אמוניום ביקרבונט טוחן אחד לתוך צלחת האיסוף. זהה את ריכוז IgG באמצעות ספקטרופטומטר ספיגה באורך הגל האופטימלי של 280 ננומטר. מניחים את IgG המופק בתנור להתייבש ב 60 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות.לקבוע את הכמות שיש לראות על פי הריכוז שלה כמתואר בכתב היד, ולשמר אותו מינוס 80 מעלות צלזיוס. אסוף את ה- IgG המיובש ואחסן כימיקלים כולל 1.33% SDS, ארבעה אחוזים IgePal ו- 5% PBS בטמפרטורת החדר. הכן אנזים אינדוליקוזה F על ידי דילול 250 יחידות של אנזים עם 250 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד.כדי להפוך את IgG, להוסיף 30 microliters של 1.33% SDS ומערבבים על ידי מערבולת. מעבירים את הדגימה לתנור של 65 מעלות למשך 10 דקות. לאחר מכן, להסיר אותו מהתנור, ולתת לו להתקרר במשך 15 דקות.הוסיפו 10 מיקרוליטרים של ארבעה אחוזים של IgePal לאותה דגימה, והצבו אותה על חממה רועדת במשך חמש דקות. הוסף 20 מיקרוליטרים של חמישה X PBS ו 30 עד 35 microliters של 0.1 נתרן הידרוקסיד טוחן לווסת את ה- pH ל 8.0, ומערבבים על ידי מערבולת. מוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של אנזים אנדוליקוסידאז F, ומערבבים על ידי מערבולת.לאחר מכן, דגירה במשך 18 עד 20 שעות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. למחרת, מניחים את gylcans שוחרר בתנור ב 60 מעלות צלזיוס להתייבש במשך שעתיים וחצי עד שלוש שעות. שמור את הגליקנים לשחרר במינוס 80 מעלות צלזיוס עד מדידה נוספת.הכן את שני אמינו בנזימיד תיוג reagent עם 24.5 microliters של DMSO, 10.5 microliters של חומצה אצטית, 0.7 מיליגרם של שני אמינו בנזימיד, ושישה מיליגרם של נתרן ציאנובורוהידריד. לאחר מכן, בחדר חשוך, תייג את הגליקנים על ידי הוספת 35 מיקרוליטרים של שני אמינו בנזימיד תיוג reagent. מעבירים את הגלקאנים המסווים לתנוד לחמש דקות, ואז מעבירים אותו לתנור לשלוש שעות ב-65 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להעביר אותו לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. IgG n-גליקאז, אנו לתייג אותו עם על מנת להיות מזוהה על ידי גילוי פלואורסצנטי של מצב טמא. יש להצטייד בצלחת מסנן GHP של 0.2 מיקרון עם 200 מיקרוליטרים של 70% אתנול, 200 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד ו-200 מיקרוליטרים של 96% אצטו ניטריל בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להסיר את הפסולת באמצעות משאבת ואקום. כדי לטהר את שני אמינו בנזימיד שכותרתו גליקנים, להוסיף 700 microliters של 100% אצטוניטריל לדגימה, ולהעביר אותו אינקובטור רועד במשך חמש דקות. צנטריפוגה ב 134 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.מעבירים את העל-טבעי לצלחת מסנן GHP של 0.2 מיקרון למשך שתי דקות, ומסירים את הסינון באמצעות הוואקום. לשטוף את שני אמינו בנזימיד שכותרתו גליקן עם 200 microliters של 96% אצטוניטריל בארבע מעלות צלזיוס, ולהסיר את הסינון באמצעות משאבת ואקום חמש עד שש פעמים. Illute שני אמינו בנזימיד שכותרתו גליצן עם 100 microliters של מים טהורים במיוחד שלוש פעמים.מעבירים את שני אמינו בנזימיד שכותרתו גליצן לתנור להתייבש ב 60 מעלות צלזיוס במשך שלוש וחצי שעות. שמור את n-glycans שכותרתו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד מדידה נוספת. ראשית, פתח את התוכנה כדי לשלוט בשלבים הניידים.לשטוף מכשירי UPLC עם 50% ממס B ו 50% ממס C בקצב זרימה של 0.2 מיליליטר לדקה במשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף עם 25% ממס A ו 75% ממס B בקצב זרימה של 0.2 מיליליטר לדקה במשך 20 דקות. לאחר מכן, להוסיף קצב זרימה של 0.4 מיליליטר לדקה.ממיסים את ה-n-glycans המסומנים ב-25 מיקרוליטרים של תערובת של 100% אצטוניטריל ומים טהורים במיוחד ביחס נפח של שניים לאחד. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 134 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולהשתמש בצינור יבש לטעון 10 microliters של supernatent לתוך מכשירי UPLC. הפרד את ה-n-glycans המסומנים בקצב זרימה של 0.4 מיליליטר לדקה עם שיפוע ליניארי של 75%-62% אצטוניטריל למשך 25 דקות.לאחר מכן, לבצע ניתוח המנוהל על ידי דקסטרן כיול סולם גליקופפטיד עמוד על UPLC ב 60 מעלות צלזיוס. זהה פלואורסצנטיות n-glycan ב X צל"ש אורכי גל פליטה של 330 ננומטר ו 420 ננומטר, בהתאמה. כפי שמוצג בנתון זה, IgG n-glycans נותחו לתוך 24 פסגות IgG גליצן ראשוניות המבוססות על מיקום שיא וזמן שמירה.המבנים n-glycan זמינים ב 24 סוגים באמצעות גילוי ספקטרומטריית מסה. כדי לתחת את החוזרות והיציבות של השיטה, המדגם הסטנדרטי נבדק במקביל שש פעמים. פסגות הגליקן עם פרופורציות קטנות יחסית הראו שגיאות מדידה גבוהות של יותר מ -10% מקדם הווריאציה.ביצירה וחשוב להרכיב מבנה IgG n-glycan, במיוחד להקמת מסוף לכן, במקום 3.3 IgG n-glycase נמצא הוא קריטי זה החשיבות של IgG. גליקנים מ ידועים להיות שונים. עם ההתפתחויות פרוטוטומיה גליקן, בשילוב גליקנים כדי לחקור מידע זה כך שזה יכול לשמש כפוטנציאל לאבחון של היום.לאחר פיתוח טכניקה זו, הוא מספק דרך חדשה לחקור את

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

מודל עכבר של MCAO intraluminal: הערכת אוטם מוחית על ידי כתמים סגולים Cresyl

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

רשתית דגם ניתוק במכרסמים על ידי הזרקת subretinal של נתרן Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

במדידת רחם של קצב לב בעכבר על ידי אקו M-המצב פולשנית

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

VDJ-Seq: ניתוח רצף עמוק של ג&#39;ין שרשרת מחדש Immunoglobulin כבד לחשוף את דפוסים משובטים אבולוציה של לימפומה B הסלולרי

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

ניתוח מירנה Exosomal ב non-small cell סרטן ריאות (NSCLC) מטופלים פלזמה באמצעות qPCR: כלי ביופסיה נוזלי ריאלי

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד Microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

יישום של טכנולוגיה Microfluidic ביו-שבב על סרום לזהות אלרגן ספציפיים אימונוגלובולין E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

הערכת הרעלת שאיפת חריפה של חלקיקי מוטס על ידי חשיפת תאי ריאה אנושיים בממשק האוויר-נוזלי

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

ניתוח כיח מבוקר איכות לפי ציטומטריית זרימה

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...