Name: immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) e dalla australiana-Cina Collaborative Grant (NH & MRC - APP11112767 -NSFC 81561128020).

Tutti i soggetti inclusi nel protocollo sono stati approvati dal Comitato Etico della Capital Medical University, Pechino, Cina12. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni materia all'inizio dello studio.
1. Isolamento IgG
<ol><li>Preparare le sostanze chimiche, tra cui il buffer di legatura (fosfato buffer saline, PBS): 1x PBS (pH - 7,4), neutralizzazione del buffer: 10x PBS (pH - 6,6-6,8), eluente: 0,1 M di acido formica (pH - 2,5), soluzione neutrali...

<ol>
	<li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomics,+glycoproteomics+and+the+immune+system.">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).</li><li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics.">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li><li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Glycosylation+and+Inflammation.">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392 (2013).</li><li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases.">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65 (2018).</li><li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research.">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).</li><li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated,+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform.">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).</li><li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages.">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).</li><li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index.">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia.">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).</li><li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations.">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension:+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study.">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G.">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).</li><li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson's+disease.">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).</li><li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation.">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).</li><li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations.">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).</li><li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography.">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).</li><li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types.">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963 (2016).</li></ol>

UPLC funge da metodo di analisi quantitativa relativa5,15. I risultati indicano che UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e relativa precisione quantitativa. La quantità di glicani in ogni picco è espressa come percentuale dell'area totale integrata utilizzando UPLC, che è il valore relativo. La quantificazione relativa migliora la comparabilità dei campioni di prova. Inoltre, 96 piastre g di proteine sono utilizzate per...

N-glicosilazione delle proteine umane è una modifica post-traduzionale comune ed essenziale1 e può aiutare a prevedere l'insorgenza e lo sviluppo di malattie in modo relativamente accurato. A causa della complessità della sua struttura, si prevede che ci siano più di 5.000 strutture glicane, fornendo un grande potenziale come biomarcatori diagnostici e predittivi per le malattie2. N-glicani attaccati all'immunoglobulina G (IgG) hanno dimostrato di essere essenziali per la funzione di IgG, e IgG N-glycosylation partecipa all'equilibrio tra i sistemi pro e antinfiammatori3. La legatura IgG Ndifferenziale è coinvolta nello sviluppo e nella progressione della malattia, che rappresenta sia una predisposizione che un meccanismo funzionale coinvolto nella patologia della malattia. Il ruolo infiammatorio di IgG N-glycosylation è stato associato con l'invecchiamento, malattie infiammatorie, malattie autoimmuni, e cancro4. 
Con lo sviluppo della tecnologia di rilevamento, i seguenti metodi sono più ampiamente utilizzati nei licoli ad alta produttività: cromatografia ad interazione idrofila (HILIC) cromatografia liquida ad altissima prestazione con rilevamento della fluorescenza (UPLC-FLR), elettroforesi gelpillara multiplalesa con fluorino indotto dal laser rilevamento dell'escenza (xCGE-LIF), spettrometria di massa di desorption/ionizzazione del tempo di ionizzazione del tempo di volo (MALDI-TOF-MS) e spettrometria di massa elettrospray a matrice (LC-ESI-MS) . Questi metodi hanno superato le precedenti carenze di basso flusso, risultati instabili e scarsa specificità di sensibilità5,6.
UPLC è ampiamente usato per esplorare l'associazione tra IgG N-glicosilazione e alcune malattie (ad esempio, invecchiamento7, obesità8, dislipidemia9, tipo II diabete10, ipertensione11, ictus ischemico12, e morbo di Parkinson13). Rispetto agli altri tre metodi di cui sopra, UPLC ha i seguenti vantaggi5,14. In primo luogo, fornisce un metodo di analisi quantitativa relativa e l'analisi dei dati che comporta la normalizzazione totale delle aree migliora la comparabilità di ogni campione. In secondo luogo, il costo delle attrezzature e le competenze richieste sono relativamente bassi, il che rende più facile implementare e trasformare i biomarcatori della glicosilazione in applicazioni cliniche. Presentato qui è un'introduzione a UPLC in modo che possa essere più ampiamente utilizzato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-aminobenzamide, 2-AB</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well collection plate</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plate</td>
			<td>Pol</td>
			<td>0.45 um GHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well monolithic plate</td>
			<td>BIA Separations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate rotor</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant shaking incubator/rocker</td>
			<td>Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China</td>
			<td>ZWY-10313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>BEH column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric ovens</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>202-2AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empower 3.0</td>
			<td>Waters technology Co., Ltd, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoProfile 2-AB Labeling kit</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerator</td>
			<td>Qingdao Haier Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold 96-well plate</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q pure water meter</td>
			<td>Millipore Co., Ltd, America</td>
			<td>Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH tester</td>
			<td>Sartorius Co., Ltd, Germany</td>
			<td>PB-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>4672100, 0.5-10&#956;l &#38; 10-100&#956;l &#38; 20-200&#956;l &#38; 1000&#956;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td>
			<td>B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer liquid gun</td>
			<td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>4672100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low temperature refrigerator</td>
			<td>Thermo Co., Ltd, America</td>
			<td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-performance liquid chromatography</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>Acquity MLtraPerformance LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>725000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volatilizing machine/Dryer</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>NP-30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-bath</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>DK-98-IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>MP200B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography

Il glicomics è una nuova sottospecializzazione nella ricerca sul sistema omico che offre un potenziale significativo nella scoperta di biomarcatori di nuova generazione per la suscettibilità alle malattie, la scoperta di bersagli farmacologici e la medicina di precisione. I iggini alternativi IgG Nsono stati riportati in diverse malattie croniche comuni e hanno suggerito di avere un grande potenziale nelle applicazioni cliniche (ad esempio, biomarcatori per la diagnosi e la previsione delle malattie). IgG N-glicani sono ampiamente caratterizzati utilizzando il metodo di cromatografia di interazione idrofila (HILIC) cromatografia liquida ad altissima prestazione (UPLC). UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e un'elevata precisione quantitativa relativa. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata, e la composizione glicana e l'abbondanza relativa nel plasma sono caratterizzati.

Come illustrato nella Figura 1, IgG N-glicani sono stati analizzati in 24 picchi iniziali di glicani (GP) in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione. Le strutture N-glicani sono disponibili attraverso il rilevamento della spettrometria di massa secondo uno studio precedente (Tabella 1)15. Per garantire che i risultati fossero comparabili, è stata applicata la normalizzazione totale dell...

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Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

ImmunoglobulinG (IgG) N-glican è caratterizzato utilizzando l'interazione idrofila cromatografica UPLC. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata. Presentato qui è un'introduzione a questo metodo sperimentale in modo che possa essere ampiamente utilizzato nelle impostazioni di ricerca.

Immunoglobulin G N-Glycan Analisi di Ultra-Performance Liquid Chromatoography

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

La cromatografia liquida ad alte prestazioni è una tecnologia consolidata per un'analisi accurata dell'IgG n-glicina A causa della sua sensibilità sembra essere e ha la capacità di fornire una specifica informazione di glico Questo metodo è facile da usare e ha un numero di diversi costi relativamente bassi di incrementi, alta riproducibilità La capacità di glicerinare isomeri. Le misurazioni delle proteine nel plasma potrebbero essere interessanti. in medicina.associato anche all'IgG in base al glicosio e tale e biologico contenente la popolazione. Sai che dello stato impuro viene usato per testare l'IgG nei glicani. In realtà, può testare n-glicani di proteine.Questo è necessario in una proteina cross-bound di due stati puri può essere applicato alla proteina Il processo sperimentale OR è relativamente semplice mentre il processo sperimentale deve essere standardizzato. Il processo sperimentale end-to-end richiede tre giorni per funzionare e le fasi sperimentali devono essere memorizzate per padroneggiare le abilità sperimentali. Per preparare i campioni, scongelare il campione di plasma congelato.Quindi, centrifugare a 80 volte G per 10 minuti. Lasciare la piastra monolitica proteinA G a temperatura ambiente per 30 minuti. Trasferire 100 micrometri di campione in ogni pozzo della piastra di raccolta a due millilitri.Aggiungere acqua ultra pura come un campione di controllo. Diluire i campioni con un X PBS da uno a sette volume per volume. Pulire una piastra filtrante in polipropolene idrofilo da 0,45 micron con 200 microlitri di acqua ultra pura.Ripetere la pulizia altre due volte. Trasferire i campioni diluiti nella piastra filtrante e filtrare i campioni nella piastra collettiva utilizzando una pompa per vuoto con pressione da 266,6 a 399,9 Pascal. Per preparare le placche monolitiche proteina G, prima scartare il tampone di stoccaggio.Pulire le piastre monolitiche con due millilitri di acqua ultra pura, due millilitri di un X PBS, un millilitro di acido formico molare 0,17, due millilitri di 10 X PBS e due millilitri di un X PBS in sequenza. Rimuovere il seguente liquido utilizzando una pompa per vuoto. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire i campioni filtrati nella piastra monolitica proteina G per legare e pulire IgG.Quindi, aggiungere due millilitri di un X PBS per pulire le piastre monolitiche. Rimuovere il PBS utilizzando una pompa per vuoto e ripetere la pulizia due volte in più. Illute IgG con un millilitro di acido formico molare 0,17 e filtrare i campioni nella piastra di raccolta mediante pompa per vuoto.Quindi, aggiungere 170 microlitri di un bicarbonato di ammonio molare nella piastra di raccolta. Rilevare la concentrazione IgG utilizzando uno spettrotropetometro di assorbimento alla lunghezza d'onda ottimale di 280 nanometri. Posizionare l'IgG estratto in un forno per asciugare a 60 gradi Celsius per tre ore.Determinare la quantità da osservare in base alla sua concentrazione descritta nel manoscritto e conservarla in meno 80 gradi Celsius. Raccogliere l'IgG essiccato e conservare prodotti chimici tra cui 1,33%SDS, 4% IgePal e 5%PBS a temperatura ambiente. Preparare l'enzima indoglycosidasi F diluire 250 unità di enzima con 250 microlitri di acqua ultra pura.Per denaturare l'IgG, aggiungere 30 microlitri di 1,33%SDS e mescolare con il vortice. Trasferire il campione in un forno a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, rimuoverlo dal forno e lasciarlo raffreddare per 15 minuti.Aggiungere 10 microlitri di IgePal al quattro% nello stesso campione e posizionarlo su un'incubatrice di scuotimento per cinque minuti. Aggiungere 20 microlitri di cinque X PBS e da 30 a 35 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 per regolare il pH a 8,0 e mescolare mediante vortice. Aggiungere quattro microlitri di enzima endoglicosidasi F e mescolare con il vortice.Quindi, incubare per 18-20 ore in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, mettere i ginecani rilasciati in un forno a 60 gradi Celsius per asciugare per due ore e mezza o tre ore. Salvare i glicani di rilascio a meno 80 gradi Celsius fino a ulteriori misurazioni.Preparare i due reagenti per l'etichettatura dell'ammino benzimide con 24,5 microlitri di DMSO, 10,5 microlitri di acido acetico, 0,7 milligrammi di due ammino benzimide e sei milligrammi di cianoboroidro di sodio. Successivamente, in una stanza buia, etichettare i glicani aggiungendo 35 microlitri di due ammino benzimide che etichettano il reagente. Trasferire i glcan etichettati su un oscillatore per cinque minuti, quindi trasferirli al forno per tre ore a 65 gradi Celsius.Successivamente, trasferirlo a temperatura ambiente per 30 minuti. L'IgG n-glicasi, lo etichettamo per essere rilevato dal rilevamento fluorescente dello stato impuro. Pretrattare una piastra filtrante GHP da 0,2 micron con 200 microlitri di etanolo al 70%, 200 microlitri di acqua ultra pura e 200 microlitri di nitrile di aceto al 96% a quattro gradi Celsius.Quindi, rimuovere i rifiuti utilizzando una pompa per vuoto. Per purificare i due glicani etichettati come ammino benzimide, aggiungere 700 microlitridi di acetonitrile al 100% al campione e trasferirlo in un'incubatrice di scuotimento per cinque minuti. Centrifuga a 134 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Trasferire il supernatante su una piastra filtrante GHP da 0,2 micron per due minuti e rimuovere il filtrato utilizzando il vuoto. Lavare i due amino benzimidi etichettati glicina con 200 microlitridi del 96% di acetonitrile a quattro gradi Celsius e rimuovere il filtrato utilizzando una pompa per vuoto da cinque a sei volte. Male due ammino benzimide etichettati glicina con 100 microlitri di acqua ultra pura tre volte.Trasferire i due amino benzimide etichettati glicina in un forno per asciugare a 60 gradi Celsius per tre ore e mezza. Salvare gli n-glicani etichettati a meno 80 gradi Celsius fino a ulteriore misurazione. In primo luogo, aprire il software per controllare le fasi mobili.Lavare gli strumenti UPLC con 50%solvente B e 50% solvente C alla portata di 0,2 millilitri al minuto per 30 minuti. Quindi lavare con il 25% solvente A e il 75% solvente B ad una portata di 0,2 millilitri al minuto per 20 minuti. Quindi, aggiungere una portata di 0,4 millilitri al minuto.Sciogliere gli n-glicani etichettati con 25 microlitri di una miscela di acetonitrile al 100% e acqua ultra pura con un rapporto volume/volume due a uno. Quindi, centrifugare a 134 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e utilizzare un tubo asciutto per caricare 10 microlitri del supernatente negli strumenti UPLC. Separare gli n-glicani etichettati alla portata di 0,4 millilitri al minuto con un gradiente lineare dal 75% al 62% di acetonitrile per 25 minuti.Quindi, eseguire un'analisi eseguita dalla colonna glicopeptide della scala di calibrazione Dexteran su un UPLC a 60 gradi Celsius. Rileva fluorescenti n-glicane rispettivamente a X citando e lunghezze d'onda di emissione di 330 nanometri e 420 nanometri. Come mostrato in questa figura, i n-glicani IgG sono stati analizzati in 24 picchi di glicina IgG iniziali in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione.Le strutture n-glicane sono disponibili in 24 tipi attraverso il rilevamento della spettrometria di massa. Per valutare la ripetibilità e la stabilità del metodo, il campione standard è stato testato in parallelo sei volte. I picchi di glico con proporzioni relativamente piccole hanno mostrato elevati errori di misurazione superiori al 10% del coefficiente di variazione.Nel pezzo e importante per la formazione ad un stabilito di struttura IgG n-glica, specialmente per stabilire terminale Pertanto, invece di 3.3 IgG n-glicasi trovato in è fondamentale in questo l'importanza di IgG. I glicani sono noti per essere diversi. Con gli sviluppi della prototomica glica, combinati in glicani per esplorare le informazioni a questo tale che può essere utilizzato come potenziale per la diagnosi di oggi.Dopo questo sviluppo della tecnica, fornisce un nuovo modo di esplorare

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Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Distacco della retina Modello in Roditori da iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Misurazione della frequenza cardiaca in mouse da non invasiva ecocardiografia M-mode

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolamento di cellule umane endoteliali linfatico da Multi-parametro fluorescenza-attivato cell sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

VDJ-Seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate Immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale Evoluzione Modelli di linfoma B cellulare

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Exosomal Analisi miRNA in non a piccole cellule del cancro del polmone (NSCLC) dei pazienti plasma attraverso qPCR: Un fattibile Liquido biopsia Strumento

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

Applicazione della tecnologia microfluidica Biochip per rilevare siero allergene-specifiche dell'immunoglobulina E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Valutazione della tossicità dell'inalazione acuta delle particelle aerotrasportate esponendo cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquida

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Analisi dell'espettorato a qualità controllata mediante citometria a flusso

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...