Name: immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography at JoVE.com

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81673247 및 81872682)과 호주 - 중국 협력 보조금 (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020)의 보조금으로 지원되었습니다.

이 의정서에 포함된 모든 과목은 중국 베이징 의과대학의 윤리위원회의 승인을 받았습니다12. 서면 동의는 연구의 시작 부분에 각 과목에서 얻은.
1. IgG 격리
<ol><li>결합 완충제 (인산완충식염수, PBS): 1x PBS (pH = 7.4), 중화 버퍼 : 10x PBS (pH = 6.6-6.8), 용리액 : 0.1 M 포름산 (pH = 2.5), 용리액용 중화 액: 1 M 암모늄 중탄산염, 저장 버퍼 를 포함한 화학 물질을 준비하십...

<ol>
	<li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomics,+glycoproteomics+and+the+immune+system.">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).</li><li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics.">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li><li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Glycosylation+and+Inflammation.">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392 (2013).</li><li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases.">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65 (2018).</li><li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research.">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).</li><li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated,+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform.">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).</li><li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages.">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).</li><li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index.">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia.">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).</li><li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations.">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension:+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study.">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G.">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).</li><li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson's+disease.">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).</li><li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation.">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).</li><li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations.">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).</li><li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography.">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).</li><li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types.">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963 (2016).</li></ol>

UPLC는 상대정량분석방법5,15. 결과는 UPLC가 좋은 재현성과 상대적인 정량적 정확도를 갖춘 안정적인 검출 기술임을 나타냅니다. 각 피크의 글리칸 양은 상대값인 UPLC를 사용하여 총 통합 영역의 백분율로 표현됩니다. 상대 정량화는 시험 샘플의 비교 가능성을 향상시킵니다. 또한, 96웰 프로틴 G 플레이트는 높은 처리량 검출을 위해 한 번에 96개의 샘플로...

인간단백질의 N-글리코실화는 일반적이고 필수적인 번역 후 변형1이며 질병의 발생 및 발병을 비교적 정확하게 예측하는 데 도움이 될 수 있다. 그 구조의 복잡성으로 인해 5,000 개 이상의 글리칸 구조가 있을 것으로 예상되며, 질병에 대한 진단 및 예측 바이오 마커로서 큰 잠재력을 제공합니다2. 면역글로불린 G(IgG)에 부착된 N-글리칸들은 IgG의 기능에 필수적인 것으로 나타났으며, IgG N-glycosylation은 프로-및 항염증 시스템 사이의 균형에 참여한다3. 차동 IgG N-glycosylation은 질병 병리학에 관여하는 소인 및 기능적 메커니즘을 모두 나타내는 질병 발달 및 진행에 관여한다. IgG N-glycosylation의 염증성 역할은 노화, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 암4와관련이 있다. 
감지 기술의 개발과 함께, 형광 검출 (UPLC-FLR) 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피, 레이저 유도 형광을 이용한 멀티플렉스 모세관 겔 전기 영동등 은 높은 처리량 글리코믹에서 가장 널리 사용됩니다. esccence 검출 (xCGE-LIF), 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 질량 분광법 (MALDI-TOF-MS), 액체 크로마토그래피 전기 분무 질량 분석법 (LC-ESI-MS) . 이러한 방법은 낮은 유속, 불안정한 결과 및 불량 감도 특이성의 이전의단점을 극복했다5,6.
UPLC는 IgG N-glycosylation 및 특정 질병 사이의 연관성을 탐구하는 데 널리 사용됩니다 (즉, 노화7,비만8,이상지질혈증9,타입 II 당뇨병10,고혈압11,허혈성 뇌졸중12,파킨슨 병13). 위에서 언급한 다른 세 가지 방법에 비해 UPLC는다음과같은 장점을 가지고5,14. 첫째, 상대적 정량 분석 방법을 제공하고, 전체 면적 정규화를 수반하는 데이터 분석은 각 샘플의 비교성을 향상시킨다. 둘째, 장비 비용과 필요한 전문 지식이 상대적으로 적기 때문에 글리코실화 바이오마커를 임상 응용 분야로 쉽게 구현하고 변환할 수 있습니다. 여기에 제시된 UPLC에 대한 소개이므로 더 널리 사용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-aminobenzamide, 2-AB</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well collection plate</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filter plate</td>
			<td>Pol</td>
			<td>0.45 um GHP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well monolithic plate</td>
			<td>BIA Separations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate rotor</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant shaking incubator/rocker</td>
			<td>Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China</td>
			<td>ZWY-10313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>BEH column</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric ovens</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>202-2AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empower 3.0</td>
			<td>Waters technology Co., Ltd, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoProfile 2-AB Labeling kit</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature centrifuge</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature refrigerator</td>
			<td>Qingdao Haier Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold 96-well plate</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q pure water meter</td>
			<td>Millipore Co., Ltd, America</td>
			<td>Advantage A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH tester</td>
			<td>Sartorius Co., Ltd, Germany</td>
			<td>PB-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>4672100, 0.5-10&#956;l &#38; 10-100&#956;l &#38; 20-200&#956;l &#38; 1000&#956;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td>
			<td>Sigma, China</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td>
			<td>B-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer liquid gun</td>
			<td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td>
			<td>4672100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Amresco, America</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low temperature refrigerator</td>
			<td>Thermo Co., Ltd, America</td>
			<td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-performance liquid chromatography</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>Acquity MLtraPerformance LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Watts technology Co., Ltd, China</td>
			<td>725000604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volatilizing machine/Dryer</td>
			<td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td>
			<td>T_1087461900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>NP-30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-bath</td>
			<td>Tester instruments Co., Ltd</td>
			<td>DK-98-IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>MP200B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunoglobulin g n-glycan analysis by ultra-performance liquid chromatography

글리코믹스는 오믹스 시스템 연구의 새로운 특수 분야로, 질병 감수성, 약물 표적 발견 및 정밀 의학을 위한 차세대 바이오마커 를 발견하는 데 상당한 잠재력을 제공합니다. 대안 IgG N-glycans는 몇몇 일반적인 만성 질병에서 보고되고 임상 응용 (즉, 질병의 진단 및 예측을 위한 바이오마커)에 있는 중대한 잠재력을 가지고 제안되었습니다. IgG N-글리칸널리 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)의 방법을 사용하여 특징지어진다. UPLC는 재현성이 뛰어나고 상대적 정량이 높은 안정적인 검출 기술입니다. 또한, IgG N-glycan의 구조는 명확하게 분리되고, 혈장내의 글리칸 조성및 상대적 풍부도가 특징지어진다.

도 1에나타낸 바와 같이, IgG N-글리칸스는 피크 위치 및 유지 시간에 기초하여 24개의 초기 IgG 글리칸 피크(GPs)로 분석되었다. N-글리칸구조는 이전 연구(표1)15에따른 질량 분석 검출을 통해 사용할 수 있다. 결과를 비교하기 위해, 각 피크의 글리칸 양을 총 통합 영역의 백분율로 표현한 총 면적 정규화가 적...

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Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

면역글로불린 G(IgG) N-글리칸은 친수성 상호작용 UPLC를 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한, IgG N-글리칸의 구조는 명확하게 분리된다. 여기에 제시된 이 실험 방법에 대한 소개는 연구 환경에서 널리 사용될 수 있도록 한다.

초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 G N-글리칸 분석

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

초고성능 액체 크로마토그래피는 IgG n-글리칸의 정확한 분석을 위한 기술이 확립되어 있어 민감성이 높고 글리칸의 특정 정보를 제공할 수 있는 능력이 있어 사용하기 쉽고 상대적으로 낮은 증분, 높은 재현성, 높은 재현성 의 수의 이소마저에 대한 능력이 있다. 플라즈마에서 단백질의 측정은 매력적일 수 있습니다. 의학에서.또한 글리코제 염기 및 인구를 포함하는 이러한 및 생물학적 제제에서 IgG와 연관. 불순한 상태의 글리칸에서 IgG를 테스트하는 데 사용된다는 것을 알고 있습니다. 실제로, 그것은 단백질의 n-글리칸을 테스트할 수 있습니다.이는 2개의 순수한 상태의 교차 결합 단백질에서 필요하며, 실험 공정이 표준화되어야 하는 동안 OR 실험 공정이 비교적 간단하다단백질에 적용될 수 있다. 종단 간 실험 과정은 작동하는 데 3 일이 걸리며 실험 기술을 습득하기 위해 실험 단계를 암기해야합니다. 샘플을 준비하려면 냉동 플라즈마 샘플을 해동하십시오.그런 다음 원심 분리기는 80 배 G에서 10 분 동안. 단백질 G 모놀리식 플레이트를 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다. 2밀리리터 수집 플레이트의 각 우물에 100 마이크로미터의 샘플을 전달합니다.하나의 제어 샘플로 초순수수를 추가합니다. 1개의 X PBS로 샘플을 부피 비율로 1~7부씩 희석합니다. 0.45 마이크로론 수성 성수기 폴리프로폴렌 필터 플레이트를 200 마이크로리터의 초순수 수로 청소하십시오.청소를 두 번 더 반복합니다. 희석된 샘플을 필터 플레이트로 옮기고, 266.6 내지 399.9 파스칼의 압력을 가진 진공 펌프를 사용하여 샘플을 집단 판으로 필터링한다. 단백질 G 모놀리식 플레이트를 준비하려면 먼저 저장 버퍼를 폐기하십시오.초순수 수분 2밀리리터, X PBS 2개, 어금니 포름산 1밀리리터, 10X PBS 2개, X PBS 1개 밀리리터 2개 순차적으로 모놀리식 플레이트를 청소합니다. 진공 펌프를 사용하여 다음 액체를 제거합니다. 멀티채널 파이프를 사용하여 여과된 샘플을 IgG 결합 및 세척을 위한 단백질 G 모놀리식 플레이트로 전달합니다.그런 다음 한 개의 X PBS의 밀리리터 2개를 추가하여 모놀리식 플레이트를 청소합니다. 진공 펌프를 사용하여 PBS를 제거하고 청소를 두 번 더 반복합니다. 0.17 의 1 밀리리터의 0.17 어금니 포름산으로 일루트 IgG, 진공 펌프에 의해 수집 판으로 샘플을 필터링.그런 다음, 수집 판에 1개의 어금다 암모늄 중탄산염170마이크로리터를 추가합니다. 280 나노미터의 최적 파장에서 흡수 스펙로프토미터를 사용하여 IgG 농도를 감지합니다. 추출된 IgG를 오븐에 넣고 섭씨 60도에서 3시간 동안 건조시다.원고에 설명된 바와 같이 농도에 따라 관찰되는 양을 결정하고 영하 80도에서 보존한다. 말린 IgG를 수집하고 실온에서 1.33 % SDS, 4 % IgePal 및 5 %PBS를 포함한 화학 물질을 저장합니다. 250 마이크로리터의 초순수수로 250단위의 효소를 희석하여 인독리코시다아제 F 효소를 준비하십시오.IgG를 분해하려면 1.33%의 SDS의 마이크로리터 30기를 추가하고 소용돌이로 혼합합니다. 샘플을 섭씨 65도 오븐으로 10분간 옮김합니다. 그런 다음 오븐에서 꺼내 서 15 분 동안 식힙니다.동일한 샘플에 4%의 IgePal의 마이크로리터 10개를 추가하고 흔들리는 인큐베이터에 5분간 놓습니다. 5개의 X PBS와 30~35마이크로리터의 마이크로리터를 추가하여 0.1 의 어금니 나트륨 수산화나트륨을 추가하여 pH를 8.0으로 조절하고, 소용돌이에 섞는다. endoglycosidase F 효소의 4 개의 마이크로 리터를 추가하고, 소용돌이에 의해 혼합.그런 다음 섭씨 37도의 수조에서 18~20시간 동안 배양합니다. 다음 날, 방출 된 질칸을 오븐에 60섭씨 60도에 놓고 2 시간 반에서 3 시간 동안 건조하십시오. 추가 측정이 될 때까지 방출 글리칸을 영하 80도에서 절약하십시오.2개의 아미노 벤지미드 라벨링 시약은 DMSO 24.5 마이크로리터, 아세트산 10.5 마이크로리터, 아세트산 10.5마이크로리터, 2개의 아미노 벤지미드의 0.7 밀리그램, 그리고 시아노보로하이드라이드 나트륨 6밀리그램을 준비합니다. 다음으로, 어두운 방에서, 두 개의 아미노 벤지미드 라벨 시약의 35 마이크로 리터를 추가하여 글리칸을 라벨. 라벨이 부착된 글랜캔을 발진기로 5분간 옮은 다음, 섭씨 65도에서 3시간 동안 오븐으로 옮기습니다.그 후, 30 분 동안 실온으로 전송합니다. IgG n-glycase는 불순한 상태의 형광 검출에 의해 검출되기 위해 라벨을 붙일 것입니다. Pretreat는 70%에탄올20마이크로리터, 초순수 수분 200마이크로리터, 96%의 아세토 니트리어 200마이크로리터를 섭씨 4도에 장착한 0.2 마이크로론 GHP 필터 플레이트를 제공합니다.그런 다음 진공 펌프를 사용하여 폐기물을 제거합니다. 두 개의 아미노 벤지미드 라벨 글리칸을 정화하려면 100% 아세토닐릴의 700 마이크로리터를 샘플에 넣고 흔들리는 인큐베이터로 5분 간 옮김합니다. 섭씨 4도에서 5분간 134회 G의 원심분리기.수퍼네텐트를 0.2미크론 GHP 필터 플레이트로 2분간 전송하고 진공을 사용하여 여과물을 제거한다. 아미노 벤지미드 라벨이 부착된 글리칸 2개를 섭씨 4도에서 96%의 아세토닐트리어200마이크로리터로 세척하고 진공 펌프를 사용하여 5~6회 여과물을 제거합니다. 아미노 벤지미드 라벨 글리칸 2개에 100마이크로리터의 초순수수 3회.라벨이 붙은 두 개의 아미노 벤지미드 글리칸을 오븐에 넣고 섭씨 60도에서 3시간 반 동안 건조시다. 라벨이 부착된 n-글리칸을 추가 측정전까지 영하 80도에서 저장하십시오. 먼저 소프트웨어를 열어 모바일 단계를 제어합니다.UPLC 계측기를 50%의 용매 B와 50%의 용매 C로 분당 0.2 밀리리터의 유량으로 30분간 세척합니다. 그런 다음 분당 0.2 밀리리터의 유량으로 25%의 용매 A와 75%의 용매 B로 20분 간 세척합니다. 그런 다음 분당 0.4 밀리리터의 유량을 추가합니다.라벨이 부착된 n-글리칸을 100%의 아세토닐릴과 초순수수를 2대 1부피 비율로 혼합하여 25마이크로리터로 녹입니다. 그런 다음, 원심분리기는 섭씨 4도에서 5분 동안 134회 G로 원심분리기를 사용하고, 드라이 파이프를 사용하여 SUPERNATENT 의 10 마이크로리터를 UPLC 기기에 적재합니다. 라벨이 부착된 n-글리칸을 분당 0.4 밀리리터의 유량으로 분리하여 25분 동안 75%에서 62%의 아세토니틀을 선형 그라데이션으로 분리합니다.그런 다음 UPLC에서 덱스터란 교정 사다리 글리코펩티드 컬럼이 섭씨 60도에서 실행한 분석을 수행합니다. 각각 330나노미터 및 420나노미터의 X 인용 및 방출 파장에서 n-글리칸 형광을 검출한다. 본 그림과 같이, IgG n-글리칸은 피크 위치 및 보존 시간을 기준으로 24개의 초기 IgG 글리칸 피크로 분석되었다.n-글리칸 구조는 질량 분석 검출을 통해 24가지 유형으로 제공됩니다. 방법의 반복성 및 안정성을 asses하기 위해 표준 샘플을 6 번 병렬로 테스트했습니다. 상대적으로 작은 비율을 가진 글리칸 피크는 변동계수의 10% 이상의 높은 측정 오차를 보였다.이 조각에서 IgG n-글리칸 구조의 확립된 형성에 중요한 것은, 특히 말단을 확립하기 위해, 3.3 IgG n-glycase 대신에 IgG의 중요성이 중요하다. 글리칸에서 온 글리칸은 다른 것으로 알려져 있습니다. 글리칸 프로토믹의 발전과 함께 글리칸에 결합하여 오늘날의 진단의 잠재력으로 사용될 수 있도록 정보를 탐구합니다.이 기술 개발 후, 그것은 탐구하는 새로운 방법을 제공합니다

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